FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Gözat
Başlık ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeAmonyağı Oksitleyen Arke Lerin Atıksu Arıtımındaki Rolünün Moleküler Tekniklerle Belirlenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-08-06) Kurt, Halil ; Akarsubaşı, Alper Tunga ; 10011658 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAmonyak amonyağı-oksitleyen organizmalar tarafından nitrite dönüştürülür ve bu reaksiyon nitrifikasyonun hız belirleyen adımını oluşturur. Amonyak monooksijenaz (AMO) amonyak oksidasyonundan sorumlu enzimdir ve DNA dizilemesinde sıklıkla kullanılır. Yakın zamana kadar amonyağı sadece amonyak oksitleyen bakteriler ve anaerobik amonyak oksitleyen bakterilerin (anammox) oksitleyebildiği biliniyordu. Son zamanlardaki çalışmalar, amonyağı oksitleyen Arkerin de amonyağın oksitlenmesinde rol aldıkları gösterilmiştir. Arkelere ait amoA geni birçok çevre örneklerinde amonyağı oksitleyen bakterilere göre daha fazla ve aktif olarak bulunmaktadır. Amonyak oksitleyen Arkeler (AOA) ayrıca atık su arıtma tesislerindeki biyolojik nitrojen gideriminde de önemli rol oynayabilmektedir. Bu çalışmada, Petrol, yağ, gıda, alkol, kimyasal endüstri ve çöp sızıntı suyu atıksu arıtması gibi, onaltı farklı evsel ve sanayi atık su arıtma tesisinden örnekler toplanmıştır. AOA ve Amonyak oksitleyen bakterilerin (AOB) varlığı arkeal ve bakteriyel amoA genine özgü iki primer çifti kullanılarak kantitatif realtime PZR yöntemi ile çalışılmıştır. Ayrıca Arkeal Amo A geni klonlanarak dizilenmiş ve filogenetik ağaç elde edilmiştir. Atıksu arıtma tesislerindeki amonyum konsantrasyonlarına bağlı olarak tesisler arasında AOA ve AOB miktarlarının farklılaştığı bulunmuştur. DNA dizi analizi sonrası, AOA ların büyük bir kısmının deniz grubunu içeren (Grup 1.1a) kümesine dahil olduğu saptanmıştır. Küçük bir grup AOA ise toprak kümesine (Grup 1.1a) ait çıkmıştır. Diğer bir küme olan termofilik AOA kümesine ait Arkeler tespit edilememiştir. Saf kültür çalışmaları, amonyak miktarı ve oksijen içeriğinin AOA varlığını ve kominite yapısını etkileyen en önemli iki faktör olduğunu göstermektedir. Fakat, bu iki substratı AOB de kullandığından bu iki grup arasında atıksu arıtma tesislerinde oksijen ve amonyak için yarışma vardır. Tüm örneklerde AOA varlığı 103 - 108 gen kopya sayısı arasında gösterilmiştir. Düşük amonya miktarlarına sahip evsel atık arıtma tesislerinde AOA amoA gen kopya sayısının yüksek çıkması bu tesislerde AOA’nın potansiyel ototrofik amonyak oksidasyonunda rol alabileceğini göstermektedir. NH3 konsantrasyonu gibi konvansiyonel parametrelerin atıksu arıtma tesislerinde AOA varlığının tespitende kullanılabileceği bulunmuştur. Bu bulgu atıksu arıtma sistemlerinde AOA’nın nitrojen gideriminde rol alabileceğini düşündürmektedir. Arkeal amoA gen kopyası hücre başına 1 kopya iken bakteriyel amoA gen kopyası 2,5 dur. Bu bilgi göz önünde bulundurulduğunda AOB kopya sayısı sadece amonyak konsantrasyonu en yüksek olan ISTAÇ ve Pakmaya atıksu arıtma örneklerinde AOA kopya sayısını geçmektedir. Arkeal amonyak mono-oksigenaz amonyaga karşı bakteriyel enzinden daha yüksek afiniteye sahiptir. Genellikle AOA amonyak konsantrasyonunun düşük olduğu ortamlarda daha fazla bulunmaktadır. Bu durum bizim çalışmamızla da uyumludur. AOB ve AOA tüm örneklerde bulunmasına rağmen, atıksu arıtma tesislerinde nitrifikasyona birlikte katkı sağlamaktadırlar. AOA düşük amonyak derişimine sahip tesislerde baskın türler iken AOB yüksek amaonyak derişimine sahip tesislerde baskındır. Bu sonuç yeni literatürle de uyumludur. Düşük amonyak derişimine sahip evsel atıksu arıtma tesislerinde önemli miktarda AOA varlığı bu tesislerde potansiyel amonyak oksitleyen organizma olduğunu göstermektedir. Bu bulgu atıksu arıtma tesislerinde amonyak giderimi üzerindeki bilgilerimizi değiştirebilir. Doğada AOA varlığı ve aktif olarak biyojeokimyasal çevrime katkıda bulunduğu rapor edilmiştir. Bu bilgi ışıgında, AOA nın atıksu arıtmada amonyak gideriminde rol alabileceği düşünülmelidir. AOA amoA gen ifade miktarlarının tespit çalışmaları ileride nitrifikasyonda AOA katkısını daha iyi bir şekilde ortaya koyabilir. amonyak konsantrasyonu ile AOA ve AOB miktarları rasındaki ilişkide hala aydınlatılmamış noktalar bulunmaktadır. Aşırı düşük çözünmüş oksijen konsantarsyonları atıksu arıtma sistemlerinde AOA büyümesini teşvik edebilir, bununla birlikte, tam ters sonuçlar da elde edilmiştir. Çözünmüş oksijen düzeyi 3.25 mgl−1 olan atıksu arıtma tesisinde yüksek miktarlarda AOA varlığı saptanmıştır. Bazı çalışmalarda, istatistiksel analizler sonucu atıksu arıtma tesisi havalandırma havuzunda çözünmüş oksijen miktarı ile AOA miktarı arasında korelasyon bulunamamıştır. Bazı çalışmalar ise çözünmüş oksijen miktarının AOA varlığı üzerine etki eden en önemli etkenlerden birisi olduğunu belirtilmektedir. Çalışmalardaki bu tutarsızlıklardan dolayı çözünmüş oksijen miktarının AOA ve AOB miktarları üzerine etkisi hala tartışmalıdır. Bizim çalışmamızda, AOB amoA gen miktarı kimyasal oksijen ihtiyacı ile pozitif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05). Fakat AOA amoA gen miktarı kimyasal oksijen ihtiyacı ile negatif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05). AOB amoA gen miktarı amonyak miktarı ile pozitif olarak korelasyon göstermiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.05), bununla beraber AOA amoA gen miktarı amonyak miktarı ile korelasyon göstermemiştir (iki yönlü parametrik olmayan Spearman’s rank korelasyon etkin değeri < 0.1933). Bu sonuçlara göre AOA ekotipleri çok esnek olabilir ve bazı AOA türleri miksotrofik olabilir. Mußmann ve arkadaşları tarafından yapılan çalışma atıksu arıtma sisteminde AOA aktivitesinin ilk ve tek kanıtı olabilir. Bu çalışmada elli iki tesisin sadece dördünde yüksek miktarlarda AOA tespit etmişlerdir. Bir tesisi derinlemesine araştırdıklarında AOB den on bin kat daha fazla AOA tespit etmişlerdir. Fakat yapılan modelleme çaılışması sonucunda bu tesisteki amonyak miktarı tüm amonyak oksitleyen organizmalara yetemeyeceği tespit edilmiştir. Sistemde bulunan AOA ların sadece % 1 ine yetecek miktarda amonyak bulunmaktadır. Bu sebepte sistemde bulunan AOA ların enerjilerinin tümünü nitrifikasyondan elde edip etmedikleri tartışma konusudur. Floresans in situ hibridizasyon ve 14C-inorganik karbon izotopu kullanılarak yapılan mikro-otoradyografi çalışmasında AOB nin aksine AOA lar kemo-ototrofik olarak aktif olmadıkları gösterilmiştir. Bu sonuç sonunda bu tesiste AOA ların amonyak oksitlemedikleri sonucuna varılmıştır. AOA lar muhtemelen diğer metabolik yolları kullanarak atıksuda bulunan karbon ve enerji kaynağını kullanmaktadırlar. AOA ve AOB’lerin atıksu arıtma sistemlerinde amonya giderimindeki rollerinin belirlenebilmesi için daha ileri çalışmalar yapılmalıdır. Sonuç olarak, atıksu arıtma sistemlerinde AOA varlığı tespit edilmiş fakat bu grup atıksu arıtma sistemlerinde potansiyel nitrifierlar olarak düşünülemeyebilir.
