FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Gözat
Çıkarma tarihi ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeÇeşitli Karbonhidratların Mikrobiyal Yakıt Hücrelerinde Elektrik Üretimine Etkileri(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2008-11-19) Çatal, Tunç ; Bermek, Hakan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışmada, lignoselülozik biyokütlelerin asit hidrolizatlarında yaygın olarak bulunan monosakkaritlerden, disakkaritlerden, şeker alkollerinden direkt olarak elektrik üretimi, hava-katot mikrobiyal yakıt hücreleri kullanılarak araştırılmıştır. Başlıca on iki monosakkariti, iki disakkariti ve altı şeker alkollerini kapsayan karbon kaynakları ile elektrik üretimi gözlenmiştir. Sodyum asetat ile zenginleştirilmiş karışık bakteri kültürü, test edilen bütün substratlara kolayca adapte olmuştur. Yeni karbon kaynağına adaptasyon için gerekli süre substralar için farklılık göstermiştir. Test edilen substratlar için elde edilen en yüksek güç yoğunluğu 1262±5 mW m-2 ve 2763±38 mW m-2 arasında bulunmuştur. Kolombik yeterlik yüzde 10-34 idi. Test edilen substratlar için, en yüksek volt eldesi ve substrat konsantrasyonu arasında ilişki 120 ohm dış dirençte doygunluk kinetiği sonuçları ile uyumlu olduğu görülmüştür. Test edilen karbonhidratlar için yüzde 71’nin üzerinde kimyasal oksijen talebinde azalma sağlanmıştır. İki furan türevi ve sekiz fenolik bileşiğin araştırılması yapılmış, 2-furaldehit, asetofenon ve 3-4-dimetoksibenzil alkol’ün voltaj üretimi üzerine güçlü inhibitor etki gösterdiği saptanmıştır. Test edilen çam odun tozu hidrolizatının elektrik üretiminde karbon kaynağı olarak kullanılabileceği keşfedilmiştir. Monosakkarit karışımlarının mikrobiyal yakıt hücrelerinde tercihli kullanılarak elektrik üretimine yol açtığı ve karboksilik asit olarak yan ürünler oluşturulduğu saptanmıştır. Çalışmada ayrıca çeşitli operasyonel parametrelerin araştırılması yapılmıştır. Karbon kaynaklarının biofilm üzerinde mikrobiyal çeşitliliği önemli olarak etkilediği saptanmıştır. Çalışmada ayrıca, elektrik üretimi üzerine pH etkisi araştırılmış ve önemli bir faktör olduğu bulunmuştur. Bu çalışmanın sonuçları, lignoselülozik maddelerden türevli monosakkaritlerin, disakkaritlerin, şeker alkollerinin ve odun türevli maddelerin ön muamele ile mikrobiyal yakıt hücreleri için uygun birer karbon kaynağı olabileceklerini göstermiştir.
-
ÖgeBiyonanoteknoloji Uygulamaları İçin Genetik Mühendisliği İle Oluşturulan Anorganiklere Özgül Peptidlerin Kinetik Ve Termodinamik Analizleri(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2009-12-04) Şeker, Urartu Özgür Şafak ; Tamerler, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışma kapsamında genetik mühendisliği kullanılarak oluşturulmuş anorganiklere seçici olarak bağlanan peptidlerin (GEPI) kinetik ve termodinamik araçlarla moleküler tanıma özellikleri incelenmiştir. Faj gösterim ya da hücre yüzey gösterim teknikleri kullanılarak seçilen GEPI moleküllerinin karakterizasyonu yapılmıştır. GEPI’lerin moleküler karakterizasyonu, adsorpsiyon kinetikleri ve termodinamikleri, ikincil yapı çalışmaları ile bir bütünlük içerisinde gerçekleştirilmiştir. GEPI’lerin bağlanma kinetik ve termodinamikleri yüzey plazmon rezonans spektrometresi ve kuvartz kristal mikroterazi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Altın , silika ve platin yüzeylere bağlanan peptidlerin sadece afiniteleri değil, aynı zamanda malzeme seçicilikleri de incelenmiştir. Bir durum çalışması olarak, altın yüzeye bağlanan peptid için yapı-aktivite ilişkisi de, termodinamik bir bakış açısı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. GEPI’lerin, moleküler karakterizayonu takiben, moleküler bağlayıcı ve malzeme sentezleyicisi olarak kullanımları araştırılmıştır. Bu bağlamda, GEPI’ler, moleküler bağlayıcı olarak, alkali fosfataz enziminin altın, silika ve platin yüzeylerine immobilizasyonu ve yarı iletken nanotaneciklerin LED aygıtlarının yüzeylerine tutuklanması çalışmalarında, moleküler tutucu olarak ise, Huntington hastalık etmen proteininin fibrilasyonunun gerçek zamanlı olarak incelenmesinde kullanılmıştır. Ayrıca, morfoloji kontrollü silika sentezi için GEPI’lerin malzeme yapıcı olarak kullanımları gösterilmiştir. GEPI’lerin birçok değişik biyo-nano teknolojik uygulamalarda moleküler bağlayıcı olarak kullanımları, nano- biyo- arakesitindeki zorlukları aşabilmek için uygun moleküler araçlar olduğunu ortaya koyacak şekilde sunulmuştur.
-
ÖgeAnorganik Yapılara Bağlanan Peptitlerin Moleküler Araç Olarak Kullanılması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2010-04-21) Kaçar, Turgay ; Tamerler, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMoleküler biyobenzetim, doğada varolan, biyomoleküllerin anorganik yapılar ile olan moleküler seviyedeki ilişkilerinden esinlenerek ortaya çıkmıştır. İleri derecede gelişmiş özelliklere sahip hibrid malzemelerin üretilmesi için anorganik yapılara bağlanabilen peptitlerin de içinde bulunduğu yeni moleküler araçlar sunmaktadır. Bu peptitlerden yararlanılarak yapılacak malzemeler bioteknoloji, nanoteknoloji, ve mikro/nanoeletronik gibi birçok alanda kullanılabilir. Terminolojide genetik olarak modifiye edilmiş anorganik yapılara bağlanabilen peptitler (GEPI) olarak bilinen bu moleküler araçlar, faj- ve hücre- gösterimi gibi kombinatoriyel biyolojide kullanılan methodlarla elde edilirler. FM, SPR, QCM, ve AFM gibi teknikler ile karakterize edildikten sonra GEPI’ler; bu tezin içerdiği çalışmalarda moleküler ölçekte organize edici, bağlayıcı, sentezleyici olarak kullanılmış, bu sayede aynı amaçlar için klasik olarak kullanılan sentetik moleküllerin taşıdığı dezavantajlar ortadan kaldırılarak farklı uygulamalara hizmet edebilecek, fonksiyonel yeni platformlar hazırlanmıştır. İlk olarak, spesifik olarak yüzeyi tanıması ve protein mühendisliğindeki uygulanabilirliği baz alınarak, altına bağlanabilen peptitlerden biri olan GBP1’in, AP enzimine eklenmesi sonucu ortaya çıkan recombinant proteinin mikro desenli veya düz altın yüzeylere belli bir noktadan (site-specific) tutunması gösterilmiştir. Ayrıca, GEPI’lerin uCP ve DPN gibi desenleme teknikleri kullanılarak yüzeye mikro/nano boyutlarda desenleri oluşturulmak suretiyle protein ve nanoparçacık arrayleri hazırlanmasında bağlayıcı molekül olarak kullanılabilecekleri gösterilmiştir. İki farklı anorganik yapıya bağlanan aminoasit dizileri içeren iki fonksiyonlu peptitlerin (Bi-GEPIs) kullanılması ile nanoparçacıların yüzeye immobilize (“Self-assembly” yoluyla) olmaları sağlanmıştır. Altın ve gümüş nanoparçacıklarının cam yüzeyine; silika nanoparçacılarının da altın yüzeyine bu peptitler aracığı ile tutunabildikleri gösterilmiştir. Ayrıca, makro büyüklükte düz bir yüzey yerine nano boyutlardaki silika parçacıkları da uygun Bi-GEPI kullanılarak altın nanoparçacıları ile dekore edilmiştir. GEPI’lerin nanoparçacık ve de prob molekülünü organize etmesinden yararlanarak elde edilen platformların bir uygulaması olarak, hibrid optik sensörler hazırlanmış ve uygun hedef moleküllerin algılamasında kullanılmıştır. Bu uygulamaların bir tanesinde, cam üzerine Bi-GEPI kullanılarak immobilize edilen altın nanoparçacıklar ve onların üzerine bağlanan 5GBP1-AP prob molekülünden oluşan sensör, hedef molekülü olan Anti-AP deteksiyonunda ~30 nM’ye kadar inebilmiştir. Protein ve nanoparçacıkların immobilizasyonu ve mikro/nano boyutlardaki organizasyonlarının sağlanması dışında, GEPI’ler, optik olarak aktif, hibrid nanoyapıların olışturulmasında da kullanılmış; silika nanoparçacıklarının etrafının altın ile kaplanmasını sağlamıştır. Sonuç olarak elde edilen bu parçacıkların LSPR λmaks’sında görünür bölgeden IR bölgesine kayma gözlenmiştir ki bu bölgede biyolojik materyaller ışığı çok az absorbe etmektedirler. Genel olarak bakıldığında bu doktora çalışmasında elde edilen sonuçlar, açıkça GEPI’lerin yeni, fonksiyonel ve farklı ölçeklerde platformların ortam koşullarında hazırlanmasında kullanılabilecek kapasitede olduğunu ve daha sonra bu platformların da protein mikro/nanoarray sistemler, biyosensörler, moleküler görüntüleme ve hedefleme gibi amaçlar için kullanılabileceklerini göstermektedir.
-
ÖgeProtein Mühendisliği İle Candida Methylica Format Dehidrogenaz Enzimin Katlanma Mekanizmasının Aydınlatılması Ve Termostabilitesinin Arttırılması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2010-06-23) Ordu, Emel ; Karagüler, Nevin Gül ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsNAD+-bağımlı format dehidrogenaz (EC 1.2.1.2, FDH) metilotrofik mikroorganizmalarda metanol metabolizmasındaki son enzimdir ve formatın karbondioksite oksidasyonunu katalizlerken NAD+’yi NADH’e indirger. Endüstriyel açıdan en önemli rolü NAD+ ve format kullanarak NADH’i rejenere etmesidir. Birçok avantajına rağmen düşük termostabilitesi FDH enzimin en önemli dezavantajıdır. Bu tez çalışması başlıca üç kısma ayrılmaktadır. Öncelikle protein mühendisliği çalışmalarında oluşturulacak mutant enzimlerin kolay ve verimli saflaştırılabilmesi amacıyla Candida methylica mayasından klonlanmış olan NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cmFDH) enzimi için basit ve etkili bir protein saflaştırma metodu geliştirilmiştir. İkinci bölümde orjinal cmFDH enziminin katlanma mekanizması ve stabilitesi incelenmiştir. Protein dissosiayon sabitinin 10-13 M olarak hesaplandığı denge denaturasyon deneyleri cmFDH’in iki yapılı tek adım geçiş modeline göre katlanmamış hale geçtiğini göstermiştir. Kinetik deneyler sonucunda katlanma işleminin iki adımda gerçekleştiği gözlenmiştir. Fizyolojik koşullarda dimerik yapının dissosiasyon sabiti oldukça yavaştır (3x10-7 s-1). Son olarak, termostabiliteyi arttırmak amacıyla Pseudomonas sp. 101 ve Candida boidinii FDH’lerinin kristal yapıları temel alınarak hazırlanan cmFDH homolji modeli kullanılarak orjinal enzim üzerine protein mühendisliği stratejileri uygulanmıştır. Termodinamik ve kinetik sonuçlar dört mutasyonun, N187E, Q105R and N147R, M1C, orjinal cmFDH enziminin katlanma biçimini değiştirmeden stabiliteyi arttırdığını ortaya koymaktadır.
-
ÖgePycnoporus Sanguıneus’tan Lakkaz Cdna’larının Klonlanması, Pıchıa Pastorıs’te Ekspresyonu Ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011-01-18) Gür, Günseli Kurt ; Karataş, Ayten Yazgan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsLakkazlar aromatik bileşiklerin oksidasyonunu, oksijenin suya indirgenmesiyle katalizleyen çoklu bakır oksidazlardır. Geniş uygulama alanları sayesinde doğa dostu bu enzimlere olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Beyaz çürükçül küf mantarı Pycnoporus sanguineus MUCL 38531’te lakkaz kodlayıcı lcc1 ve lcc2 genlerinin izolasyonu ve bu genlerin heterolog ekspresyonları ile karakterizasyonu ilk kez bu çalışma ile bildirilmektedir. Pycnoporus sanguineus genomunun taranması sonucunda iki farklı lakkaz kodlayıcı genin varlığı belirlenmiş ve bu genler lcc1 ve lcc2 olarak adlandırılmıştır. İzole edilen tam boyda lakkaz cDNA’ları maya mekik ekspresyon vektörü pPICZB’ye kendi sekresyon sinyal dizileri ile klonlanmış ve metilotrofik maya Pichia pastoris’te eksprese edilmiştir. Besiyeri, metanol ve bakır konsantrasyonlarının ekspresyon düzeyi üzerindeki etkisi belirlendikten sonra lakkazlar amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değiştirme ve jel filtrasyon kromatografisi teknikleriyle saflaştırılmıştır. Saflaştırılan proteinlerin ağırlıkları R-LCC1 ve R-LCC2 için sırasıyla 56 kDa ve 62 kDa olarak bulunmuş ve bu enzimler 600 nm’de lakkazlara özgü absorbansı vermedikleri için sarı lakkazlar olarak tanımlanmıştır. Aktivite üzerinde substrat etkisi incelendiğinde maksimum aktivitenin ABTS için izlendiği ve bu substrat kullanıldığında optimum pH 3.0 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklıklar R-LCC1 ve R-LCC2 için sırasıyla 60ºC ve 30ºC olarak belirlenmiş olup, LCC1’in termal stabilitesinin 30ºC’de daha iyi olduğu ve yarılanma ömrünün de 7 saatten fazla olduğu saptanmıştır. Saflaştırılan enzimler üzerinde sodyum azid, L-sistein ve SDS’nin inhibe edici etkisi olduğu görülmüş olup, enzimlerin katalitik özellikleri de hem ABTS hem de DMP substratları kullanılarak tespit edilmiştir.
-
ÖgeGfp Bazlı Tasarım Proteinlerinin Oluşturulması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011-03-24) Yüca, Esra ; Tamerler, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsSon yıllarda, yalnızca sert doku mühendisliğinde değil, aynı zamanda ileri malzeme ve sistemlerin üretiminde, anorganiklerin biyolojik yolla biyobenzetimsel sentez ve oluşumu oldukça ilgi çekmektedir. Bu çalışmada, genetik mühendisliği ile iyileştirilmiş proteinler kullanılarak malzemenin etiketlenmesi ve montaj için biyolojik yollara yönelmeye odaklandık. Anorganik malzemeyi özgül olarak hedefleyen ve biyolojik fonksiyonlarını sürdürmeye devam eden multifonksiyonel proteinler tasarladık. Burada, genetik mühendisliği uygulanmış yeşil floresan proteinlerinin tasarlanmasıyla, kalsiyum fosfat mineral ve metal yüzey/nanopartikül etkileşimlerine dayalı iki farklı durum çalışması seçtik. Kalsiyum fosfat bazlı biyomineralizasyon, kemik ve diş sert dokularının oluşumundaki anahtar rolü nedeniyle yaygın olarak çalışılmıştır. Bu nedenle, kalsiyum fosfat minerallerini hedefleyen ve biyomineralizasyonun görüntülenmesini mümkün kılan protein bazlı bir sistemi yani GFPuv-HABP’yi tasarladık. Çift fonksiyonlu proteinlerin floresan ve bağlanma aktiviteleri, sırasıyla floresan mikroskopi ve spektroskopi ile kuartz kristal mikrobalans sistemi kullanılarak karakterize edilmiştir. Biyoteknolojide, bölgeye özgül protein immobilizasyonu protein çipleri, biyosensörler ve mikroarrayler gibi etkin araçların üretiminde gereklidir. Geleneksel immobilizasyon yaklaşımları, proteinin fonsiyonel gurupları ile yüzey arasındaki etkileşimleri izleyen kontolsüz toplanma sebebiyle protein aktivitesinde düşüşe neden olabilir. Burada, anorganiklere bağlanan peptidlerin, fonksiyonel protein GFPuv’nin düz yüzey ya da nanopartikül şeklinde farklı formlardaki gümüş ve altın substrata immobilizasyonunda kullanılmasında, peptit bazlı montajından faydalanılmıştır. Bifonksiyonel proteinlerin nanopartiküllere bağlanması ve floresan sönüm/artma etkinliği arasındaki korelasyon değerlendirilmiştir.
-
ÖgeYönlendirilmiş Evrim Yöntemiyle Saccharomyces Cerevısıae’nın Endüstriyel Açıdan Önemli Özelliklerinin Geliştirilmesı(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011-04-07) Sezgin, Tuğba ; Çakar, Zeynep Petek ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsGenel olarak ekmek üretimi, bira üretimi ve fermentasyon gibi pek çok biyoteknolojik süreçte, maya hücreleri çok çeşitli stres koşullarına maruz kalmaktadır. Binlerce yıllık biyoteknolojik kullanım Saccharomyces cerevisiae mayasını evcilleştirerek çok çeşitli uygulamalar için farklı suşlarının gelişmesine yol açmıştır. Bununla birlikte çeşitli stres koşullarına dayanıklı maya suşlarının elde edilmesi halen endüstriyel uygulamaların en önemli gereksinimlerinden biridir. Stres adaptasyon mekanizmalarının ökaryotlar arasında genellikle benzer olması sebebiyle, bir model organizma olan Saccharomyces cerevisiae’nın stres tepki mekanizmaları önemli ölçüde ilgi çekmektedir. Diğer yandan, çeşitli streslere dayanıklı fenotipler klasik metabolik mühendislik stratejileri ile elde edilmesi kolay olmayan çok faktörlü genetik farklılaşmalara sahiptir. Bu nedenle, rastgele mutasyon ve seleksiyona dayalı deneysel prosedürler, stres koşullarına dayanıklılığın optimize edilmesi açısından yararlı yaklaşımlardır. Bu çalışmada ozmotik, tuz ve asit streslerine dayanıklı maya hücreleri elde etmek amacıyla, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik stratejisi uygulanmıştır. Bu amaçla, S. cerevisiae başlangıç populasyonunun genetik çeşitliliği, etil metan sülfonata maruz bırakılarak arttırılmıştır. Bu mutant popülasyona, stres düzeyi sürekli ve kademeli olarak arttırılarak kesikli seleksiyon stratejisi olarak uygulanmıştır. Ozmotik, tuz ve asit stres seleksiyonlarının, uygulanan en yüksek stres koşulunda hayatta kalabilen son populasyonlarından rastgele bireyler seçilmiştir. En muhtemel sayı (MPN) ve seri seyreltme yöntemleriyle tuza ve sorbitole dirençli bireylerin, hem seçildikleri stres koşuluna hem de olası çapraz dirençleri belirlemek için endüstriyel açıdan önemli diğer stres türlerine dirençleri incelenmiştir. Bu streslere, oksidatif, etanol, donma-erime,ısı ve bazı ağır metal stresleri dahildir. Ayrıca oksidatif stres ve kontrol koşullarında mutantların katalaz aktiviteleri incelenmiştir. Tuz stresine en dirençli bireylerden biri olarak seçilen ‘T8’ mutantının tetrat analizi sonucu strese direncini sağlayan mutasyonun tek bir resesif gen mutasyonundan kaynaklandığı belirlenmiştir. Son olarak T8 mutantının, stres koşullarında belirli genlerinin ekspresyon düzeyleri kantitatif olarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile incelenerek yaban türün ekspresyon düzeyleri ile karşılaştırılmıştır. İlginç olarak, stres direnci ile ilgili olduğu beklenen belirli genlerin ekspresyon düzeylerinin, mutantta stressiz koşullarda bile yaban türe kıyasla yüksek olduğu gözlenmiştir. Transkriptomik analizleri içerecek yeni deneysel çalışmalar, karmaşık direnç mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olabilecektir.