-
ÖgeAnorganik Yapılara Bağlanan Peptitlerin Moleküler Araç Olarak Kullanılması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2010-04-21) Kaçar, Turgay ; Tamerler, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMoleküler biyobenzetim, doğada varolan, biyomoleküllerin anorganik yapılar ile olan moleküler seviyedeki ilişkilerinden esinlenerek ortaya çıkmıştır. İleri derecede gelişmiş özelliklere sahip hibrid malzemelerin üretilmesi için anorganik yapılara bağlanabilen peptitlerin de içinde bulunduğu yeni moleküler araçlar sunmaktadır. Bu peptitlerden yararlanılarak yapılacak malzemeler bioteknoloji, nanoteknoloji, ve mikro/nanoeletronik gibi birçok alanda kullanılabilir. Terminolojide genetik olarak modifiye edilmiş anorganik yapılara bağlanabilen peptitler (GEPI) olarak bilinen bu moleküler araçlar, faj- ve hücre- gösterimi gibi kombinatoriyel biyolojide kullanılan methodlarla elde edilirler. FM, SPR, QCM, ve AFM gibi teknikler ile karakterize edildikten sonra GEPI’ler; bu tezin içerdiği çalışmalarda moleküler ölçekte organize edici, bağlayıcı, sentezleyici olarak kullanılmış, bu sayede aynı amaçlar için klasik olarak kullanılan sentetik moleküllerin taşıdığı dezavantajlar ortadan kaldırılarak farklı uygulamalara hizmet edebilecek, fonksiyonel yeni platformlar hazırlanmıştır. İlk olarak, spesifik olarak yüzeyi tanıması ve protein mühendisliğindeki uygulanabilirliği baz alınarak, altına bağlanabilen peptitlerden biri olan GBP1’in, AP enzimine eklenmesi sonucu ortaya çıkan recombinant proteinin mikro desenli veya düz altın yüzeylere belli bir noktadan (site-specific) tutunması gösterilmiştir. Ayrıca, GEPI’lerin uCP ve DPN gibi desenleme teknikleri kullanılarak yüzeye mikro/nano boyutlarda desenleri oluşturulmak suretiyle protein ve nanoparçacık arrayleri hazırlanmasında bağlayıcı molekül olarak kullanılabilecekleri gösterilmiştir. İki farklı anorganik yapıya bağlanan aminoasit dizileri içeren iki fonksiyonlu peptitlerin (Bi-GEPIs) kullanılması ile nanoparçacıların yüzeye immobilize (“Self-assembly” yoluyla) olmaları sağlanmıştır. Altın ve gümüş nanoparçacıklarının cam yüzeyine; silika nanoparçacılarının da altın yüzeyine bu peptitler aracığı ile tutunabildikleri gösterilmiştir. Ayrıca, makro büyüklükte düz bir yüzey yerine nano boyutlardaki silika parçacıkları da uygun Bi-GEPI kullanılarak altın nanoparçacıları ile dekore edilmiştir. GEPI’lerin nanoparçacık ve de prob molekülünü organize etmesinden yararlanarak elde edilen platformların bir uygulaması olarak, hibrid optik sensörler hazırlanmış ve uygun hedef moleküllerin algılamasında kullanılmıştır. Bu uygulamaların bir tanesinde, cam üzerine Bi-GEPI kullanılarak immobilize edilen altın nanoparçacıklar ve onların üzerine bağlanan 5GBP1-AP prob molekülünden oluşan sensör, hedef molekülü olan Anti-AP deteksiyonunda ~30 nM’ye kadar inebilmiştir. Protein ve nanoparçacıkların immobilizasyonu ve mikro/nano boyutlardaki organizasyonlarının sağlanması dışında, GEPI’ler, optik olarak aktif, hibrid nanoyapıların olışturulmasında da kullanılmış; silika nanoparçacıklarının etrafının altın ile kaplanmasını sağlamıştır. Sonuç olarak elde edilen bu parçacıkların LSPR λmaks’sında görünür bölgeden IR bölgesine kayma gözlenmiştir ki bu bölgede biyolojik materyaller ışığı çok az absorbe etmektedirler. Genel olarak bakıldığında bu doktora çalışmasında elde edilen sonuçlar, açıkça GEPI’lerin yeni, fonksiyonel ve farklı ölçeklerde platformların ortam koşullarında hazırlanmasında kullanılabilecek kapasitede olduğunu ve daha sonra bu platformların da protein mikro/nanoarray sistemler, biyosensörler, moleküler görüntüleme ve hedefleme gibi amaçlar için kullanılabileceklerini göstermektedir.
-
ÖgeAterosklerozda Mirna-126 Sinyal Yolağı Molekülleri İle İlişkili Anjiyogenik Mekanizmaların Araştırılması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-09-07) Zhmurov, Çiğdem Sezer ; Bermek, Hakan ; 10124323 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsKardiyovasküler hastalıklar, kalp ve kalp damarlarının, beyin damarlarının ve vücuttaki tüm di ˘ ger damarların hastalıkları olarak tanımlanırlar. Ateroskleroza baglı olarak ortaya çıkan kardiyovasküler hastalıklar arasında, koroner arter hastalıkları, serebro-vasküler hastalıklar, periferal arter hastalıgı ve hipertansif kalp hastalıgı bulunmaktadır. Dünya Saglık Örgütü tarafından 2014 yılında yayınlanan Kalp ve Damar Hastalıklarını Önleme ve Kontrolü Küresel Atlası verilerine göre, dünyada 2012 yılında gerçeklesmis olan 56 milyon ölümün 38 milyonu kardiyovasküler hastalıklar, kanser, kronik solunum yolu hastalıkları ve diyabet gibi bula¸sıcı olmayan hastalıklar nedeniyle meydana gelmistir. 2012 yılında kardiyovasküler hastalıklar nedenli ölümler, tüm dünyada birincil ölüm nedeni olup, tüm ölümlerin % 31'ini olu¸sturmustur. Tüm kardiyovasküler hastalıklar ile iliskili ölümlerin 7.4 milyonu koroner arter hastalıgına baglı olarak, 6.7 milyonu ise inme nedenli gerçeklesmistir. Türkiye Istatistik Kurumu tarafından yayınlanan Ölüm Nedeni Istatistikleri 2014 verilerine göre, kardiyovasküler hastalık kaynaklı ölümler, 2014 yılında gerçeklesmis olan tüm ölümlerin %40.4'ünü olusturarak, birincil ölüm sebebini teskil etmistir. Günümüzde hala tüm dünyadaki bir numaralı ölüm nedeni olan kalp ve damar hastalıklarının altında yatan temel mekanizma aterosklerozdur. Ateroskleroz dogumla baslayan geri dönüssüz bir süreç olsa da, ana risk faktörleri göz önüne alındıgında, aterosklerozun yol açtıgı kardiyovasküler hastalıklar büyük ölçüde önlenebilmektedir. Kalp ve damar hastalıgı risk faktörlerinin bazıları degistirilememektedir, ancak büyük çogunlugu kontrol edilebilmekte, tedavi edilebilmekte veya modifiye edilebilmektedir. Degistirilemeyen veya kontrol edilemeyen risk faktörlerinin basında ileri yas, erkek cinsiyet ve genetik etmenler gelmektedir. Öte yandan, yüksek kolesterol seviyeleri, hipertansiyon, obezite, diyabet, sigara kullanımı ve fiziksel inaktivite gibi risk faktörleri tedavi edilebilir ve modifiye edilebilir risk faktörleri olarak degerlendirilmektedir. Bu tez çalısmasında, karotis arter hastalarından elde edilmis olan aterosklerotik plak örnekleri kullanılmıstır. Ateroskleroza baglı ortaya çıkan arter hastalıgı, beyine kan götüren damarlar olan karotis arterlerdeki kan akısının tıkanıklıga baglı azalması sonucu meydana gelir. Beyindeki belirli bir bölgeye, karotis arterlerdeki tıkanıklıga baglı olarak kan akısı azaldıgında, o bölgede fonksiyon kaybı ve buna baglı olarak geçici iskemik atak olarak isimlendirilen semptomlar ortaya çıkar. Görme kaybı (Amaurosis fugax), konusmada bozukluklar, ekstremitelerde güçsüzlük hissi ve yüzde duyu kaybı bu semptomlardan bazılarını olusturmaktadır. Beyindeki bir bölgeye kan akısı aniden kesildiginde ise inme olarak adlandırılan durum meydana gelir. Karotis arter hastalıgının teshisi için, ultrason ve manyetik rezonans anjiyogram gibi görüntüleme tekniklerinden yararlanılmaktadır. Bu testler sayesinde, karotis arterlerde meydana gelen daralmanın, bir diger deyisle, stenozun varlıgı ve derecesi belirlenebilir. Asemptomatik ve semptomatik karotis arter hastalıgının ayrımı önem tasımaktadır. Asemptomatik hastalıkta, geçici iskemik ataklar veya inme olmaksızın, proksimal internal karotis arterde % 50–60 stenoz gözlemlenir. Asemptomatik hastalıgın ilerleyisini önlemek amacıyla, hipertansiyon, diyabet ve yüksek kolesterol gibi risk faktörlerinin tedavisi gibi invazif olmayan terapiler uygulanmaktadır. Ileri derecede stenozun (≥ %60) tedavisi için ise, karotis endarterektomisi ve karotis arterlere stent yerle¸stirilmesi gibi invazif terapiler tercih