-
ÖgeNano-Biotechbological application of inorganic binding proteins(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) Çetinel, Sibel ; Tamerler, Candan ; 332967 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and BiotechnologyBir çok organizma protein anorganik etkileşimlerinden meydana gelen organik-anorganik hibrid sistemler içerir. Bu hibrid sistemlerin koruyucu tabakalar vedestekleyici dokular oluşturmak, yük ve iyon transferi yapmak, bazı optik vemekanik özellikler geliştirmek gibi mükemmel fonksiyonları mevcuttur.Çeşitlendirilmiş fonksiyonlara sahip bu sistemler, biyoteknoloji ve nano-biyoteknoloji alanında kullanılabilecek yeni sistemlerin tasarımında örnek teşkil eder(biyobenzetim). Anorganik yüzeyleri tanıma ve kuvvvetli bir şekilde tutunmaözelliğine sahip olan peptitlerin (GEPI) kullanılmasını esas alan bir yaklaşım ilenanoparçacık ve biyomoleküllerin istenen anorganik yüzeye immobilize edilmesi yada yeni özellikte nanoyapıların sentezlenmesi mümkündür.Biyomoleküllerin anorganik yüzeylere immobilizasyonları aktivite ve stabilite artışısağlaması amacıyla önemlidir. Kimyasal immobilizasyon yöntemleri ile elde edilensistemler biyomolekülün aktivitesinde azalmaya ya da kayba neden olabilmektedir.Bu nedenle GEPI'ler aracılığı ile immobilizasyon denenmiş ve başarılı örnekler eldeedilmiştir. GEPI aracalıklı immobilzasyonda peptidler, biyolojik molekülle birlikteüretilerek çift foksiyonlu bir molekül elde edilir. Molekül peptidden gelen yüzeytanıma özelliği ile matrikse tutunurken, biyomolekülü oluşturan bölge istenenbiyolojik fonksiyonu göstermeye devam eder. Bu tür bir tutuklanma sistemindeprotein yapısının kimyasal reaksiyonlarla bozunması ya da yüzeye kontrolsüz olarakbağlanması engellenmiş olur. Bu çalışmada altın yüzeye özgün bağlanan iki farklıpeptid sırasıyla Huntingtin proteinini ve Lactate dehidrogenaz enziminin altınyüzeylere tutuklamak amacıyla kullanılmıştır.Çalışmanın ilk kısmında altın yüzeye özgün bağlanan GBP1 peptidi, Huntingtinproteininin N-terminal ucuna eklenerek proteinin altın sensör yüzeyine bağlanmasınaaracılık etmek amacıyla kullanılmıştır. Huntingtin proteini mutant formundaHuntington hastalığına neden olan ökaryotik bir proteindir. Proteinin mutant formuN-terminal bölgesindeki glutamin tekrarlarının sayısında artış meydana gelmişhalidir. Normal protein 35 ve daha az glutamin tekrarı içerirken, mutant proteinde busayı 110 a kadar ulaşabilmektedir. Glutamin tekrarlarındaki artış miktarı hastalığınseyri ile doğru orantılı bulunmuştur. Hastalığın en belirgin hücre patalojisisitoplazma ve nukleusda inklüzyon cisimciklerinin gözlenmesidir. ?nklüzyoncisimcikleri mutant proteinin agregatlar oluşturması sonucu meydana gelir. Bir gruparaştırmacı hastalık patalojisinde etkin mekanizmanın protein agregasyonu sonucuolaşan fibril yapıların varlığı olduğunu düşünmektedir. Ancak fibril yapılarınsayısında azalma olmaksızın hastalık patalojisinin engellenebildiği durumlarınvarlığı, bazı araştırmacıların fibrilasyonun aslında hücrenin korunma mekanizmasıolduğunu düşünmelerine yol açmıştır. Hastalık oluşumunun daha iyi anlaşılabilmesive etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için Huntingtin fibrillasyon mekanizması çalışılmaktadır. Ancak şu ana kadar farklı fibrillasyon basamaklarında meydanagelen agregasyon kinetiği nicel olarak araştırılmamıştır. Biz yüzey plazmon resonanspektroskopisini kullanarak (SPR) Htt fibrilasyon kinetiğini incelemeyi hedefledik.Yüzey plasmon rezonans spektroskopisi çalışmalarında proteinlerin altın sensoryüzeyine immobıilize edilmeleri gerekmektedir. Altın yüzeyine proteinimmobilizasyonunu gerçekleştirmek için GBP1 kullanılmıştır. GBP1-Htt füzyonproteinleri hem fibril hem de proto-fibril formlarda SPR yüzeyine tutuklanmışlardır.Ardından monomer haldeki Htt proteinleri yüzeye tutuklanmış fibril yapılarınüzerine gönderilerek bağlanma kinetikleri incelenmiştir. Kontrol olarak Htt fibril veproto-fibril yapıları altın yüzeyine kovalent immobilizasyonla tutuklanarak dadeneyler tekrar edilmiştir. Kontrol çalışmaları GBP1 aracılıklı immobilziasyon ile enaz kovalent tutuklanma kadar etkin bir immobilizasyon gerçekleştirildiğinigöstermiştir. Ayrıca fibril ve proto-fibril uzamasının kinetiğinin incelenmesineolanak sağlamıştır.Elde edilen veriler, fibril uzaması için iki basamaklı bir fibrillasyon modeliönerilmesine sebep olmuştur. Model, ilk basamakta monomerin fibril ucunaeklenmesini, ikinci basamakta ise konformasyonel değişimini içermektedir. Bukonformasyonel değişim sonucu monomer artık fibrilin bir parçası haline gelmiş veyeni eklenecek olan monomer proteinlerle etkileşmeye hazır hale gelmiştir. Proto-fibril uzamasında ise tek basamaklı bir fibrilasyon kinetiği modeliönerilebilmektedir. Bu modele göre monomer proto-fibril ucuna eklenmiş veuzamaya neden olmuştur. Fibril ve proto-fibril uzamaları için elde edilen dengesabitleri, fibrilasyonun başlangıç aşamalarında daha yavaş olduğunu göstermiştir. Buveri nükleasyona dayalı polimerizasyon olarak değerlendirilen Huntingtin fibriluzamasını destekler niteliktedir. Bu modelde fibrilasyonun başlaması için önceliklebir nukleus oluşumu gerekliliği ve bu basamağın da hız kısıtlayıcı basamak olduğudüşünülmektedir. Proto-firbil uzamasının da bu nedenle fibril uzamasından dahayavaş olması anlamlı bulunmuştur. Çünkü proto-fibriller aslında nukleus dan dahabüyük ancak henüz fibril büyüklüğüne ulaşmamış ara yapılardır. Elde edilenfibrilasyon kinetiği verileri ile hastalık tedavisi için geliştirlen olası ilaçprokürsörlerinin agregasyona etkileri araştırılabilir. Ayrıca GBP1 aracıklıimmobilizasyon diğer agregasyon profili gösteren proteinlerin kinetiklerininincelenmesinde de kullanılabilir bir yöntem olarak sunulabilir. Bu sayede Huntingtonbenzeri nörodejeneratif hastalıkların da araştırılması mümkün görülmektedir.Çalışmanın ikinci kısmında diğer bir altına özgün bağlanan peptid olan AuBP2(WALRRSIRRQSY), LDH enziminin N-terminaline eklenmiş ve enzimin altınyüzeyine immobilizasyonunda kullanılmıştır. Laktat dehidrogenaz enzimi birçokorganizma tarafından üretilmektedir. Ancak bu çalışmada aktitesi ve üç boyutluyapısı aydınlatılmış olanı termostabil organizmalardan Bacillus stearothermophilustarafından üretilen enzim (bsLDH) kullanılmıştır. bsLDH NADH/NAD+ kofaktörçiftini kullanarak pürivat (oxo asid) ve laktat (hydroksi asid)'ın dönüşümünükatalizlemektedirler. Reaksiyon ürünleri yarı-sentetik penisilin ve antihipertensiflergibi farmasötiklerin yapımı ve fenilketonürinin tıbbi tanısında kullanılmaktadırlar.Ayrıca diyagnostik alanında lactat miktarının tayininde yararlanılan bir enzimdir.Son zamanlarda ise nano boyutlu bio-enerji sistemlerinin geliştirilmesinde bir redoksenzimi olan LDH'in direk elektron transferini sağlama özelliğinden yararlanılmasıüzerine çalışılmaktadır. Hem biyosensör hem de biyo-enerji sistemlerinde LDH'denyararlanabilmek için uygun bir matrikse immobilize edilmesine ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kimyasal tutuklama yöntemlerine alternatif olarak LDHimmobilizasyonunu AuBP2 peptidi aracılığı ile gerçekleştirilmiştir. AuBP2 peptiddizisi, rekombinant DNA teknoloji kullanılarak LDH proteinin N-terminal ucunaeklenmiştir. Oluşturulan füzyon proteinin LDH aktivesi göstermeye devam edipetmediği enzim aktivite tahlilleri ile test edilmiştir. Sonuçlar AuBP2 eklenmesininLDH aktivitesinde ciddi bir azalmaya sebep olmadığını göstermiştir. Ardından yüzeyplazmon resonans spektorskopisi kullanılarak füzyon proteinin altın yüzeyebağlanma ilgisi araştırılmıştır. SPR sonuçları AuBP2 varlığında enzimin altın yüzeyeilgisinin on kat kadar arttırıldığını ve yüzeye tutuklandıktan sonrauzaklaştırılmadığını göstermiştir. Bu çalışmalar ile AuBP2-LDH füzyon proteininhem altın yüzeye bağlanabildiği hem de LDH aktivitesi göstermeye devam ettiğibulunmuştur.Füzyon proteinin immobilize halde iken ne kadar aktif olduğu da enzimler altın nanoparçacıklara tutuklanarak incelenmiştir. Enzimlerin immobilizasyon sonrası serbestenzime kıyasla %80 civarında aktivite gösterdikleri bulunmuştur. Enzimimmobilizasyonlarında %50 üzerinde immobilize aktivite elde etmenin iyi bir veriolduğu düşünüldüğünde AuBP2 ile immobilizasyonun etkinliği görülmektedir.Ayrıca immobilize enzimlerin 30 güne kadar aktivitelerini korudukları da izlenmiştir.Serbest enzimler ise 30 gün sonunda immobilize enzime kıyasla daha fazla aktivitekaybına uğradıkları gözlenmiştir.Son olarak, LDH enziminin redoks raksiyonunu incelemek amacıyla siklikvoltametri çalışması yapılmıştır. Bu çalışmada AuBP2-LDH altın elektrod yüzeyineimmobilize edilmiştir. Sisteme substrate olarak laktat ve kofaktor olarak NADbeslenmiştir. Elektrod yüzeyine potansiyel farkı uygularak, redüklenme veoksitlenme reaksiyonları izlenmiştir. Siklik voltametre analizlerinde enzimin NADredüksiyonu gözlenmiştir. Bu gözlem, hem biyosensör hem de biyo-enerjisistemlerinde elde edilen redüklenme miktarından daha yüksek bulunmuştur. Busonuç, AuBP2 gibi çok küçük bir molekül ile yüzeye tutturulan enzimin, elektrodayakınlığı sonucunda elektrod ile enzim arasındaki elektron transferine olanaksağlandığını düşündürmüştür.Tez çalışması genel olarak incelendiğinde altına özgün bağlanan peptidlerin hemprotein hem de enzim immobilzasyonunda etkin olarak kullanılabileceğigörülmüştür. GEPI aracılıklı immobilizasyon ile huntington hastalığı gibi proteinagregasyonuna dayalı diğer nörodejeneratif hastalıkların da çalışılması mümkündür.Ayrıca sensör yüzeyine yaklaştırılmak istenen enzimlerin GEPI aracılıklıimmobilizasyon ile yüzeye tutuklanmaları olanağı vardır.
-
ÖgeGenome-wide analysis of Yvfi gene in bacillus subtilis(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) İrigül sönmez, Öykü ; Yazgan Karataş, Ayten ; 315332 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve BiyoteknolojiTranskripsiyonel düzenleyici proteinleriden GntR ailesi yaygın olarak kanatlı sarmal-dönüş-sarmal motifi ile karakterize edilmişlerdir. GntR ailesine mensup, FadR alt grubunun üyesi olan proteinler aminoasit metabolizmasının regülasyonuyla ve aspartat, pirüvat, glikolat gibi metabolik yol izleriyle ilişkilidir. Bu çalışmanın da hedef aldığı, basilisin üretiminde gerekli olduğu da ortaya konmuş olan B. subtilis yvfI geninin GntR ailesi transkripsiyonel düzenleyici proteinleriyle benzerlik gösterdiği bilinmektedir. Bu sunulan çalışmada, YvfI transkripsiyonel faktörü tarafından etkilenmesi mümkün genleri tanımlayabilmek için YvfI kodlayamayan TEK1 mutantı ve kontrol suşu PY79 arasında, logaritmik faz sırasında ve durağan fazda detaylı karşılaştırmalı transkriptom analizi gerçekleştirilmiştir. Büyümenin durağan evresinde YvfI proteini tarafından düzenlenmiş bir çok yolizi tanımlanmasının keşfi sağlanmıştır. Ek olarak, logaritmik fazda YvfI proteinin birçok önemli metabolik prosesde görevli genleri düzenlemede rol aldığı gösterilmiştir. Bunların yanı sıra, karşılaştırmalı transkriptom çalışmaları IPTG ile indüklenen B. subtilis PY79 amyE::Pspac::yvfI, yvfI::Tn10 mutant suşu ve aynı suşun indüklenmeyen hali arasında yürütülmüştür. Bu çalışma YvfI'nın olağandan fazla düzeyde ifade edilmiş olmasının farklı elementlerin ve metabolizmaların uyarılmasına ya da baskılanmasına sebebiyet verdiği ortaya konmuştur. Ayrıca, bu araştırma 5'-RACE-PCR analizi ile yvfI geninin promotör bölgesinin tanımlanması ve yerinin saptanmasını amaçlanmaştır. Sonuç olarak yvfI transkripsiyonunun ? A-tipi promotör tarafından kontrol edildiği, yvfI gen dizisi ve promotör bölgesi üzerinde global düzenleyici proteinlerin bağlanma motifleri olduğu gösterilerek, bu genin quorum-sensing yol izi üzerinden düzenlendiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, YvfI'nın muhtelif düzenleyici davranışları YvfI'nın, bir çok değişik tipte regulona baskı ve indüksiyon uygulayarak düzenleyici aktivite gösteren GntR ailesine ait olduğu önerisi ile uyum göstermektedir.
-
ÖgeEvolutionary engineering and molecular characterization of ethanol-resistant Saccharomyces cerevisiae(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) Turanlı Yıldız, Burcu ; Çakar, Z. Petek ; 323823 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and BiotechnologySaccharomyces cerevisiae'de etanol direnci, etanol üretimini etkileyen en önemli faktörlerden biri olduğu için, endüstriyel etanol üretim biyoprosesleri konusunda çalışan pek çok araştırma grubu için önemli bir konudur. Etanol direncinin moleküler mekanizması karmaşık olduğundan, bir veya birkaç gen üzerinde yapılacak değişikliklere dayalı rasyonel metabolizma mühendisliği yaklaşımı ile bu mekanizmanın aydınlatılması mümkün görünmemektedir. Bu çalışmada, etanole dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edilmesi ve karakterizasyonu için, bir tersine metabolizma mühendisliği stratejisi olan evrimsel mühendislik yöntemi benimsenmiştir. Yüksek etanol direncine sahip mutant bireyler, dereceli olarak artan etanol stres koşulları altında elde edilmiştir. Sonuçlar, benimsenen stratejinin istenilen özellikte kültürler elde etmede oldukça etkili bir yöntem olduğunu göstermiştir. Elde edilen dirençli mayaların karakterizasyonu da gerçekleştirilmiştir. Etanol stresi altında etanole dirençli mayalarda eşey tipi dönüşümü ve buna bağlı diploitleşmenin meydana gelişi, endüstriyel maya suşlarında olduğu gibi, etanole dirençli laboratuvar suşlarında da birden fazla kromozom kopyası bulundurma (multi-ploidy) eğilimini ortaya koymuştur. Bu çalışma, dereceli olarak artan etanol stresi koşullarına cevaben, S. cerevisiae hücrelerinde eşey tipi dönüşümünün tetiklendiğini ortaya koyan öncü bir çalışmadır.
-
ÖgeMalzeme Ve Medikal Uygulamalar İçin Gen Mühendisliği Yoluyla Peptid (gepı)-protein Hibritlerin Oluşturulması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-03-26) Şahin, Deniz ; Tamerler, Candan ; 426838 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsDoğada, milyonlarca yıl süren evrimsel süreçler sonucunda, lipidler, polisakkaritler ya da proteinler gibi biyomakromoleküller yüksek seviyede sofistike olmuş sistemlerin oluşmasını sağlamıştır. Oluşan bu sistemlerle canlılar, zorlu çevre şartlarına daha iyi uyum sağlamanın yollarını keşfetmişlerdir. Bu biyomakromoleküller arasında proteinler özel bir öneme sahiptir. Proteinler diğer makromoleküller ve inorganikler ile tepkimeye girerek tüm sert ve yumuşak dokuların yapısında bulunurlar ve tüm fonksiyonların çalışmasında etkili olurlar. Kemikler, dişler, deniz kabukları ve iskeletler, proteinlerin diğer organik ve inorganik moleküllerle birlikte çalıştıkları örneklerdir. Bu yapılarda yer alan proteinler sadece organik moleküllerle değil, aynı zamanda inorganik moleküllerle de bağ yaparak değişik fonksiyonel özelliklerin kazanılmasını sağlarlar. Örneğin, magnetotaktik bakteride (Aquaspirillum magnetotacticum) hücre içerisinde inorganik nanoyapılar bakterinin yerçekimi yardımı ile hareketini sağlar. Diğer bir örnek olan S-layer bakterisi (Synechococcus strain GL24) yüzeyinde oluşan kalsit tabaka koruyucu bir yapıdadır. Benzer şekilde fare dişindeki enamel, hidroksiapatit kristallerinden oluşan ve dişe hem esneklik hem dayanıklık sağlayan bir yapıdır. Bu örneklerde görülen, nano boyuttan makroya, yüksek derecede organize olmuş yapılar hiyerarşik bir şekilde oluşmuşlar ve inorganik moleküller ile organik moleküller birlikte rol almışlardır. Evrimsel süreçler sonucunda elde edilen bu fonksiyonlar ile canlılar çevresel şartlar karşısında avantaj elde etmişlerdir. Diğer yandan, doğada gözlemlenen bu tür fonksiyonel yapıların endüstride ve teknolojide yeniden yapılması son derece zorlu bir süreçtir. Bu yapılar detaylı incelendiğinde, proteinlerin düzenleyici, kontrol eden, bir araya getiren özellikleriyle bu yapıların oluşmasının temelinde olduğunu görüyoruz. O halde bu tür fonksiyonel özellikleri elde edebilmemiz için, inorganiklere seçici olarak bağlanabilen proteinleri kullanabiliriz. Moleküler Biyomimetik doğada moleküler seviyede gerçekleşen süreçleri izleyerek, benzer sistemleri oluşturmayı ve fonksiyonel sistemler kurmayı amaçlar. Canlıların milyonlarca yıl süren evrimsel süreçlerle elde ettikleri yararlı fonksiyonların gözlenmesi ile benzer fonksiyonel sistemler laboratuvar ortamında elde edilebilir. Moleküler Biyomimetik’in temelini de inorganiklere spesifik olarak bağlanabilen peptidlerin bulunması ve uygulamalarda kullanılması yatar. İnorganiklere spesifik olarak bağlanabilen peptidlerin bulunması için aşamalı bir yol izlenmesi genel kabul görmektedir. Öncelikle, kombinatoryel biyolojik teknikler (faj gösterim, hücre yüzey gösterim metodları vb.) yoluyla istenilen inorganik malzemeye spesifik peptidler bulunur ve bağlanma dereceleri sınıflandırılarak optimize edilir. Devamında ise, deneysel verilerden elde edilen bilgiler ışığında, biyoinformatik yöntemler ve benzerlik analizleri yoluyla daha iyi bağlanabilen peptidler elde edilir ve bu peptidler de test edilerek bağlanabilirliği kontrol edilir. Bu çalışmada kullanılan QBP1 peptidi 12 amino asit uzunluğunda ve kuartza bağlanabildiği deneysel çalışmayla gösterilmiş dizilerin biyoinformatik işlemden geçirilmesi sonucunda ortaya çıkarılmıştır. QBP (Quartz binding peptid), kuartza seçici olarak ve yüksek afinitede bağlanabilen 12 amino asit uzunluğunda bir peptidtir. Kuartz yüzeyine bağlanabilme özelliği sayesinde, istenilen bir protein QBP1 yoluyla kuartz yüzeyinde sabitlenebilir. Ancak bunun için ilk yapılması gereken, DNA seviyesinde QBP1 peptidinin dizisini iatenilen proteinin DNA dizisine eklemektir. Burada QBP1 peptidini AP (alkalin fosfataz) enziminin N-terminal ucuna eklendi. Protein üretilmesi aşamasında ise, bakteri hücresi kullanıldı ve sonuçlar optimize edilmeye çalışıldı. Burada amaçlanan, QBP1 yoluyla istenilen bir proteinin kuartz yüzeyine bağlanabileceğini ve uygulamalar açısından kullanışlı olacağını göstermektir. Ancak dikkat edilmesi gereken en önemli konuların başında, bakteri hücresinde protein üretimi sırasında meydana gelebilecek sıkıntılardır. Projemizde 2. jenerasyon GEPI’ler (Kuartza bağlanabilen peptidler, QBP-1) kullanıldı. Bu peptidler grubumuzda daha önceden faj gösterim metodu ile elde edilen 1. jenerasyon QBP’lerin biyoinformatik yöntemlerle işlenmesi sonucu elde edildi (1). Kuartz yüzey üzerine seçici olarak bağlanmada diğer QBP’ler arasından öne çıkan QBP-1 bu çalışma için seçildi. QBP-1 ile herhangi bir fonksiyonel molekül DNA seviyesinde biraraya getirilerek hibrid moleküller oluşturulabilir ve QBP-1’in kuartz yüzeyine seçici olarak bağlanabilme özelliğinden yararlanılarak istenilen molekülün fonksiyonel özellikleri kullanılabilir. Lakkazlar (EC 1.10.3.2) ligninolitik enzimler olarak molekül başına iki ya da dört bakır atomu tasıyan ve fenolik maddeleri moleküler oksijeni suya indirgeyerek okside edebilme özelligi olan ekstraselüler fenoloksidazlardır. Kagıt ve tekstil sanayiinden gelen endüstriyel atıkların detoksifikasyonu gibi çesitli biyoteknolojik süreçlerde çok önemli uygulamaları bulunan enzimler olup, herbisit ve pestisitlerin temizlenmesi, belli su saflastırma sistemleri için temizleme ajanları ve kozmetik malzemesi olarak da kullanılabilmektedir (2,3,4). Grubumuzda Pycnoporus sanguineus suşundan elde edilen lakkaz geninin Pichia pastoris’te ekspresyonu sağlanmıştır. Projenin bu kısmında ise, QBP1 peptidi (PPPWLPYMPPWS), Pichia pastoris maya hücrelerinden elde edilen lakkaz (lcc1) enziminin N-terminal ucuna yerleştirilerek füzyon protein oluşturuldu. Öncelikle DNA seviyesinde oluşturulan füzyon protein Pichia pastoris hücrelerinde üretildi. Oluşturulan füzyon protein ile lcc1 enziminin aktiviteleri karşılaştırılarak, QBP-1 peptidinin bağlanmış olduğu enzim aktivitesi üzerine etkisi ortaya konuldu. QBP1 peptidi, N-terminale bağlı olduğu halde, enzim aktivitesinde değişikliğe neden olmamaktadır. Bu ise bir “tag” molekülü olarak QBP1 için oldukça avantajlı bir özelliktir. Yapılacak uygulamaya göre, saflaştırma sonrasında tag molekülü, enzim ile bağlı olarak bırakılabilir. Çalışmanın devamında QBP-1 peptidi bir “tag” peptid olarak görev yaptırılarak hücre ortamından füzyon proteinin saflaştırılmasında kullanılmıştır. Hazırlanan kuartz kolonlar ve batch sistem yollarıyla, QBP-1’in kuartz yüzeyine bağlanabilme özelliği kullanılarak füzyon proteini hücre ortamından saflaştırmak mümkün olmuştur. Sonuç olarak burada, Moleküler Biyobenzetim ve biyoinformatik tekniklerinin birlikte kullanılmasıyla, daha ucuz ve basit saflaştırma yöntemleri geliştirme amaçlı yeni TAG moleküllerinin elde edilebileceğini göstermiş oluyoruz. Kuartza seçici olarak bağlanabilen QBP1 peptidi, sahip olduğu özellikler sayesinde, mevcut ticari “tag” (afinite etiketi) sistemleri ile rekabet edebilecek bir tag molekülüdür.