edilmektedir. Karotis endarterektomi operasyonu semptomatik hastalarda gelecek inme riskinin azaltılması amacıyla gerçeklestirilir. Bu cerrahi operasyon ile karotis arterlerde daralmaya neden olan aterosklerotik plaklar çıkartılır. Bu çalısmada, karotis arterlerinde %70'den daha yüksek derecede veya %50 ile %70 arasında degisen darlık bulunan 14 adet semptomatik hastadan endarterektomi esnasında çıkartılan aterosklerotik plaklar ve plak etrafındaki bölgeden elde edilen kontrol dokuları kullanılmıstır. Ateroskleroz, orta ve büyük çaplı arterlerin kronik, dejeneratif, immun-enflamatuvar hastalıgıdır. Pek çok genetik etmen ve çevresel etmenin etkilesimini içeren kompleks bir hastalık olarak tanımlanır. Dogum ile baslayan aterosklerotik süreç, yavas ilerleyerek, özellikle 40 ve 50 yas sonrasında koroner arter hastalıgı, inme ve periferal arter hastalıgı gibi rahatsızlıklara neden olur. Ateroskleroz enflamasyonun çok etkin oldugu bir süreç olup, arterlerin en iç tabakası olan intima tabakasının kalınlasması sonucu olusan lipid bakımından zengin materyal (aterom) ve konnektif doku (skleroz) ile karakterizedir. Aterosklerotik süreci açıklamaya yönelik gelistirilmis olan hipotezler arasında bulunan ve yaygın kabul gören "Hasara tepki" hipotezine göre, hiperlipidemi, hipertansiyon, çesitli metabolitler, enfeksiyonlar ve mekanik faktörler gibi potansiyel kaynaklar endotel hasarına sebep olarak aterosklerotik süreci baslatırlar. Ateroskleroz patogenezinde yer alan temel basamaklar, endotel disfonksiyonu, LDL kolesterolün oksidasyonu, monositlerin damar duvarına yapısması ve damar duvarından içeriye girisleri, monositlerin makrofajlara farklılasması ve makrofajların okside-LDL partiküllerini fagosite etmeleri sonucu köpük hücre olusumu, düz kas hücrelerinin intima tabakasına göç etmeleri ve proliferasyonları sonucu fibröz baslık olusumu, ilerlemis lezyonlardaki makrofajların apoptozuna baglı olarak plak nekrotik çekirdeginin olusumu, plak içerisinde neoanjiyogenez ve plagın yırtılması ile trombüs olu¸sumu olarak sıralanabilir. Kararsız plakların yırtılması sonucunda olu¸san trombüs, inme ve miyokard enfarktüsü gibi durumlara ve bu durumlara baglı olan sakatlıklara ve ölümlere yol açmaktadır. Trombüs olu¸sumu engellenebilir oldugu taktirde aterosklerozun çok daha iyi huylu seyreden bir hastalık olacagı pek çok çalısmada önerilmektedir. Ilerlemis aterosklerotik plakların içerisindeki yeni damar olusumuna yol açan moleküler mekanizmaların ara¸stırılması, bu tez çalısmasının odak noktasını olusturmaktadır. Anjiyogenez, var olan damarlardan yeni damar olusumudur. Hücrelerde anjiyogenezi kontrol eden temel sinyal yolakları vasküler endoteliyal büyüme faktörü yolagı ve Notch sinyal yolagıdır. Aterosklerotik plak içi anjiyogenezin aterosklerozun ilerleyisi ile olan iliskisi pek çok çalısma ile gösterilmistir. Bu nedenle, anjiyogenezle iliskili olan sinyal yolakları, plak içi anjiyogenezi önlemeyi amaçlayan terapiler için hedef teskil etmektedirler. Bu tez çalısması, vasküler endoteliyal büyüme faktörü yolagı ile iliskili anjiyogenik mekanizmaların rolünün ve mikroRNAlar gibi, bu yolak ile etkilesimde bulunan moleküllerin arastırılmasını amaçlamaktadır. MikroRNAlar (miRNAlar) küçük, tek-iplikçikli RNA molekülleridir. Genellikle 18-22 nukleotid uzunlugunda olan ve kodlama yapmayan bu RNAlar, gen anlatımını transkripsiyon sonrası seviyede düzenleyen önemli regülatör moleküller olarak görev yaparlar. MiRNAlar pek çok önemli biyolojik fonksiyon ve hücresel olayda görev alırlar. MiRNAların görev yaptıkları önemli hücresel prosesler arasında hücre proliferasyonu, metabolizma, apoptoz, senesens, tümör olusumu, damar olusumu ve gelisim gelmektedir. Anjiyogenezde çok önemli rolü olan ve hem embriyonik hem de yetiskin damar sisteminde anlatımı yapılan Egfl7, endotele spesifik iki adet mikroRNA olan miR 126-3p ve miR 126-5p'yi intronundan kodlar. MiR-126 sinyal yolagının anjiyogenezdeki rolünü ve ateroskleroz patogenezine katkısını ortaya çıkarmak amacı ile gerçeklestirilen bu çalısmada, miR 126-3p ve hedef genleri ile miR 126-5p ve Egfl7'nin ekspresyon seviyeleri 14 adet karotis arter aterosklerotik plak dokusu ve 14 adet kontrol dokusunda incelenmistir. Mir 126-3p hedef genleri miRNA hedef tahmin veritabanları olan TargetScan and miRTarBase kullanılarak elde edilmis, elde edilen bilgiler ve literatür arastırması sonucunda anjiyogenezde rolü olan ve vasküler endoteliyal büyüme faktörü sinyal yolagının negatif regülatörleri olan Spred1 and Pik3r2 genleri ile Egfl7'nin çalısılacak miR 126-3p hedef genleri olarak seçilmesine karar verilmistir. Ön biyoinformatik arastırmayı takiben, 14 adet karotis arter aterosklerotik plak ve kontrol dokusunun homojenizasyonu ve sonrasında elde edilen homojenizatlardan total RNA ve miRNA izolasyonları gerçeklestirilmistir. RNA izolasyonları sonucunda elde edilen total RNA ve miRNA'ların konsantrasyonları ve saflıkları spektrofotometrik yöntemle belirlenmis, ve RNA miktarları esitlenerek komplementer DNA (cDNA) reaksiyonları gerçeklestirilmistir. Elde edilen cDNA'lar kullanılarak gerçek zamanlı kantitatif PZR reaksiyonları yürütülmüs ve bu sayede plak ve kontrol dokularındaki Egfl7, Spred1, Pik3r2, miR 126-3p ve miR 126-5p rölatif ekspresyon seviyeleri ölçülmüstür. Gerçek zamanlı kantitatif PZR analizleri için, 2∆∆CT modelinin kullanıldıgı rölatif kantifikasyon stratejisinden yararlanılmıstır. Plak örneklerindeki tüm hedef gen ve miRNA ekspresyon seviyeleri kontrol örneklerindeki hedef gen ve miRNA seviyeleri ile karsılastırılmıs ve 18S ribozomal RNA (hedef genler için) ve U6 küçük nüklear RNA (miRNAlar için) endojen kontrolleri kullanılarak normalizasyon yapılmıstır. Data analizlerini takiben, istatistiksel analizler gerçekle¸stirilmistir. Plak ve kontrol dokularından elde edilen sonuçlar arasındaki farkın istatistiksel anlamlılıgı Student's t test ile arastırılmıstır. Kat farkı olarak ifade edilen gen ekspresyon verileri, hastaların demografik ve klinik bilgileri ile karsılastırılmıstır. Bu analizler için Chi-square ve Fisher's Exact testleri kullanılmıstır. Bu çalısmada, literatürden elde edilen bilgiler derlenerek, ilerlemis aterosklerotik hastalıga baglı olarak görülen anjiyogenez nedeni ile, Egfl7 ve miR 126-3p ile miR 126-5p'nin karotis arter aterosklerotik plaklarında, kontrollere göre up-regüle olacagı, buna karsılık miR 126-3p hedef genleri olan Spred1 ve Pik3r2'nin ekspresyon seviyelerinin plaklarda kontrollere göre azalmıs olacagı hipotezi ortaya konulmustur. Sonuçlara bakıldıgında, beklendigi üzere miR 126-3p ekspresyon seviyelerinin 11 adet plak örneginde, kontrollere göre yüksek oldugu bulunmus, miR 126-3p hedef genleri olan Spred ve Pik3r2'nin ekspresyon seviyelerinin kontrollere göre 8 ve 9 adet plak örneginde daha düsük oldugu gözlemlenmistir. Genel ekspresyon seviyesi göz önüne alındıgında, miR 126-3p'nin plaklardaki ekspresyonunun, kontrollere göre 2.14 kat arttıgı bulunmustur (p
-