-
ÖgeP60-katanin’e Karşı Monoklonal Antikor Üretilmesi Ve Karakterizasyonu(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-08-16) Akkor, Meray ; Korkmaz, Arzu Karabay ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsKatanin çeşitli hücre tiplerinde mikrotubul yapısını düzenleyen başlıca proteinlerden biridir. Mikrotubulü kesen heterodimerik bir protein olan katanin, P60 ve P80 isimli altbirimlerinden oluşur. P60 altünitesi mikrotubulleri keser, P80 altünitesi ise mikrotubul kesilmesini kontrol eder. Katanin, mitoz-mayoz iğ ipliklerinin kısalması ve kesilmesi süreçlerini teşvik eder. Nöronlarda, P60-kataninin seviyesi aktif büyüyen aksonlarda, büyüyen nöronal uzantıların ucunda ve dendritogenezde çok yüksek bulunmuştur. P60-katanin inhibe edildiğinde, nöronal hücre gövdesinde ve mitoz-mayoz iğ iplikleri boyunca mikrotubul uzunluğu artar. Bu çalışmada, P60-katanin’e karşı ilk monoklonal antikor, 1G6, üretildi. Öncelikle, sıçan P60-kataninin belirli bir bölgesinden üretilen RecP60 (Recombinat P60-katanin) proteini, , Escherichia coli de exprese edildi ve antijen olarak kullanıldı. Hibridoma teknolojisi ile elde edilen monoklonal antikorlar, ELISA ile tarandıktan sonra western blotting ve immünositokimya yöntemlerinde analiz edildiler. Çalışmanın sonucunda, 1G6 monoklonal antikorunun western blotting ve immunositokimya yöntemlerinde endojen P60-katanini tanıdığı belirlendi. Monoklonal antikorlar kullanılacak yöntemlerin çeşitliliğini arttırırlar. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda P60-katanin poliklonal antikorları kullanılmaktaydı. P60’a karşı monoklonal antikorun hibridoma hücresinin, yani onu sınırsız üretebilen kaynağının elde elde edilmesi, P60-kataninin fonksiyonlarını araştırmak için büyük bir avantaj sağlayacaktır.
-
ÖgeSpeedyrıngo Proteininin Nörodejenerasyondaki Anti-apoptotik Etkilerinin İncelenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-12-25) Ünal, Ayşegül ; Korkmaz, Arzu Karabay ; 450916 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsNöronlar farklılaşmalarını tamamlamış ve bölünme özelliklerini kaybetmiş hücrelerdir. Fakat, yapılan çalışmalar, nörodejenerasyonda, hücre süklus belirteçleri olan siklinlerde belirgin bir artış olduğunu ve bu artışın nöronlarda hücre süklusunun normal olmayan bir şekilde aktive olmasıyla sonuçlandığını göstermiştir. Bu siklus aktivasyonunun birçok nörodejeneratif hastalığın, özellikle Alzheimer Hastalığının (AH) erken belirtilerinden biri olduğu kabul edilmektedir. AH’nda, nöronlar G0 adı verilen dinlenme fazından çıkarak yeniden hücre siklusuna girmekte ve hatta genomlarını replike etmektedirler. Fakat bu proses, nöronlar mitotik olmadığından, başarılı bir şekilde tamamlanamamakta ve nöronlar apoptoza gitmektedirler.Amiloid beta birikimi, oksidatif stres gibi sebepler nöronları dejenerasyona sürüklemektedir. Özellikle, AH’ nın en önemli işaretlerinden olan amiloid beta birikimi, nöronlardaki kalsiyum dengesinin bozulmasına ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artması sonucu kalpain enziminin patolojik olarak aşırı aktive olmasına sebep olmaktadır. Kalpainin aşırı aktivasyonunun ise nöronlarda hücre süklus aktivasyonu ve kaspaz-bağımlı apoptoza sebep olan en önemli etkenlerden biri olduğu belirtilmektedir. Siklinler, hücre siklusunun kontrolündeki ana elemanlar olmakla birlikte, SpeedyRINGO adı verilen başka bir protein de aynı özelliğe sahiptir. SpeedyRINGO’nun hücre siklusunun kontrolündeki rolünün yanısıra, bazı mitotik hücrelerde kaspaz-bağımlı apoptozu önlediğine dair çalışmalar da mevcuttur. Son çalışmalar SpeedyRINGO’nun DNA hasarına uğramış mitotik hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonunu engelleyerek anti-apoptotik olarak etki ettiğini göstermektedir. Bütün bu verilerden yola çıkılarak, bu çalışmada esas olarak, nöronlarda kalpainin aşırı aktivasyonunun ortaya çıkardığı dejeneratif ve apoptotik etkilerin, SpeedyRINGO proteinini nöronlarda eksprese ettirerek ortadan kaldırılması amaçlanmıştır. Çalışmanın sonuçları ile nöronlarda kalpainin patolojik aktivasyonu sonrası p53 seviyesindeki artışa bağlı olarak ortaya çıkan kaspaz-3 aktivasyonunun SpeedyRINGO protein tarafından engellenebildiği ve böylece nöronların kalpainin apoptotik etkisinden korunabildiği ilk kez gösterilmiştir.
-
ÖgeDesign of a bioactive scaffold system for hard tissue engineering(Institute of Science and Technology, 2013) Güngör Özkerim, Perihan Selcan ; Kök, Fatma Neşe ; 349784 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ProgrammeNanofibrous double-layer matrices were prepared by electrospinning technique with the bottom layer formed from PCL (poly--caprolactone) / PLLA (poly-l-lactic acid) blend nanofibers and the upper layer from PCL/Gelatin blend nanofibers. Gelatin microspheres were incorporated physically in the middle of these two layers for controlled growth factor delivery. This sandwich system prevented microsphere leakage from the scaffold. Bead-free nanofibers with uniform morphology could be obtained by 10% w/v concentrations of PCL/PLLA and PCL/Gelatin solutions. Microspheres prepared by 500-rpm stirring rate and cross-linked with 7.5% glutaraldehyde solution were chosen after in vitro release studies. The optimized conditions were used to prepare fibroblast growth factor-2 (FGF-2) loaded microspheres. Cell culture studies with FGF-2 loaded microspheres showed that the growth factor could be actively loaded into the system and enhanced the cell attachment and proliferation. To test the effect of gelatin on cell adhesion, cell culture was performed with PCL/PLLA matrices with or without PCL/Gelatin layer. Cell attachment was significantly higher when PLLA replaced by gelatin. To investigate cell differentiation on the designed scaffold system adipose tissue derived stem cells (ADMSCs) were used and microspheres within the scaffolds were loaded with bone morphogenic protein2 (BMP-2). The effect of scaffolding on differentiation of ADMSCs towards osteogenic lineage was evaluated by various markers. According to the results, all experimental samples were biocompatible and supported the proliferation and differentiation of ADMSCs.
-
ÖgeEvolutionary engineering and molecular characterization of freeze-thaw resistant saccharomyces cerevisiae(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013) Yılmaz, Ülkü ; Çakar, Zeynep Petek ; 352299 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve BiyoteknolojiSaccharomyces cerevisiae içki ve fırıncılık endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılan endüstriyel bir mikroorganizmadır. İyi karakterize edilmiş bir mikroorganizmadır ve aynı zamanda temel ve biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir. Endüstriyel uygulamalarda, donma-erime stresi özellikle donmuş hamur prosesinde genel bir stres çeşididir. S. cerevisiae? de donma-erime stres uygulamaları, hücrelerin donma-erime stresinin ölümcül etkileri ile başa çıkabilmeleri için çok yönlü çapraz-direnç mekanizmasını uyarır. Çok yönlü stres direnci ve donma-erime toleransı elde etmek için ekstra genetik mekanizmaların donma-erime stresi varlığında uyarıldığı ve aktif oldukları düşünülmektedir. S. cerevisiae? de donma-erime stresi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır, fakat donma-erime toleransının arkasında yer alan moleküler mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Evrimsel mühendislik, donma-erime stresine direnç gibi, özel ve istenilen fenotiplerdeki mutant suşların elde edilmesinde kullanılan ?doğal? bir prosestir. Genel olarak, evrimsel mühendislik dört ana basamaktan oluşmaktadır. Bu aşamalar; genetik olarak karışık hücre populasyonunun kimyasal/fiziksel mutasyon ile elde edilmesi, istenilen özellikteki geliştirilmiş suşun elde edilmesi için tekrarlayan sikluslarda seleksiyon baskısının uygulanması, elde edilen suşun performansının analizi ve bir sonraki hedefin dizaynı. Sonuç olarak, endüstriyel uygulamalarda, yüksek derecede donma-erime stresine dirençli, mayanın kendi genomu dışında yabancı herhangibir gen içermeyen, geliştirilmiş ekmek maya hücrelerinin kullanımı, daha güvenli ve kabul edilebilirdir. Böylece, bu yöntem, donma-erime stres direnci ile sonuçlanan yüksek derecede regüle edilmiş genomu ile ekmek mayasının endüstride kullanımının güvenli bir yoludur.