ÖgeBacillus Subtilis’de Gntr Ailesine Ait Lutr Transkripsiyon Faktörünün Doğrudan Kontrolü Altındaki Genlerin Chıp Ve Emsa Yöntemleriyle Belirlenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-07-14) Avcı, Murat Kemal ; Karataş, Ayten ; 10079343 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsLutR transkripsiyon faktörü GntR familyasının bir üyesi olup B. subtilis'te lutR geni tarafından kodlanan global düzenleyici bir proteindir. lutR geni ilk keşfedildiğinde "yvfI" olarak adlandırılmış fakat laktat kullanımında görevli olduğu belirlendiğinde "lutR" (Lactate utilisation gene) adıyla tekrar adlandırılmıştır. B. subtilis LutR proteini, E. coli FadR regulatör proteini ile homologdur. LutR protein dizisi, GntR süperfamilyasının FadR alt familyasındaki farklı türlere ait ortologlarıyla da önemli homolojiye sahiptir. Ayrıca FadR benzeri proteinler birçok metabolik yolun regülasyonunda rol alırlar. GntR familyası DNA'ya bağlanmak için Heliks-Turn-Heliks (HTH) motifi kullanan regulator proteinlerden oluşan bir HTH-tip protein süperfamilyasıdır. Farklı çalışmalardaki CDD analizlerinde, GntR familyasında oldukça yaygın olan "FadR C-terminal ligand bağlanma bölgesi"nin, LutR C-terminalinde de yer aldığı tespit edilmiştir (PFAM 07729). Buna ek olarak LutR N-terminalinde bulunan 44 amino asitlik bölge ile GntR wHTH domain arasında önemli bir benzerlik olduğu belirlenmiştir (PF00392). GntR familyasına ait üyeler N-terminalde HTH motifi içeren bir DNA bağlanma domaini (DBD) ve C-terminalinde bir efektör bağlanma veya oligomerizasyon (EBD) domaininden oluşurlar. Bu proteinler DNA'ya bağlanmak için kullandıkları heliks-turn-heliks (HTH) motifi ile karakterize edilirler. DNA-bağlanma domaininin dışındaki bölgeler çok farklılık gösterirken, küçük bir β-tabaka ile beraber 3-heliksli bir çekirdekten oluşan DNA-bağlanma bölgesi bütün GntR familyasında oldukça iyi korunmuştur. Bacillus genusu üyeleri arasında antibiyotik üreten ana suş B. subtilis'tir. Yaklaşık 30 kadar antibiyotik üreten B. subtilis'e ait antibiyotikler oldukça farklı antimikrobiyal aktivite göstermektedir. Bunlardan bazıları gram pozitif, bazıları gram negatif mikroorganizmalara etki ederken, bazıları daha geniş spektrumda etkilidir. B. subtilis genomunda yaklaşık 350 kb'lık bir bölge antibiyotikleri kodlayan genleri içermekte olup, toplam genomun %4-5'ini oluşturmaktadır. Yapısal olarak oldukça değişken olan B. subtilis antibiyotiklerinin en önemli özelliklerinden biri fonksiyonel açıdan sadece antimikrobiyal ajan olarak görev yapmayıp, ayrıca hücre morfolojisi ve fizyolojisinin düzenlenmesinde de etkili olmalarıdır. Basilisin [L-alanine-(2.3-epoxycyclohexanone-4)-L-alanine] non-ribozomal yolla sentezlenen dipeptit yapıda bir antibiyotiktir. B. subtilis'te basilisin biyosentezinden polisistronik bir operon olan bacABCDEF (eski adı ywfBCDEFG) ve monosistronik bir gen olan ywfH sorumludur. Basilisin, N-terminalde L-alanin ve C-terminalde non-proteinojenik L-antikapsin rezidülerinden oluşur. Antibiyotik etkisinin görülmesi için L-antikapsin rezidüsünün serbest kalması gerekir. Bu, ancak basilisin bir peptidaz tarafından proteoliz edildiğinde gerçekleşir. Basilisin bir peptidaza maruz kalmadan önce bir peptit permeaz tarafından sitosöle transfer edilir ve L-antikapsin burada bir peptidaz tarafından serbest bırakılır. Dipeptit antibiyotik basilisin biyosentezi; B. subtilis'de global düzenleyiciler olarak görev yapan ComA, SpoOA, AbrB, ScoC, ve CodY proteinlerinin kontrolü altındadır. Bu kompleks regülasyon ağına, GntR tip transkrisiyon faktörü LutR'ında katıldığı belirlenmiştir. Akabinde L-laktat kullanımından sorumlu lutABC (eski adı yvfV-yvfW-yvbY) operonunun da LutR'ın kontrolü altında olduğu bulunmuştur. Son olarak, grubumuz tarafından yürütülen çalışmalar neticesinde; LutR ın, L-laktak kullanımı ve basilisin biyosentezinin yanı sıra, karbonhidrat kullanımı ve transportu, nitrojen metabolizması, fosfat alımı, yağ asidi ve fosfolipit biyosentezi, protein sentezi ve translokasyonu, hücre duvarı metabolizması, enerji üretimi, mobil genetik element transferi, fajla ilgili genlerin indüksiyonu, sporilasyon, sporilasyonun gecikmesi ve kanibalizm ve biyofilm oluşumu gibi pek çok farklı fizyolojik ve metobolik süreçte görev yapan birbirinden bağımsız birden fazla geni/operonu kontrol eden pleiotropik bir global regülatör olduğu bulunmuştur. N-terminalinde helix-turn-helix motifi içeren diğer bir protein SinR'dır. SinR proteini B. subtilis'te geç üreme sürecinde kompetans ve motilite gelişimini aktive ederken sporilasyon ve ekzoproteaz üretimini inhibe ederek çift yönlü düzenleyici rol sergilemektedir. SinR, Spo0A gibi pleitropik bir düzenleyici anahtar gibi hareket eder ve adaptif cevapların gelişmesini sağlayarak gereksiz olan potansiyel diğer cevapları engeller. lutABC operonu, hem LutR hem de SinR proteininin kontrolü altındadır. LutR ve SinR proteinleri birlikte hareket ederek lutABC operonunu baskılamaktadırlar. Biyofilm olarak bilinen uzun hücre zincirlerini bir arada tutan ekstrasellüler matriksten sorumlu epsA-O ve yqxM-sipW-tasA operonlarına ait 18 genin de SinR tarafından baskılandığı bilinmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı LutR transkripsiyon faktörünün, B. subtilis genomunda, doğrudan bağlanarak düzenlediği genlerin belirlenmesidir. Bu amaçla E. coli pQE60::lutR suşunda heterolok olarak üretilen ve saflaştırılan LutR proteini ile B. subtilis PY79 suşuna ait kromozomal DNA kullanılarak, amacımıza göre modifiye ettiğimiz in vitro kromatin immünopresipitasyon (ChIP) yöntemi uygulanmıştır. Sonrasında, LutR proteininin, uygulanan modifiye-ChIP yöntemi ile yakalanan aday genlere doğrudan bağlandığını doğrulamak için EMSA yöntemi kullanılmıştır. In vitro olarak doğrulanan söz konusu etkileşimlerin, gen ifadesi üzerinde pozitif veya negatif yöndeki etkisini belirlemek amacıyla da, ayrıca RT-qPCR yönteminden yararlanılmıştır. ChIP yöntemi kullanılarak yapılan bu çalışmada LutR proteininin doğrudan kontrol ettiği genlerden yuxO (comB, comAB) geni belirlenmiştir. Bunlara ilaveten, Dr. Öykü İrigül-Sönmez'in doktora tez (2012) çalışması kapsamında lutR geninin aşırı ifade edildiği, PY79 (amyE::Pspac::lutR lutR::Tn10::spc) suşunda gerçekleştirilen mikroarray analizleri sonucunda, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB genlerinin, LutR'ın direk kontrolü altında olabileceği belirlenmiştir. Bu bulguların kesinlik kazanması için bu tez kapsamında uygulanan EMSA analiz sonuçları, söz konusu lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB genlerinin, direk LutR proteini tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Bunlara ek olarak, grubumuz tarafından sürdürülen daha önceki farklı araştırmaların sonuçları, SinR global regülatör proteinininin, test ettiğimiz LutR'ın direk kontrolü altında bulunan tüm genlere bağlanma kapasitesinin bulunduğunu göstermiştir. Bu bilgi doğrultusunda tez kapsamında yapılan EMSA analizlerinde LutR ve SinR proteinleri birlikte kullanılarak, LutR ve SinR'ın birlikte düzenledikleri olası yeni genlerin aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda yapılan EMSA analizleri sonucunda; LutR ve SinR proteinlerinin yuxO, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB gen transkripsiyon seviyelerini birlikte düzenledikleri belirlenmiştir. Son olarak, deneysel analizlere paralel bir şekilde, karşılaştırmalı in silico analizler ve karakterizasyon çalışmalarıyla LutR proteinine ait biyoinformatik verilerin elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla iki analiz yolu takip edilmiştir. İlk analiz yolunda, çeşitli biyoinformatik araçlar yardımıyla farklı türlere ait LutR proteinlerinin fizikokimyasal, yapısal ve filogenetik özellikleri incelenmiş ve LutR'ın türler arasındaki benzerlik ve farklılıkları ortaya çıkarılmıştır. İkinci analiz yolunda ise sadece B. subtilis 168 suşuna ait LutR proteininin, kristallografik analizleri tamamlanmış ve yapısı iyi bilinen GntR-HTH-tip transkripsiyon faktörleri FadR ve YvoA ile PyMOL programı yardımıyla yapısal olarak karşılaştırılması yapılmıştır. Ayrıca bu tez çalışmasında kullanılan ChIP yöntemi için oluşturulan prosedür, prokaryotik sistemlere yönelik olması ve antikor kullanılmaksızın uygulanması açısından metodolojik bir yenilik sunmaktadır.