-
ÖgeEndüstriyel Uygulamalar İçin Yeni Biyokatalizörlerin Geliştirilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-02-22) Binay, Barış ; Karagüler, Nevin Gül ; 0 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsKüresel ısınma odaklı tartışmalar ve bu konuda oluşan kaygılar son yıllarda bilim insanları ve toplum içinde giderek artmaktadır. Bu durum, petrol kaynaklı üretimler yerine yenilenebilir biyolojik kaynaklara yönelimi teşvik etmektedir. “Yeşil proses” olarak adlandırılabilecek biyokatalizörlerin farklı endüstriyel alanlarda kullanımının önemi yakın zamanda idrak edilmiştir. Kimyasal katalizörler yerine hayvansal, bitkisel ve bakteriyel kaynaklardan elde edilen enzimlerin kullanımı endüstriyel proseslerde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Kiral merkezli moleküllerin sentezi kimyasal yöntemlerle gerçekleştirildiğinde rasemik karışımlar elde edilmektedir. Enzimatik reaksiyonlar ise enantiomerik saflıkta ürün üretimine imkan verdiklerinden, biyokatalizörlerin kiral bileşik üretiminde kullanılması çok uygundur. Biyokatalizör kullanımının diğer avantajları enzimlerin biyobozunur olmaları, katalizledikleri reaksiyonda stereo-seçici, bölgesel-seçici ve kimyasal-seçici davranmaları, görece düşük sıcaklıkta, ılıman pH ve basınç koşullarında fonksiyon göstermeleri ve çevre dostu olmaları şeklinde sıralanabilir. Bu avantajlarından dolayı biyokatalizörlerin tıp, kimya, gıda üretimi ve tarım endüstrilerinde kullanım alanları giderek artmaktadır. Fakat doğal çevreden izole edilen enzimlerin doğrudan endüstriyel proseslerde kullanılabilmeleri herzaman mümkün olmamaktadır. Enzim karakteristik özelliklerinin (aktivite, stabilite, çözünürlük, substrat ve koenzim seçiciliği ve optimum pH aralığı) sıklıkla ilgili endüstriyel üretime göre optimize edilmesi gerekmektedir. Protein mühendisliği yöntemleri, ilgili proses koşullarına uygun enzimlerin dizayn edilmesine olanak tanımaktadır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji tekniklerinin kullanılması yolu ile enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının moleküler düzeyde anlaşılıp, genetik yapılarının değiştirilerek, istenilen yapı ve fonksiyona sahip yeni enzimlerin üretilmesini mümkün kılmaktadır. Burada, endüstriyel öneme sahip olan Bacillus stearothermophillus laktat dehidrogenaz (bsLDH) ve Rhodotorula graminis fenilalanin liyaz (rgPAL) olarak adlandırılan enzimlerin substrat özgüllüklerinin iyileştirilmesini hedefledik. Bu iki enzimin özelliklerinin iyileştirilmesi için protein mühendisliğinin üç yöntemi uygulanmıştır; DNA shuffling (DNA karıştırma), bölgeye özel mutasyon yaklaşımları ile kombinatoryal saturasyon aktif bölge testi (CASTing). bsLDH’ın substrat spesifikliği, DNA karıştırma ve bölgeye özel mutasyon yaklaşımları ile başarıyla değiştirilmiştir. rgPAL’ın aktivitesi ise seçilen farklı substratlara karsı CASTing yöntemi kullanılarak arttırılmıştır. Bu tez kapsamında yeni bsLDH ve rgPAL proteinlerinin üretilmesine yönelik farklı stratejiler detaylı bir şekilde incelenmiştir. Üç deneysel bölümden oluşan tezin ilk iki bölümü bsLDH’ın düzenlenmesini tanımlarken, son bölüm rgPAL için CASTing metodunun uygulanmasını açıklamaktadır. bsLDH, okzo-asitlerin (pirüvat) hidroksi asitlere (laktat) karşılıklı dönüşüm reaksiyonunu NADH/NAD+ çiftini redoks kofaktörü olarak kullanarak katalizler. Enzim, eczacılık ve tarım alanında anahtar role sahip kiral moleküllerin sentezinde kullanılan ara ürünlerin üretiminde kullanıldığından ticari öneme sahiptir. İlgili okzo-asitlerin kiral hidroksi asitlerinin yüksek stereokimyasal seçicilikle üretilmesine imkan vermesine rağmen; bsLDH enziminin en önemli dezavantajı son derece sınırlı substrat özgüllüğüne sahip olmasıdır. Tezin ilk kısmında; bsLDH’ın substrat seçiciliğini değiştirmek için DNA karışım yöntemi kullanılmıştır. DNA karışım yöntemi ile elde edilen rekombinant mutant bsLDH kolonilerinden, malatın oksidasyonunu katalizleyebilenler uygun tarama ve seçme test yöntemi kullanılarakdiğerlerinden ayırt edilmişlerdir. Yönlendirilmiş evrim sonucunda sekiz (8) tane amino asit değişimine - Asn4Gln, Ser19Thr, Gln86Arg, Thr91Ser, Ala173Val, Glu183Asp,Gln221Asn ve Val267Thr- sahip olan mutant bsLDH proteininin substrat seçiciliğini pirüvat/laktatdan okzaloasetat/malata değiştirmiştir. Bahsedilen sekiz mutasyonun bsLDH’de malat dehidrogenaz aktivitesi oluşumuna neden olduğu ve malatın oksidasyonunu, pirüvata kıyasla 1009 kat daha hızlı olacak şekilde gerçekleştirdiği görülmüştür. Bu sonuç, yapı bilgisi kullanılarak yüksek verimli tekli mutasyonlarla hedeflenenin gerçekleştirildiği tasarımlara göre, yönlendirilmiş evrimin de özgüllüklerde yüksek değişikliklere yol açabileceğini göstermiştir. Tezin ikinci kısmında; X-ışını kristal yapısı ve biriken literatür bilgisi kullanılarak bsLDH rasyonel olarakmandelik asitle reaksiyona girecek şekilde dizayn edilmiştir. Mandelat dehidrogenaz aktivitesi, InsightII moleküler modelleme programı kullanılarak; bsLDH enziminde oluşturulmuştur. Modelleme programı enerji minimizasyonu sonucunda; Thr246Gly ve Ile240Ala mutasyonları ile bsLDH enziminin L-mandelik asidi substrat olarak kullanabileceği gösterilmiştir. Mutanlar oluşturulmuş ve mutant gen E.coli‘ye aktarılarak sentezi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca mutant ve doğal bsLDH‘i saflaştırmak için TAGZyme saflaştırma sistemi oluşturulmuştur. Rasyonel olarak tasarlanan bsLDH’ın aktivitesi mandelat varlığında ölçülmüştür. Enzim kinetiği sonuçları, bu iki mutasyonun, yüksek saflıkta elde edilen mutant bsLDH’ın substrat özgüllüğünü laktatdan L-mandelik asite dönüştürdüğünü göstermiştir. Tezin son kısmında; E.coli’ye ekspresyon vektörüyle klonlanmış Rhodotorula graminis kaynaklı fenilalanin amonyum liyaz (rgPAL) enziminin doğal olmayan amino asitlere karşı aktivite kazandırılmasını amaçladık. PAL, oksijensiz ortamda L-fenilalaninin trans-sinamik aside dönüşümünü katalizlemektedir. Bu reaksiyonun geri dönüşüm reaksiyonu, farmakoper olarak birçok peptidomimetrik ilaç molekülünün üretiminde L-fenilalanin analoglarının sentezinde kullanıldığından, enzim kimya endüstrisinde özel bir öneme sahiptir. Yarı rasyonel dizayn olarak değerlendirilen CASTing metodu çerçevesinde, her bir kütüphane için en az iki tane amino asit içeren beş kütüphane oluşturulmuştur. NRT yıkıcı kodon olarak bütün kütüphaneler için kullanılmıştır. 2000 koloni, geliştirilen protokol 1 ile taranmıştır. Birçok tarama adımından sonra seçilen substrata karşı yüksek aktivite gösteren dört rgPAL varyantı belirlenmiştir. PAL varyantlarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için iki tane test yöntemi geliştirilmiştir. Birinci test yöntemi, elde edilen kütüphaneleri taramak ve oluşan trans sinamik asit (t-CA) miktarını ölçmek için uygulanmıştır. İkinci test yönteminde ise, belirleyici enzim olarak kullanılan oksidaz enzimi, PAL enzimleri tarafından üretilen fenilalaninin miktarının niceleyici olarak ölçülmesine olanak tanıyacak şekilde eşleştirilmiştir. Uygun saflaştırma prosesleri sonrasında, mutant bsLDH ve rgPAL enzimleri kinetik olarak karakterize edilmişlerdir. Enzim kinetiği çalışmaları, bsLDH ve rgPAL enzimlerinin substrat özgüllüklerinin başarılı bir şekilde değiştirildiğini göstermiştir. Elde edilen bu sonuçlar, uygun strateji uygulandığında protein mühendisliğinin, enzimlerin yeniden tasarlanmasında çok güçlü bir teknoloji olduğunu göstermiştir.
-
ÖgeNöronlarda Fizyolojik Ve Dejeneratif Koşullar Altında Pkc Aktivasyonunun Etkilerinin Araştırılması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-02-22) Koç, Şirin Korulu ; Korkmaz, Arzu Karabay ; 451198 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsNöronlar ileri derecede farklılaşmış hücreler olup normal koşullar altında hücre döngüsünün G0 evresinde yer alırlar. Ancak, Alzheimer hastalığı (AH) gibi nörodejeneratif durumlarda nöronların G0 evresini terk ettiği, G1/S kontrol noktasını atlayarak hücre döngüsüne devam ettiği, hatta DNA’sını replike ettiği gösterilmiştir. AH’nda sinyal iletim yolaklarının birçoğu değişime uğramaktadır. Ser/Thr protein kinaz ailesinin bir üyesi olan Protein Kinaz C (PKC) de AH’nda ekspresyon ve aktivasyon düzeyleri değişime uğrayan proteinler arasında yer almaktadır. PKC’nin aktivasyonu genellikle bu proteinin diaçilgliserol, araşidonik asit gibi ikincil mesajcı sinyal moleküllerince hücre membran kompartmanlarına lokalizasyonu ile sağlanır. Bununla birlikte, PKC’ye nükleusta meydana gelen olaylarda görevler atfeden bulgular ve görüşler de artmaktadır. Kısacası PKC’nin hücre içi konumu ve görevleri özellikle nöronlar için net olarak tanımlanamamıştır. PKC, nörodejenerasyon ile ilişkili yolaklardaki görevinin yanı sıra, hücre bölünmesi ve hatta hücre farklılaşması gibi olaylar ile de ilişkilendirilmektedir. Tüm bu veriler ışığında, bu çalışmanın amacı nöronlarda fizyolojik ve dejeneratif koşullar altında Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) kaynaklı PKC aktivasyonunu etkilerini araştırmaktır. Bu kapsamda nöronlarda PKC ve siklinlerin ekspresyon düzey ve lokalizasyon farklılıkları ile nöronal sitoiskelet yapısındaki değişimler araştırılmıştır. Bu çalışma nükleer PKC’nin hücre siklusuyla ilişkili hali hazırda bilinen görevlerine ilaveten nöronlarda nükleer siklinD1 artışı ve mikrotubullerin yeniden organizasyonu yardımı ile farklılaşmada gerilemeye yol açtığını göstermesi bakımından son derece önemlidir.