-
ÖgeBakteriyel Biyofilm Oluşumunu Engellemeye Yönelik Enzim Bazlı Kaplama Yöntemlerinin Geliştirilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-07-27) Sert, Abdullah ; Karagüler, Nevin Gül ; 10081660 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBiyofilm, canlı yada cansız herhangi bir yüzeye tutunarak mikrobik kökenli polimerik yapıya gömülü kalan mikroorganizma topluluğu olarak tanımlanabilir. Biyofilm oluşumu mikroorganizmaların yaşam alanları içindeki bir yüzeye teması ile başlar ve salgıladıkları çeşitli ekstrasellüler biyopolimerler sayesinde metal, plastik, medikal implant, hücre dokusu gibi çok farklı yüzeylere bağlanabilirler. Doğada var olan biyofilm yapıları genellikle farklı birçok mikroorganizma türünün oluşturduğu, biyopolimerler ile çevrilmiş heterojen bir yapıdır ve bu yapı biyofilmi oluşturan mikroorganizmalara çevresel koşullardaki değişime adaptasyon kolaylığı, antimikrobiyal kimyasallara karşı dayanıklılık gibi çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Aynı zamanda bu katman toksik kimyasalların ve antibiyotiklerin geçişini engelleyerek biyofilm yapısındaki mikroorganizmalara önemli avantajlar da kazandırmaktadır. Hücre katmanları arasında bulunan su kanalları ise biyofilmin gelişmesinde hayati öneme sahiptir. Mikroorganizmalar ihtiyaç duydukları besinlere bu su kanalları sayesinde erişirken, atıkların uzaklaştırılması da yine su kanalları sayesinde kolaylaştırılır ve mikroorganizmaların sinyal moleküller aracılığı ile iletişim kurabilmeleri için de kanal görevi üstlenirler. Biyofilm oluşumunun istenmeyen bölgelerde gerçekleşmesi insan sağlığını ve endüstriyel verimliliği olumsuz olarak yoğun bir şekilde etkilemektedir. Biyofilm kaynaklı insan sağlığı problemleri, içme suyu kalitesindeki düşüş ve enerji üretim verimliliği gibi birçok konuda biyofilm oluşumunun verdiği hasarların maliyeti milyar dolarları bulmaktadır. Biyofilm oluşumuna, dental yüzeyler, gıda endüstrisindeki üretim bandındaki kontaminasyonlar ve havalandırma sistemleri gibi birbirinden çok farklı sistemlerde sıklıkla karşılaşılmaktadır. Hem insan ve toplum sağlığı hem de ekonomik açıdan yaratmış olduğu zararlı etkileri nedeniyle, yüzey üzerinde mikrobiyal birikimi engelleyebilecek veya en azından büyümesini ve yayılmasını durdurabilecek yöntemlerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar son yıllarda yoğun olarak yürütülmektedir. Biyofilm sistemlerinin, tehlikeli atıkların işlenmesi ve değerlendirilmesi, endüstriyel atık sularının filtrelenmesi, yeraltı sularının kontaminasyondan arındırılması gibi kullanım alanlarının bulunması ile birlikte, endüstriyel ve biyomedikal uygulamalarda biyofilm oluşumunun, ürün kontaminasyonu, enerji kaybı ve medikal enfeksiyona sebep olmak gibi birçok negatif etkisi vardır. Mikroorganizmaları bertaraf etmek için kullanılan geleneksel antibiyotik ve dezenfektanlar sıklıkla biyofilm yapısı üzerinde yeterli etkinliğe sahip olamamaktadır. Biyofilm yapısını bertaraf etmek için bu kimyasalların yüksek dozda kullanımı, biyomedikal uygulamalarda engel teşkil etmekte, endüstriyel sistemlerde ise çevresel sorunlara yol açmaktadır. Literatürde farklı endüstriyel ve medikal alanlarda kullanılan malzemelerin, cihazların ve ekipmanın yüzeyleri üzerinde biyofilm oluşumunu önlemeye yönelik çalışmalara rastlanılmaktadır. Bu anlamda en yakın çalışma, kateter manşetlerinin hidrojel ile kaplanarak mikroorganizmaların üremesini engelleyecek şekilde fiziksel ve kimyasal özelliklerinin değiştirilmesine yöneliktir. Bu uygulama mikroorganizmaların yüzeye bağlanma kabiliyetini düşürmesine rağmen, hidrojelin yüzeye homojen bir şekilde tatbik edilmesi oldukça zor bir işlemdir. Bu alanda bir diğer çalışmada ise, antimikrobik etkinliği bilinen gümüş iyonları ile kateter manşetleri kaplanmış, fakat gümüş iyonlarının zamanla ortama difüze olması, kaplamanın antimikrobik etkinliğini kaybetmesine neden olmuştur. Kaplama malzemesi olarak antibiyotiklerin kullanılması ise mikroorganizmaların kullanılan antibiyotiğe karşı direnç kazanmasına ve uygulamanın etkinliğini kaybetmesine neden olmaktadır. Yüzey üzerinde biyofilm oluşumunu engellemek için kullanılan alternatif yaklaşımlardan bir tanesi de enzimlerin kullanılmasıdır. Biyofilm oluşumunu engellemek için kullanılan toksik kimyasallar ile kıyaslandığında enzimlerin önemli bir üstünlüğü, enzimlerin çevreye zarar vermemesidir. Farklı tür mikroorganizmalar belirli bir yüzeye bağlanmak için farklı polimerler kullanmalarına rağmen yapılan çalışmalarda ticari olarak satılan proteazların biyofilm oluşturan mikroorganizmaların yüzeye bağlanma olasılığını düşürdüğü tespit edilmiştir. Ayrıca lizozim ve Polietilen glikolün kovalent olarak yüzeye bağlandıklarında yüzeyin antibakteriyel ve antiadhezif özellikler gösterdiği tespit edilmiştir. Çalışmada kullanılan mikroorganizma literatürde biyofilm çalışmalarında sıkça kullanılan mikroorganizmalardandır. Medikal cihazlar da dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik birçok farklı yüzeye bağlanabilen ve biyofilm oluşturduğu bilinen gram-negatif bir bakteri olan Pseudomonas aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Tez çalışmalarında, mikroorganizmaların endüstriyel ve tıbbi alanlarda sıkça kullanılan yüzeylere bağlanarak biyofilm oluşturmalarını engellemek hedeflenmiştir. Çalışmanın ilk ayağında mevcut kaplama yöntemleri göz önünde bulundurularak, çalışmanın amacına uygun bir kaplama stratejisi belirlenmiştir. Sol-gel yönteminin stabilitesi, oda şartları altında uygulunabilirliği, inert özellikte olması ve ayrıca yüzey üzerinde fonksiyonel grupların oluşmasını sağlayabiliyor olmasından dolayı kaplama aşamasında kullanılması uygun görülmüştür. Sol-gel kaplama sayesinde yüzeyde oluşan fonksiyonel amin grupları doğrudan enzim immobilizasyonu için kullanıldığı gibi alternatif bir yöntemin de geliştirilmesiyle yüzeyde oluşturulan fonksiyonel karboksil grupları da enzim immobilizasyonu için kullanılmıştır. Bu amaçla kullanılan poli-akrilik asit molekülleri yüzeye kovalent olarak bağlanmış ve bunu takiben enzim immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Uygulanan her iki kaplama tekniğinin de enzimlerin yüzeye aktif biçimde bağlanmasını mümkün kılması karşılaştırma açısından ekstra bir avantaj sağlamaktadır. Çalışmalar boyunca gerçekleştirilen tüm kaplama aşamaları Fourier Transform Infrared Spektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu yöntemleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Sol-jel kaplanan yüzeyler üzerine kovalent olarak bağlanmış enzimlerin aktiviteleri, yapılan spektrofotometrik çalışmalarla test edilmiş ve anti-biyofilm etkinlikleri konfokal taramalı lazer mikroskobu aracılığıyla yerinde görüntülenmiştir. Çalışmalarda kullanılan yüzeyler ise medikal cihazların yapımında ve endüstriyel cihaz ve malzemelerin üretiminde sıklıkla kullanılan paslanmaz çelik yüzeylerdir. Bu yüzeylerin hiçbir muameleye maruz kalmadığı ilk hallerinden enzim kaplanmış son hallerine kadar tüm adımları karakterizasyon çalışmaları ile incelenmiştir.
-
ÖgeBiomimetik Yaklaşımı İle Peptid Bazlı Biyomalzemelerin Medikal Uygulamalar İçin Geliştirilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-12-16) Yazıcı, Hilal ; Tamerler, Candan ; 452453 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Geneticsİmplantasyon ve doku mühendisliği alanlarında, hücre davranışlarının ve biyolojik cevabın organik ve anorganik ara kesitlerinde kontrol edilebilmesi önemli bir sorundur. Konakçı organizmanın implant malzemelere vereceği biyolojik cevabı etkileyen faktörlerden çoğunluğu anorganik malzemenin yüzey özellikleri ile ilgilidir. İmplant doku entegrasyonu hücre tutunmasının, hücre çoğalmasının ve biyomineralizasyonun iyileştirilmesi, bakteriyel enfeksiyonun önlenmesi gibi faktörlere bağlı olup, bu faktörler yüzey özellikleri değiştirilerek kontrol edilebilmektedir. Yüzey kimyasinin biyolojik olarak aktif moleküllerin immobilzasyonu ile değiştirilmesi implant-doku etkileşiminin geliştirilmesinde alternatif bir yol oluşturmaktadır. Bu tür yüzey modifikasyonlarında, sadece belli özellikteki malzemeye özgü, spesifik fonksiyonel gruplar, sentetik yollar gerektiren geleneksel immobilizasyon yöntemleri çok sık uygulanır. Halen kimyasal ajanlara alternatif olabilecek biyouyumlu, biyomoleküllerle oluşturulan bileşimlerde fonksiyonelliği koruyabilecek yeni bağlayıcı moleküllere ihtiyaç vardır. Anorganik yüzeylere bağlanan peptitler (GEPI) implant yüzeylerde yüzey tanıma özelliklerinden dolayı gerçek biyolojik fonksiyonelleştirmesi yaparak implant yüzeye bağlanıp montaj olabilirler. Bu tez çalışmasında, ilk olarak titanyum diş implant yüzeyine (cp Grade4) ilgisi olan peptitleri hücre yüzey gösterim teknolojisi ile elde ettik ve sonrasında bağlanma ilgisi, özgünlük, moleküler yapı ve sitotoksisite açısından tam olarak karakterize ettik. Sonrasında, peptilerin biyolojik yüzey modifikasyonları için moleküler bağlayıcı olarak potensiyel uygulanabilirliğini osseointegrasyon için kritik olan üç farklı örnekle gösterdik: hücre bağlanmasını iyilestirmek üzere RGD ile kombinasyonu, bakteriyel enfeksiyonu önlemek üzere için antimikrobiyel peptit ile konjugasyonu, yüzeyde mineralizayon olusturabilmesi için mineralizasyon özelliği olan peptitle konjuasyonu. Bu tezin kapsamında, GEPI`lerin moleküler bağlayıcı olarak hücre-yüzey arasındaki ilişki ve mineralizayonun kontrolünde dikkat çekici potensiyeli ara kesitte yüzey ile oluşturabildikleri etkileşimleri açısından gösterilmiştir.
-
ÖgeBiyonanoteknoloji Uygulamaları İçin Genetik Mühendisliği İle Oluşturulan Anorganiklere Özgül Peptidlerin Kinetik Ve Termodinamik Analizleri(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2009-12-04) Şeker, Urartu Özgür Şafak ; Tamerler, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışma kapsamında genetik mühendisliği kullanılarak oluşturulmuş anorganiklere seçici olarak bağlanan peptidlerin (GEPI) kinetik ve termodinamik araçlarla moleküler tanıma özellikleri incelenmiştir. Faj gösterim ya da hücre yüzey gösterim teknikleri kullanılarak seçilen GEPI moleküllerinin karakterizasyonu yapılmıştır. GEPI’lerin moleküler karakterizasyonu, adsorpsiyon kinetikleri ve termodinamikleri, ikincil yapı çalışmaları ile bir bütünlük içerisinde gerçekleştirilmiştir. GEPI’lerin bağlanma kinetik ve termodinamikleri yüzey plazmon rezonans spektrometresi ve kuvartz kristal mikroterazi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Altın , silika ve platin yüzeylere bağlanan peptidlerin sadece afiniteleri değil, aynı zamanda malzeme seçicilikleri de incelenmiştir. Bir durum çalışması olarak, altın yüzeye bağlanan peptid için yapı-aktivite ilişkisi de, termodinamik bir bakış açısı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. GEPI’lerin, moleküler karakterizayonu takiben, moleküler bağlayıcı ve malzeme sentezleyicisi olarak kullanımları araştırılmıştır. Bu bağlamda, GEPI’ler, moleküler bağlayıcı olarak, alkali fosfataz enziminin altın, silika ve platin yüzeylerine immobilizasyonu ve yarı iletken nanotaneciklerin LED aygıtlarının yüzeylerine tutuklanması çalışmalarında, moleküler tutucu olarak ise, Huntington hastalık etmen proteininin fibrilasyonunun gerçek zamanlı olarak incelenmesinde kullanılmıştır. Ayrıca, morfoloji kontrollü silika sentezi için GEPI’lerin malzeme yapıcı olarak kullanımları gösterilmiştir. GEPI’lerin birçok değişik biyo-nano teknolojik uygulamalarda moleküler bağlayıcı olarak kullanımları, nano- biyo- arakesitindeki zorlukları aşabilmek için uygun moleküler araçlar olduğunu ortaya koyacak şekilde sunulmuştur.
-
ÖgeCoriolopsis Polyzona Mucl 38443'ten Lakkaz Kodlayan Bir Cdna'nın Klonlanması Ve Pichia Pastoris’te İfade Edilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017-02-22) Pinar, Orkun ; Karataş, Ayten ; 10140721 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsLakkazlar (EC 1.10.3.2), birçok farklı mantar, bitki, bakteri ve böcek türlerinden elde edilebilen, fenolik olan ve fenolik olmayan lignin içerikli bileşiklerin ve çevre kirleticilerin oksidasyonunu katalize edebilen, çoklu bakır oksidazların protein süper ailesinin bir üyesidir. Bugüne kadar 120’den fazla lakkaz enzimi fungal kültürlerden izole edilerek, biyokimyasal ve katalitik özellikleri aydınlatılmıştır. Bu noktada, tıbbi tanı kitleri, biyoremediasyon (pestisit ve herbisit gibi maddelerin temizlenmesi), endüstriyel atıkların detoksifiye edilmesi (kâğıt, tekstil ve petrokimya endüstrilerinden kaynaklı), içeceklerin işlenmesi (şarap, meyve suyu ve bira), şeker pancarı pektininden jel oluşturulması, askorbik asit belirlenmesi, biyosensör yapısında belirleme için kullanılması ile kozmetik ve ilaç malzemesi olarak kullanılması gibi farklı biyoteknolojik prosesler açısında önem taşımaktadırlar. Lignoselülozların parçalanması dünyanın ekosisteminde, özellikle orman ekosistemlerinde yer alan organik karbonların yüzde beşini oluşturan ölü odunsu yapılardan sağlanan karbon geri kazanımının gerçekleşmesi için kritik bir öneme sahiptir. Küresel karbon döngüsü için çok önemli bir rol oynayan lignoselülozik kompleksleri degrede edebilme özelliğine sahip çoklu enzim sistemine sahip tek mikroorganizma tipi beyaz çürükçül mantarlardır. Özellikle beyaz çürükçül Basidiyomisetler, tüm odunsu lignoselüloz bileşiklerinin yumuşak ve sert odunsu kısımlarının çürütülmesini sağlayan hücre dışına salgılanan lakkaz benzeri özel oksidatif enzimler üretirler. Askomiset ve Döteromisetler ile karşılaştırıldığında, beyaz çürükçül Basidiyomisetler ligninin parçalanması konusunda ön plana çıkmaktadır. Collybia velutipes, Fomes annosus, Fomes fomentarius, Lentinus edodes, Phanerochaete chrysosporium, Pholiota mutabilis, Pleurotus ostreatus, Poria subacida, Sporotrichum pulverulentum, Trametes sanguinea ve Trametes versicolor türleri bilinen en iyi lakkaz üreticileri ve lignin parçalayıcılarını oluşturmaktadır. Basidiomycete Coriolopsis polyzona, Coriolaceae ailesine ait beyaz bir çürük mantar olup, yüksek verimli bir ligninolitik enzim üreticisidir. Heterolok ekspresyon sistemlerinin kurulması, enzim özelliklerinin iyileştirilmesini sağlayacak, protein mühendisliği çalışmalarının önünü açacak önemli bir basamaktır. Ayrıca, farklı kaynaklardan yeni lakkazların elde edilmesini kapsayan çalışmalar, endüstride yeni kullanım alanine sahip ve/veya düşük maliyetli yeni lakkazların yakalanmasını sağlaması açısından, önemli bulunmaktadır. Bu araştırmada, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşundan izole edilen ve Cplcc1 olarak adlandırılan yeni bir lakkaz genine ait cDNA, Pichia pastoris’de heterolok olarak eksprese edilmiş ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Öncelikle, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 ait, kısmi lakkaz cDNA kütüphanesi kurulmuştur. Bu kütüphaneden yaklaşık 52 klona ait parça lakkaz nükleotit dizileri elde edilmiş, birbirleri ile benzerlikleri ClustalW2 ile “Principal Coordinates Analysis (PCoA) pogramları ile karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak kurulan kısmi lakkaz cDNA kütüphanesinde, sadece 3 farklı kısmi lakkaz cDNA dizisinin bulunduğu belirlenmiş ve Cplcc1, Cplcc2 ve Cplcc3 olarak isimlendirilmişlerdir. Bulunan bu kısmi lakkaz cDNA dizileri, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) veri tabanına önceden yüklenmiş olan ve lakkaz kodlayan diziler ile karşılaştırıldığında, yaklaşık % 80 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Oluşturulmuş olan kısmi cDNA kütüphanesinde, belirlenen bu kısmi üç cDNA dizisi arasında da, en sık Cplcc1 cDNA dizisine rastlanmıştır. Bu sonuca dayanarak, Cplcc1 lakkaz geninin, Coriolopsis polyzona MUCL 38443’de en baskın ifade edilen lakkaz geni olduğu anlaşılmıştır. Cplcc1 geninin 1563 bç uzunluğuna sahip ve 520 amino asit kodlayan bir açık okuma çerçevesi ile 20 amino asitlik sinyal peptitini içerdiği belirlenmiştir. Cplcc1 cDNA dizisi “Trametes hirsuta laccase A mRNA” dizisi ile % 82 benzerlik gösterirken, Cplcc1 genine ait çıkarılmış amino asit dizisi ise benzer şekilde “Trametes hirsuta laccase A” (AIZ72721.1) ile % 88 benzerlik göstermiştir. CpLcc1 lakkazına ait moleküler ağırlık değeri, teorik moleküler ağırlık hesaplama aracı ile yaklaşık 54 kDa olarak (Compute pI/MW, ExPasy) hesaplanmıştır. Buna ek olarak, Cplcc1 geninin boyutu 2106 bç uzunluğunda ve % 57 GC içeriğine sahip olduğu, 51-58 bç uzunluğunda on adet intron ve beş adet potansiyel N-glikosilasyon bölgesini içerdiği tespit edilmiştir. Bununla birlikte, Cplcc1 geni Trametes hirsuta lakkaz geni (Lac) (EU492907.1) ile % 76 benzerlik göstermiştir. Cplcc1 cDNA ve genomik DNAsına ait nükleotit sekansları GenBank veri tabanına sırasıyla KT802746 ve KT802747 erişim numarası ile kaydedilmiştir. Ayrıca, tam boyuttaki Cplcc1 cDNAsı maya mekik ifade vektörü olan pPICZC’ye kendi sinyal dizisi ile birlikte başarılı bir şekilde klonlanmış ve metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris’te eksprese edilmiştir. En iyi kültür koşullarını belirlemek amacıyla, metanol konsantrasyonu, bakır konsantrasyonu, L-Alanin konsantrasyonu ve büyüme sıcaklığının etkisi araştırılmıştır. Optimizasyon çalışmaları sonucunda, optimum koşullar, BMGY/BMMY besiyeri içerisinde % 1,5 metanol, 0.8mM CuSO4 ve % 0,6 L-Alanin eklenerek, 250 rpm ve 28°C olarak belirlenmiştir. Elde edilen en yüksek rekombinant CpLcc1 lakkaz aktivitesi 800 U l-1 olarak bulunmuş ve optimizasyon çalışmaları boyunca lakkaz aktivitesi 9,8 kat arttırılabilmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonrasında, rekombinant lakkazın kısmi olarak saflaştırılması, amonyum sülfat çöktürmesi, Q-sepharose anyon değişim ve Superdex-75 boyut kromatografisi adımları ile gerçekleştirilmiştir. Kısmi saflaştırılmış rekombinant CpLcc1 lakkazına ait rölatif moleküler ağırlık değeri SDS-PAGE analizi ile, teorik moleküler ağırlık değeri ile benzer biçimde 54kDa olarak ayrıca bulunmuştur. Bu değer önceden raporlanmış çalışmalarla uygunluk göstermektedir. Rekombinant lakkaz aktivitesine ait maksimum değer 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonik asit) (ABTS) substratı için optimum sıcaklık olan 70°C ve optimum pH 3.0’de gözlemlenmiştir. Diğer yandan rekombinant CpLcc1 30°C’de bir haftadan fazla stabil kalabilirken, yarılanma ömrü ise 8 saatten yüksektir. Ayrıca 40°C ve 50°C’deki yarılanma süresi sırasıyla 8 saat ve 30 dakika iken, enzim aktivitesi 60°C, 70°C ve 80°C’lerde ise dakikalar içerisinde ani düşüş göstermektedir. Km, Vmax, kcat ve kcat Km-1 değerleri sırasıyla 0,137 mM, 288,6 μmol d-1 l-1, 5.73×105 d-1 and 4.18×106 d-1 mM-1, olarak hesaplanmıştır. Sodyum azid, L-sistein ve SDS maddeleri ise olağan inhibitörler olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışma ile ilk kez, Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşunda ifade edilen lakkaz genleri belirlenmiş, bunların arasından CpLcc1 olarak adlandırılan lakkaz enziminin P. pastoris mayasında heterolok üretimi, kısmi saflaştırılması başarı ile gerçekleştirilmiş ve biyokimyasal karakterizasyonu tamamlanmıştır.