-
ÖgeZar Protein-tabanlı İn Vitro Metotlar(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-07-19) İnci, Fatih ; Kök, Fatma Neşe ; 465281 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsLipitleri, karbohidratları ve proteinleri içeren biyolojik zarlar yalnızca birkaç nanometre kalınlığında ve yüksek karmaşıklıkta yapılardır. Zar proteinleri, molekül taşınması, biyolojik enerji dönüşümü, hücresel davranış, iletişim ve tanıma gibi hücre yapı ve fonksiyonlarında birçok önemli göreve sahiptir. Bu yüzden, zar protein yapı ve fonksiyonundaki sorunlar hücre işlevlerinde problemlere yolaçar ve bu durum diyabetten kansere kadar birçok hastalığa neden olur. Zar proteinleri bu nedenle birçok ilacın hedefi konumundadır. Zar protein yapı ve fonksiyonunu araştırmak için hücre zarını taklit eden sistemler gereklidir. Model zar sistemleri, in vitro zar protein araştırma platformaları oluşturmak için önemli bir olanak sunar. En önemli model zar platformlarından biri olan yüzeye bağlı lipit çift-katman zar sistemi geniş integral proteinlerin lipit çift-katman içerisine yerleştirilebilmesi için gerekli bir aralık içerir. Bu tezin amacı, çoklu-ilaç direnci proteini (MDR1) gibi geniş hücre dışı ve içi bölümleri olan zar proteinlerinin fonksiyonel entegrasyonunda kullanılabilecek bir yapay lipit çift-katman sistemi kurmaktır. Bunun için kurulan lipit çift-katman sistemi karakterize edildi ve ilaç-zar protein etkileşimlerinin incelenmesindeki performansı in vitro koşullarda statin-tabanlı ilaçlar kullanılarak belirlendi. Yapay zar sistemi kurmak için, altın-kaplı cam ve kuvars kristal yüzeyler destek materyal olarak kullanıldı. Yapısında bulunan disülfit bağını koparıp kovalent olarak altın-kaplı yüzeylere bağlanan ve sonraki modifikasyonlar için diğer uçta aktif bir süksinimid sunan 3,3′-ditiyobis(N-süksinimid propionat) (DTSP) molekülü kullanılarak yüzeyler ilk önce aktive edildi. Geniş zar proteinlerinin lipit zarlara entegrasyonunda zar ile altın-kaplı destek arasında boşluk oluşturmak için modifiye edilmiş lipid molekülü (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polietilenglikol)-2000] (DSPE-PEG)) aracı molekül olarak kullanıldı. Hayvan ve bitki hücrelerinde yüksek miktarda bulunduğundan fosfatidilkolin molekülü lipozom solüsyonun hazırlanması için kullanıldı ve 100 nm çaplı lipozomlar ekstrüder sistem ile oluşturuldu. Her bağlanma olayını ve proteinli ve proteinsiz lipozomların lipit çift-katman oluşturmalarını gerçek zamanlı izlemek için Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) ve Kuvars Kristal Mikroterazi-Disipasyon (QCM-D) karakterizasyon metotları kullanıldı. Ayrıca, yapay lipit zar platformu sıvı-Atomik Güç Mikroskopi (AFM) sistemi uygulanılarak görüntülendi ve böylelikle, lipit katman topografisi incelendi. Ek olarak, ilaç-protein etkileşimleri kurulan yüzeye bağlı lipit çift-katman platformunda araştırıldı. Aracı molekülü yüzeye bağlamak için çeşitli DSPE-PEG derişimleri (0.01 – 0.06 mg/mL) denendi ve karakterizasyon deneylerinde (SPR ve QCM-D) yüzeye bağlanan DSPE-PEG miktarının yüksek başlangıç derişimi ile arttığı bulundu. Aracı moleküllerin yüzeyde aldığı konformasyonlar farklı DSPE-PEG yüzey kaplaması durumlarında çeşitlilik gösterdi. Örneğin, yüzeyin düşük miktarda kaplanması molekül içi etkileşimleri (mantar tipi yapı oluşumu) avantajlı hale getirirken, yüzeyin yüksek oranda kaplanması, ile DSPE-PEG moleküllerinin moleküller arası etkileşimlere (fırça tipi yapı oluşumu) girdiği görüldü. Karakterizasyon metotlarında bu şekilde bir konformasyonel geçişin varlığı 0.01 ve 0.02 mg/mL derişimleriyle oluşturulan yüzeylerde tespit edildi. Yüksek (0.05 ve 0.06 mg/mL) ve düşük (0.02 ve 0.03 mg/mL) DSPE-PEG derişimleri test edildiğinde kayda değer bir lipit katman oluşumu gözlenmedi. SPR ve QCM-D çalışmalarının her ikisinde de 0.03 mg/mL DSPE-PEG derişimi lipit çift-katman oluşumu için optimum koşulları sağladı. Sıvı-AFM sistemi kullanılarak aracı molekülün yapısal konformasyonu karakterize edildi. Aracı molekülün konformasyonel davranışını farklı koşullarda incelemek için DSPE-PEG kaplı katman öncelikle kurutuldu ve sonra tekrar ıslatıldı. Kurutma işlemi sonucunda yüzeyde küresel yapılar gözlendi. Bu durum, kurulan katmanın pürüzlülük parametresini arttırdı. Bu katman tekrar sulu ortama konulduğunda aracı molekülün önceki şeklini aldığı tespit edildi ve böylelikle, DSPE-PEG katmanının sonraki aşamalar için hazırlanıp kuru saklanabileceği tespit edildi. Ek olarak, oluşturulan aracı molekül katmanın boyutu incelenerek sıvı koşullarda bu katmanın daha yoğun ve yönlenmiş bir davranış ortaya koyduğu gözlemlendi. Aracı molekül katmanının bu yönlenmiş davranışı lipozomların deformasyonunu sağlayarak lipit çift-katmanı oluşturmasını ve bu katmanın yüzeyden yükseltilmesini sağladığı tespit edildi. Ayrıca, modifiye edilmemiş altın-kaplı yüzeylerin pürüzlülük parametreleri aracı molekülün bağlanmasından sonra belirgin bir şekilde azaldı ve daha düz bir yüzey elde edildi. Pürüzlülük parametresindeki bu azalmanın aracı moleküldeki PEG altbirimlerinin vizkoelastik özelliklerinden dolayı olduğu düşünüldü. DSPE-PEG derişiminin lipozomların bağlanma/yayılma ve lipit çift-katman oluşturması üzerindeki etkisini incelemek için sabit hacim ve derişimdeki lipozom solüsyonları kullanıldı. Aracı molekülün derişimi lipit katman platformunun kurulmasını kayda değer bir biçimde etkiledi. SPR ve QCM-D analizleri ışığında 0.03 mg/mL DSPE-PEG derişiminin kullanıldığında lipozom deformasyonu ve lipit katman oluşumu için optimum koşullar sağlandı. Diğer aracı molekül derişimleri test edildiğinde ya lipozom deformasyonunun olmadığı ya da kısmi deformasyonun gerçekleştiği gözlemlendi. Bu nedenle, lipit çift-katman platformunun kurulması için deneylere 0.03 mg/mL DSPE-PEG derişimi kullanılarak devam edildi. Lipit çift-katman yapısını görüntülemek için sıvı-AFM sisteminden yararlanıldı. AFM çalışmalarında lipozom yayılmasından sonra pürüzlülük parametrelerinin azaldığı (0.683 nm ve 0.776 nm’den 0.452 nm ve 0.555 nm’ye) ve daha düz bir yüzeyin oluştuğu gözlemlendi. Böylelikle, kurulan katmanın destek yüzey üzerinde lipit çift-katman oluştuğu AFM analizi ile de gösterildi. Zar proteinlerinin lipit çift-katman içerisine entegrasyonunu araştırmak için MDR1 proteini model protein olarak kullanıldı. SPR ve QCM-D metotları kullanılarak çeşitli MDR1 protein miktarlarında (0.7 - 5.0 µL) deneyler yapıldı. Optik kalınlık ölçümleri 1 µL MDR1 protein-yüklü lipozomların yüksek bağlanma/yayılma ile sonuçlandığını gösterdi. Ayrıca, disipasyon analizi SPR’dan elde edilen sonuçları destekledi. QCM-D analizi MDR1 proteini varlığında lipit katmanın akışkanlığının azaldığını gösterdi. Bu durumun doğal hücresel zarlarda olduğu gibi fosfolipitlerin hareketlerinin kısıtlanmasından kaynaklandığı düşünüldü. MDR1-yüklü lipit çift-katmanları görüntülemek için sıvı-AFM analizi yapıldı. Oluşturulan lipit katman üzerinde yaklaşık 1.2 - 2.8 nm yükseklikte birçok belirgin yükselti tespit edildi. Bu sonuçlar MDR1 proteininin sitoplazma dışındaki bölgesi için deneysel ve teorik değerlerin (2 nm) benzer olduğunu ve SPR ve QCM-D’den elde edilen sonuçları desteklediğini göstermektedir. Ayrıca, oluşturulan lipit katman içerisindeki MDR1 proteininin entegrasyonunu ve oryantasyonunu belirlemek için anti-MDR1 ve anti-Pin8 monoklonal antikor çalışmaları yapıldı. Antikor çalışmaları ışığında, MDR1 proteininin lipit katmanlar içerisine doğal yapısında farkedilebilen herhangi bir bozulma olmadan başarılı ve etkili bir biçimde yerleştirildiği gözlemlendi. İlaç-zar proteini etkileşimlerini incelemek için statin-tabanlı ilaçlar kullanıldı. Suda çözünebilme özelliğinden dolayı pravastatin molekülü deneyler için seçildi. Lipofilik ve polar olmayan özellikteki diğer statin-tabanlı ilaçlar (örneğin, simvastatin ve lovastatin) lipit çift-katman yapısını etkilediğinden dolayı deneylerde kullanılamadı. Pravastatin-MDR1 protein etkileşiminin araştırıldığı bu deneylerde bağlanma miktarı ilaç derişimine bağlı olarak (0.01 ve 0.05 mg/mL) arttı. Bu tezde, hücre içi ve dışında geniş bölgeleri olan MDR1 proteini için yüzeye bağlı yapay lipit platformu başarıyla kuruldu. Ayrıca bu platformda statin-tabanlı ilaçlar ve MDR1 proteini arasındaki etkileşimler incelendi. Literatürde statin-tabanlı ilaçlar ve MDR1 proteini arasındaki etkileşimlerin model zar sistemlerinde çalışıldığı herhangi bir ön çalışma bulunmamaktadır. Bu tezde statin-MDR1 proteini etkileşimleri yapay lipit zar platformu kullanılarak yeni bir yöntemle in vitro koşullarda incelenerek bu alandaki çalışmalara bir yenilik kattı. Ayrıca, yüzeye bağlı yapay lipit çift-katman sistemi zar proteininin doğal yapısında herhangi bir değişim oluşturmadığından protein karakteristiği ve ilaç-zar protein etkileşimleri çalışmaları için büyük umut vaad etmektedir ve böylelikle, kurulan platform hücre içinde ve dışında geniş bölgeleri olan zar proteinlerinin araştırılmasındaki sorunları çözebilen alternatif bir sistem sunmuştur. Ek olarak, yapay lipit çift-katman platformu ile mikro-akışkan ve biyosensör sistemleri birlikte kullanılarak farklı zar proteinleri ile çeşitli ilaçların in vitro koşullarda etkileşimlerinin incelemesini sağlayan çok amaçlı platformlar gelecekte oluşturulabilir.