-
ÖgeÇeşitli Karbonhidratların Mikrobiyal Yakıt Hücrelerinde Elektrik Üretimine Etkileri(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2008-11-19) Çatal, Tunç ; Bermek, Hakan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışmada, lignoselülozik biyokütlelerin asit hidrolizatlarında yaygın olarak bulunan monosakkaritlerden, disakkaritlerden, şeker alkollerinden direkt olarak elektrik üretimi, hava-katot mikrobiyal yakıt hücreleri kullanılarak araştırılmıştır. Başlıca on iki monosakkariti, iki disakkariti ve altı şeker alkollerini kapsayan karbon kaynakları ile elektrik üretimi gözlenmiştir. Sodyum asetat ile zenginleştirilmiş karışık bakteri kültürü, test edilen bütün substratlara kolayca adapte olmuştur. Yeni karbon kaynağına adaptasyon için gerekli süre substralar için farklılık göstermiştir. Test edilen substratlar için elde edilen en yüksek güç yoğunluğu 1262±5 mW m-2 ve 2763±38 mW m-2 arasında bulunmuştur. Kolombik yeterlik yüzde 10-34 idi. Test edilen substratlar için, en yüksek volt eldesi ve substrat konsantrasyonu arasında ilişki 120 ohm dış dirençte doygunluk kinetiği sonuçları ile uyumlu olduğu görülmüştür. Test edilen karbonhidratlar için yüzde 71’nin üzerinde kimyasal oksijen talebinde azalma sağlanmıştır. İki furan türevi ve sekiz fenolik bileşiğin araştırılması yapılmış, 2-furaldehit, asetofenon ve 3-4-dimetoksibenzil alkol’ün voltaj üretimi üzerine güçlü inhibitor etki gösterdiği saptanmıştır. Test edilen çam odun tozu hidrolizatının elektrik üretiminde karbon kaynağı olarak kullanılabileceği keşfedilmiştir. Monosakkarit karışımlarının mikrobiyal yakıt hücrelerinde tercihli kullanılarak elektrik üretimine yol açtığı ve karboksilik asit olarak yan ürünler oluşturulduğu saptanmıştır. Çalışmada ayrıca çeşitli operasyonel parametrelerin araştırılması yapılmıştır. Karbon kaynaklarının biofilm üzerinde mikrobiyal çeşitliliği önemli olarak etkilediği saptanmıştır. Çalışmada ayrıca, elektrik üretimi üzerine pH etkisi araştırılmış ve önemli bir faktör olduğu bulunmuştur. Bu çalışmanın sonuçları, lignoselülozik maddelerden türevli monosakkaritlerin, disakkaritlerin, şeker alkollerinin ve odun türevli maddelerin ön muamele ile mikrobiyal yakıt hücreleri için uygun birer karbon kaynağı olabileceklerini göstermiştir.
-
ÖgeDamar Doku Mühendisliği Amacıyla Kordon Kanı Mezenkimal Hücrelerinden Damar Duvarı Endotel Hücre Farklılaşması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-04-11) Omay, Pınar Hüner ; Bermek, Hakan ; 10106738 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBatı ülkelerinde, küçük ve orta boyutlu kan damalarını etkileyen kardiyovasküler hastalıklar en başta gelen ölüm nedenidir. Amerika’da koroner arter hastalıklar %54 ten daha fazla oranda kardiyovasküler ile ilişkili ölümlere neden olmaktadır. Avrupa Kardiyovasküler Hastalık İstatistiklerine göre, kardiyovasküler hastalıklar Avrupa’da 4 milyon, Avrupa Birliği’nde 1,9 milyon ölüme neden olmaktadır. Son zamanlarda, sentetik greftlerin kullanımı (ePTFE ve Dacron gibi) kan damarı benzeri yapıların geliştirilmesine odaklanmıştır. Bununla birlikte, 6 mm’den küçük damar greftleri erken tromboz gelişiminden dolayı damar değişimlerinde yetersiz olmaktadır. Aynı zamanda bu materyaller düşük büyüme potansiyeline ve uzun vadede stenoz, tromboembolizm, kalsiyum birikimi ve enfeksiyona neden olmaktadır. Bu nedenle, doku mühendisliği kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde yeni ve umut vadedici bir yaklaşımdır. Doku mühendisliği mühendislik ve yaşam bilimlerini bir araya getiren interdisipliner bir alan olarak tanımlanmaktadır. Amacı biyoloji ve mühendislik stratejilerini kullanarak organ ve doku fonksiyonlarının iyileştirilmesi ile klinik problemlerin çözülmesidir. Doku mühendisliğinin ana bileşenleri hücreler, moleküler sinyaller ve özelleşmiş yapı iskeletleridir. Hücre dışı kültür aşamasını takiben, oluşturulmuş yapay organ veya doku vücuda entegre edilmekte, bu yapı kan damarları tarafından nüfuz edilmekte ve yeni doku büyümesi desteklenmektedir. Damar mühendisliği doku mühendisliğinin dallarından biridir. Damar mühendisliği yaklaşımı biyomühendislik, doku mühendisliği, damar biyolojisi, kök hücre biyolojisi ve biyomalzeme teknolojilerini birleştirerek organ ve dokuların yenilenmesini sağlamaktadır. İlk kez 1986 yılında Weinberg ve Bell tarafından damar mühendisliğinde umut vaadedici bir gelişme olarak rapor edilmiştir. Doku mühendisliği ile oluşturulmuş kan damarları fonksiyonel olmalı, immünojenik ve trombojenik etkilere neden olmamalı, yüksek kan akış oranlarına uygunluk göstermeli, normal damara benzer viskoelastik özellik göstermeli ve vücuda entegre olmalıdır. Son yıllarda, kök hücreler doku mühendisliği alanında en büyük kaynak olarak yer almaktadır. Kök hücre tedavisinin en önemli avantajlarından biri hastanın kendi vücudundan izole edildiğinden dolayı doku reddinin olmamasıdır. Çoğalma potansiyeli ve farklılaşma kapasitesi, mezenkimal kök hücreleri doku mühendisliği uygulamalarında ön plana çıkarmaktadır. Mezenkimal kök hücreler vücutta yaygın olarak kemik iliği, yağ dokusu, kordon, iskelet kasları, dermis, perisitler, akciğer dokusu, diş pulpası ve periodontal ligamentlerde bulunmaktadır. Mezenkimal kök hücreler T lenfositleri, B lenfositleri, doğal öldürücü hücreler ve dendritik hücreler gibi çibrçok immün sistem hücreleri ile iletişim halindedir. Erişkin mezenkimal hücreler in vitro koşullarda çoğaltılarak ve doku mühendisliği metodları kullanılarak farklı hücre/doku tipleri oluşturulmak amacıyla kullanılmaktadır. Tıpta bu hücrelerin en önemli uygulaması doku-organ tedavisi ve yenilenmesidir. Kemik iliği mezenkimal kök hücre açısından zengin bir kaynak olsa da, son yıllarda yapılan çalışmalar bu hücrelerin göbek kordon kanında da bulunduğunu göstermiştir. Göbek kordon kanı, göbek kordon veninden doğum sonrasında toplanmaktadır. Göbek kordon kanı kaynaklı mezenkimal kök hücreler kemik iliğinde olduğu gibi farklılaşma potansiyeline sahiptirler. Diğer hücre kaynakları ile karşılaştırıldığında kordon kanı eldesi oldukça kolay ve ağrısız bir yöntemdir. Hücreler büyümeyi ve farklılaşmayı sürdürebilmeleri için iki boyutlu ya da üç boyutlu yapı iskeletlerine ihtiyaç duymaktadırlar. Doku mühendisliğinin diğer bileşeni hücrelerin büyüyebileceği bir ortam olan biyolojik ya da biyo-yıkılabilir yapı iskeletlerinin kullanımıdır. Yapı iskeletleri doğal (kollajen, fibrin) ya da sentetik polimerler (poliglikolid, polilaktid) olabilir. Yapı iskeletleri implantasyon sonrası yıkılabilir olmalı ve yerini yeni dokuya bırakmalıdır. Polidimetilsiloksan silikon olarak adlandırılan polimerik organo-silikon grubu içerisinde yer almaktadır. Polidimetilsiloksan en sık kullanılan silikon temelli organik polimerdir. Biyouyumluluk, optik gözlem, toksik ve yanıcı etkisi olmayan özellikleri ile bilinmektedir. Bu çalışmada, yoğunluk farkı metodu sayesinde izole edilen göbek kordon kanı kaynaklı mezenkimal hücreler, MesenCult® Besiyeri veya Standart Besiyeri olmak üzere iki farklı besiyerinde kültüre edilmiş ve büyüme karakteristikleri incelenmiştir. Buna karşılık büyümenin Standart Besiyeri’nde daha hızlı olduğu gözlenmiştir. Kordon kanından izole edilen mezenkimal hücreler mikroskobik olarak incelenmiş, hücre yüzey antijenlerinin ekspresyonu akım sitometri ile gösterilmiştir. Bunun yanı sıra izole edilen kordon kanı kaynaklı mezenkimal hücrelerin gerek mikroskobik gerek akım sitometrik analizleri bu hücrelerin kemik iliği kaynaklı mezenkimal hücrelerle aynı özellikte olduğunu göstermiştir. Çalışmada göbek kordon kanından izole edilen mezenkimal hücreler, vasküler endotel büyüme faktörü yardımıyla, iyi üretim uygulamaları koşullarında, in vitro ortamda endotel hücrelere başarıyla farklılaştırılmıştır. Farklılaşma, mikroskobik yöntemin yanı sıra akım sitometri kullanarak özelleşmiş hücre yüzey işaretleyicilerinin analizi ile de gösterilmiştir. Optimum vasküler endotel büyüme faktör miktarı, etkin kök hücre farklılaşması için 50 ng/mL olarak bulunmuştur. Yüzey modifikasyonlarının göbek kordonu kaynaklı mezenkimal hücrelerden farklılaştırılarak elde edilen endotel hücreler üzerindeki etkisi ve önemi, hücrelerin çoğalma kapasitesi polidimetilsiloksan yapı iskeletleri kullanılarak araştırılmıştır. Polidimetilsiloksan çizgi, artı, kare ve daire şekillerinde olmak üzere, yüzeyleri tekrarlayan farklı geometrik şekiller ve farklı derinlikler içerecek şekilde üretilmiştir. İki boyutlu olarak üretilen ve canlılık analizleri gerçekleştirilen yapı iskeletleri aynı zamanda, SIRM tekniği kullanılarak üç boyutlu olarak üretilmiştir. Hücre canlılık analizi, bu yüzeylerde büyütülmüş polidimetilsiloksan yüzeyler arasında artı şekilli yapı iskeletinin %80 oranında canlılığı arttırdığını, en yüksek hücre canlılığı ve proliferasyonu sağladığını göstermiştir. Yapı iskeletlerinin sterilizasyonu üç farklı yöntem ile test edilmiş ve üç farklı metodun da geometrik şekiller üzerinde herhangi bir negatif etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Farklı geometrik şekillerde ve derinliklerde üretilen yapı iskeletlerinin hidrofobik özelliklerinin her tür içinde aynı olduğu gösterilmiştir. Çalışmada doğal damar benzeri yapı iskeletinin üretimi ve bu yapı iskeletlerinin hücre büyümesi ve farklılaşmasını olumlu yönde etkilediği başarıyla gösterilmiştir.