-
ÖgeDonma-erime Stresine Dirençli Saccharomyces Cerevisiae’ Nin Evrimsel Mühendisliği Ve Moleküler Karakterizasyonu(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-07-19) Yılmaz, Ülkü ; Çakar, Zeynep Petek ; 10006408 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsSaccharomyces cerevisiae içki ve fırıncılık endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılan endüstriyel bir mikroorganizmadır. İyi karakterize edilmiş bir mikroorganizmadır ve aynı zamanda temel ve biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir. Endüstriyel uygulamalarda, donma-erime stresi özellikle donmuş hamur prosesinde genel bir stres çeşididir. S. cerevisiae’ de donma-erime stres uygulamaları, hücrelerin donma-erime stresinin ölümcül etkileri ile başa çıkabilmeleri için çok yönlü çapraz-direnç mekanizmasını uyarır. Çok yönlü stres direnci ve donma-erime toleransı elde etmek için ekstra genetik mekanizmaların donma-erime stresi varlığında uyarıldığı ve aktif oldukları düşünülmektedir. S. cerevisiae’ de donma-erime stresi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır, fakat donma-erime toleransının arkasında yer alan moleküler mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Evrimsel mühendislik, donma-erime stresine direnç gibi, özel ve istenilen fenotiplerdeki mutant suşların elde edilmesinde kullanılan “doğal” bir prosestir. Genel olarak, evrimsel mühendislik dört ana basamaktan oluşmaktadır. Bu aşamalar; genetik olarak karışık hücre populasyonunun kimyasal/fiziksel mutasyon ile elde edilmesi, istenilen özellikteki geliştirilmiş suşun elde edilmesi için tekrarlayan sikluslarda seleksiyon baskısının uygulanması, elde edilen suşun performansının analizi ve bir sonraki hedefin dizaynı. Sonuç olarak, endüstriyel uygulamalarda, yüksek derecede donma-erime stresine dirençli, mayanın kendi genomu dışında yabancı herhangibir gen içermeyen, geliştirilmiş ekmek maya hücrelerinin kullanımı, daha güvenli ve kabul edilebilirdir. Böylece, bu yöntem, donma-erime stres direnci ile sonuçlanan yüksek derecede regüle edilmiş genomu ile ekmek mayasının endüstride kullanımının güvenli bir yoludur.
-
ÖgeAmonyağı Oksitleyen Arke Lerin Atıksu Arıtımındaki Rolünün Moleküler Tekniklerle Belirlenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-08-06) Kurt, Halil ; Akarsubaşı, Alper Tunga ; 10011658 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAmonyak amonyağı-oksitleyen organizmalar tarafından nitrite dönüştürülür ve bu reaksiyon nitrifikasyonun hız belirleyen adımını oluşturur. Amonyak monooksijenaz (AMO) amonyak oksidasyonundan sorumlu enzimdir ve DNA dizilemesinde sıklıkla kullanılır. Yakın zamana kadar amonyağı sadece amonyak oksitleyen bakteriler ve anaerobik amonyak oksitleyen bakterilerin (anammox) oksitleyebildiği biliniyordu. Son zamanlardaki çalışmalar, amonyağı oksitleyen Arkerin de amonyağın oksitlenmesinde rol aldıkları gösterilmiştir. Arkelere ait amoA geni birçok çevre örneklerinde amonyağı oksitleyen bakterilere göre daha fazla ve aktif olarak bulunmaktadır. Amonyak oksitleyen Arkeler (AOA) ayrıca atık su arıtma tesislerindeki biyolojik nitrojen gideriminde de önemli rol oynayabilmektedir. Bu çalışmada, Petrol, yağ, gıda, alkol, kimyasal endüstri ve çöp sızıntı suyu atıksu arıtması gibi, onaltı farklı evsel ve sanayi atık su arıtma tesisinden örnekler toplanmıştır. AOA ve Amonyak oksitleyen bakterilerin (AOB) varlığı arkeal ve bakteriyel amoA genine özgü iki primer çifti kullanılarak kantitatif realtime PZR yöntemi ile çalışılmıştır. Ayrıca Arkeal Amo A geni klonlanarak dizilenmiş ve filogenetik ağaç elde edilmiştir. Atıksu arıtma tesislerindeki amonyum konsantrasyonlarına bağlı olarak tesisler arasında AOA ve AOB miktarlarının farklılaştığı bulunmuştur. DNA dizi analizi sonrası, AOA ların büyük bir kısmının deniz grubunu içeren (Grup 1.1a) kümesine dahil olduğu saptanmıştır. Küçük bir grup AOA ise toprak kümesine (Grup 1.1a) ait çıkmıştır. Diğer bir küme olan termofilik AOA kümesine ait Arkeler tespit edilememiştir. Saf kültür çalışmaları, amonyak miktarı ve oksijen içeriğinin AOA varlığını ve kominite yapısını etkileyen en önemli iki faktör olduğunu göstermektedir. Fakat, bu iki substratı AOB de kullandığından bu iki grup arasında atıksu arıtma tesislerinde oksijen ve amonyak için yarışma vardır. Tüm örneklerde AOA varlığı 103 - 108 gen kopya sayısı arasında gösterilmiştir. Düşük amonya miktarlarına sahip evsel atık arıtma tesislerinde AOA amoA gen kopya sayısının yüksek çıkması bu tesislerde AOA’nın potansiyel ototrofik amonyak oksidasyonunda rol alabileceğini göstermektedir. NH3 konsantrasyonu gibi konvansiyonel parametrelerin atıksu arıtma tesislerinde AOA varlığının tespitende kullanılabileceği bulunmuştur. Bu bulgu atıksu arıtma sistemlerinde AOA’nın nitrojen gideriminde rol alabileceğini düşündürmektedir. Arkeal amoA gen kopyası hücre başına 1 kopya iken bakteriyel amoA gen kopyası 2,5 dur. Bu bilgi göz önünde bulundurulduğunda AOB kopya sayısı sadece amonyak konsantrasyonu en yüksek olan ISTAÇ ve Pakmaya atıksu arıtma örneklerinde AOA kopya sayısını geçmektedir. Arkeal amonyak mono-oksigenaz amonyaga karşı bakteriyel enzinden daha yüksek afiniteye sahiptir. Genellikle AOA amonyak konsantrasyonunun düşük olduğu ortamlarda daha fazla bulunmaktadır. Bu durum bizim çalışmamızla da uyumludur. AOB ve AOA tüm örneklerde bulunmasına rağmen, atıksu arıtma tesislerinde nitrifikasyona birlikte katkı sağlamaktadırlar. AOA düşük amonyak derişimine sahip tesislerde baskın türler iken AOB yüksek amaonyak derişimine sahip tesislerde baskındır. Bu sonuç yeni literatürle de uyumludur. Düşük amonyak derişimine sahip evsel atıksu arıtma tesislerinde önemli miktarda AOA varlığı bu tesislerde potansiyel amonyak oksitleyen organizma olduğunu göstermektedir. Bu bulgu atıksu arıtma tesislerinde amonyak giderimi üzerindeki bilgilerimizi değiştirebilir. Doğada AOA varlığı ve aktif olarak biyojeokimyasal çevrime katkıda bulunduğu rapor edilmiştir. Bu bilgi ışıgında, AOA nın atıksu arıtmada amonyak gideriminde rol alabileceği düşünülmelidir. AOA amoA gen ifade miktarlarının tespit çalışmaları ileride nitrifikasyonda AOA katkısını daha iyi bir şekilde ortaya koyabilir. amonyak konsantrasyonu ile AOA ve AOB miktarları rasındaki ilişkide hala aydınlatılmamış noktalar bulunmaktadır. Aşırı düşük çözünmüş oksijen konsantarsyonları atıksu arıtma sistemlerinde AOA büyümesini teşvik edebilir, bununla birlikte, tam ters sonuçlar da elde edilmiştir. Çözünmüş oksijen düzeyi 3.25 mgl−1 olan atıksu arıtma tesisinde yüksek miktarlarda AOA varlığı saptanmıştır. Bazı çalışmalarda, istatistiksel analizler sonucu atıksu arıtma tesisi havalandırma havuzunda çözünmüş oksijen miktarı ile AOA miktarı arasında korelasyon bulunamamıştır. Bazı çalışmalar ise çözünmüş oksijen miktarının AOA varlığı üzerine etki eden en önemli etkenlerden birisi olduğunu belirtilmektedir. Çalışmalardaki bu tutarsızlıklardan dolayı çözünmüş oksijen miktarının AOA ve AOB miktarları üzerine etkisi hala tartışmalıdır. Bizim çalışmamızda, AOB amoA gen miktarı kimyasal oksijen ihtiyacı ile pozitif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05). Fakat AOA amoA gen miktarı kimyasal oksijen ihtiyacı ile negatif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05). AOB amoA gen miktarı amonyak miktarı ile pozitif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05), bununla beraber AOA amoA gen miktarı amonyak miktarı ile korelasyon göstermemiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.1933). Bu sonuçlara göre AOA ekotipleri çok esnek olabilir ve bazı AOA türleri miksotrofik olabilir. Mußmann ve arkadaşları tarafından yapılan çalışma atıksu arıtma sisteminde AOA aktivitesinin ilk ve tek kanıtı olabilir. Bu çalışmada elli iki tesisin sadece dördünde yüksek miktarlarda AOA tespit etmişlerdir. Bir tesisi derinlemesine araştırdıklarında AOB den on bin kat daha fazla AOA tespit etmişlerdir. Fakat yapılan modelleme çaılışması sonucunda bu tesisteki amonyak miktarı tüm amonyak oksitleyen organizmalara yetemeyeceği tespit edilmiştir. Sistemde bulunan AOA ların sadece % 1 ine yetecek miktarda amonyak bulunmaktadır. Bu sebepte sistemde bulunan AOA ların enerjilerinin tümünü nitrifikasyondan elde edip etmedikleri tartışma konusudur. Floresans in situ hibridizasyon ve 14C-inorganik karbon izotopu kullanılarak yapılan mikro-otoradyografi çalışmasında AOB nin aksine AOA lar kemo-ototrofik olarak aktif olmadıkları gösterilmiştir. Bu sonuç sonunda bu tesiste AOA ların amonyak oksitlemedikleri sonucuna varılmıştır. AOA lar muhtemelen diğer metabolik yolları kullanarak atıksuda bulunan karbon ve enerji kaynağını kullanmaktadırlar. AOA ve AOB’lerin atıksu arıtma sistemlerinde amonya giderimindeki rollerinin belirlenebilmesi için daha ileri çalışmalar yapılmalıdır. Sonuç olarak, atıksu arıtma sistemlerinde AOA varlığı tespit edilmiş fakat bu grup atıksu arıtma sistemlerinde potansiyel nitrifierlar olarak düşünülemeyebilir.