-
ÖgeDelignifikasyon İçin Yeni Bir Teknoloji Geliştirilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-02-08) Tezcan, Erdem ; Atıcı, Oya ; 10101558 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsSelüloz, glukoz altbirimlerinden oluşan doğal bir polisakkarittir. Birçok bitkinin ana bileşenidir ve lignin ve hemiselüloz ile birlikte bulunur. Selülozun ticari olarak çok büyük önemi vardır fakat selülozun kullanılabilmesi için diğer bileşenlerinden ayrıştırılması gerekmektedir. Hemiselüloz da selüloz gibi polisakkarit türevidir fakat glukoza ilaveten ksiloz, mannoz, galaktoz, arabinoz, glukuronik asit, metil-glukuronik asit ve galakturonik asit gibi altbirimleri de içerir. Lignin, fenolik ünitelerden oluşan hidrofobik yapıya sahiptir ve selüloza kimyasal bağla bağlıdır. Bu nedenle, lignoselülozik biyomalzemelerden ligninin uzaklaştırılması (delignifikasyon) işlemi günümüzde, biyomalzemelerin derişik kimyasallarla yüksek sıcaklık ve basınçlarda muamele edilmesiyle yapılır. Bu işlem için, işlemin ağır koşullarına özel tasarlanmış pişirme kazanları kullanılır. Hemiselüloz ise selüloza hidrojen bağlarıyla bağlı olduğu için uzaklaştırılması ligninin uzaklaştırılmasına göre daha kolaydır ve birçok delignifikasyon işlemi ayrıca hemiselülozu da uzaklaştırır. Bu nedenle delignifikasyon işlemi, selüloz üretiminin en zor aşamasıdır ve endüstriyel olarak büyük bir öneme sahiptir. Yığın liçi ve yığın biyoliçi teknolojileri, metalürjide kullanılan yöntemlerdir. Maden veya maden cüruflarının yığınlanıp ve tepeden yağmurlanması, süzülerek dibe ulaşan çözeltinin ayarlamalar yapılarak tekrar tekrar tepeden yağmurlanması aşamalarını içerir. Yığın liçi teknolojisi bakır ve altın madenleri için kullanılmaktadır. Yığın biyoliçinde ise bakteri eklenerek işlemin hızı ve verimi arttırılır. Kapalı fabrika binası ve basınçlı reaktörler gibi karmaşık sistemler kullanılmadığı için ilk kurulum ve işletme maliyetleri diğer yöntemlerden daha düşüktür. Bu nedenle, özellikle diğer teknolojilerle işlemesi ekonomik olmayan düşük içerikli maden ve maden cürufları için kullanılırlar. Bu çalışmada, metalürjide kullanılan yığın liçi teknolojisinin delignifikasyon işlemine uyarlanmasını temel alacak yeni bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, laboratuvar ölçeğinde “yığın delignifikasyonu” sistemi tasarlamak ve kurmak, kurulan sistemle sonbahar yapraklarından ve testere tozlarından lignin uzaklaştırılması hedeflenmiştir. Ayrıca, aynı sistemle, lignini uzaklaştırılmış seslülozu endüstriyel kullanım için daha da işlenmesi hedeflenmştir. Geliştirilecek yeni yöntem için öncelikle laboratuvar ölçeğinde yığın delignifikasyonu sistemi tasarımı yapıldı. Yöntem, 1yığın sahalarında biyomalzemelerin yığınlanması, 2yığılan biyomalzemelerin çeşitli çözeltilerle tepesinden yağmurlanması, 3yağmurlanan çözeltinin dibe doğru süzülerken yığında bulunan lignin ve hemiselülozu uzaklaştırması, 4yağmurlama çözeltisinin yağmurlama havuzunda toplanması, 5yağmurlama havuzunda, çözeltinin pH ve kimyasal miktarı gibi değerlerinin ayarlanması ve 6ayarlanan çözeltinin tekrar yığına tepeden verilmesi şeklinde planlanmıştır. Bu çalışma prensibiyle, plastik kaplar, akvaryum havalandırma ve akvaryum suyu sirkülasyon pompaları gibi basit ve kolay bulunan malzemeler kullanılarak laboratuvar ölçeğinde (0,05-5L) sistemler oluşturuldu. Sistemler modüler yapıda olacak şekilde tasarlandı. Sistem kurulumuna istenilirse havalandırma ve kireç sistemleri ilave edilebilmiştir. Sistemin çalıştırılması ise, farklı biyomalzemeler ve farklı kimyasallar kullanarak, tıpkı yığın madenciliğinde olduğu gibi, asidik veya alkali ortamda gerçekleştirilebilmiştir. Sistem işleyişi sırasında yığından ve yağmurlama çözeltisinden belli aralıklarla numune alınarak delignifikasyon işleminin hangi aşamada olduğu izlenebilmiştir. Kimyasallar sisteme harcandıkça eklenmiş, sistem daha fazla kimyasal harcamadığı zaman işlem sonlandırılmıştır. Tasarlanan yığın delignifikasyonu sistemiyle, atık biyomalzemeler olan sonbahar yaprakları, kayın ve köknar ağacı testere tozları, selüloz elde etmek için işlenmiştir. Önerilen yığın delignifikasyonu işlemini test etmek ve sonuçları standart yöntemlerle karşılaştırmak için, aynı kimyasal derişimleri kullanarak oda koşullarında karıştırmalı reaksiyonlar gerçekleştirilmiştir. Yığın delignifikasyonu sistemi, antibakteriyel selüloz üretimi için de kullanılmıştır. Sonbahar yaprakların yığın delignifikasyonu işleminin iyileştirme çalışmaları, H2O2, pH, kireç, havalandırma ve NaCl gibi bileşenlerin etkileri araştırılarak gerçekleştirilmiştir. Yapılan deneylerde özellikle 2 sistem öne çıkmıştır. • Delignifikasyonun en yüksek olduğu sistem (%83,9), pH 13’e düştükçe katı NaOH eklemeleri yapılması ve sistemin önceki deneyin çözeltisi kullanılarak başlatılması ile sağlanmştır. Bu koşullarda NaOH sarfiyatı, gram yaprak başına 0.3g olarak gerçekleşmiştir. Karşılaştırmak için yapılan ve aynı miktarda NaOH kullanılan karıştırmalı deneylerde ise çok daha düşük oranda delignifikasyon sağlanmıştır (%56,1). Yığın delignifikasyonu sisteminin başarısı, 10 kat fazla NaOH kullanılarak yapılan karıştırmalı deneylerden bile yüksek olmuştur. Karıştırmalı deneylerde, yığın delignifikasyonu sistemine yakın delignifikasyon sağlamak için 10 kat fazla NaOH kullanımı ve ilaveten H2O2 kullanımı gerekmiştir. • Diğer önemli sistem ise, havalandırma işleminin yapıldığı, yağmurlama çözeltisinin %3 oranında NaCl içerdiği (deniz suyu gibi) ve yağmurlama çözeltisinin kireç kolonu üzerinden geçirilerek sisteme verildiği sistemdir. NaOH ve H2O2 gibi kimyasal kullanımı yapılmayan bu sistemde %33,8 delignifikasyon sağlanmıştır. Endüstriye uyarlandığı zaman bu sistem deniz suyu kullanımına izin verebilir böylece su bulunabilirliği artıp su maliyeti ciddi oranda azaltılabilir. Ayrıca, yığın delignifikasyonu sisteminde kireç ayrı bir kolona konulur yani biyomalzemelerle karıştırılmaz. Bu nedenle işlem bittiği zaman veya kireç kolonları tıkandığı/işlemez hale geldiği zaman sistemden çıkartılabilir ve tekrar geri dönüştürülebilir. Testere tozlarının yığın delignifikasyonu, yapraklar için olanla aynı koşullarda yapıldı ve karşılaştırma olarak da aynı koşullarda karıştırmalı deneyler gerçekleştirildi. Fakat yapraklar için bulunan ideal koşullar testere tozları için hem yığın delignifikasyonu sisteminde hem de karıştırmalı sistemlerde çalışmadı. Bu nedenle, testere tozları için asidik koşullar araştırıldı ve bir sistem, testere tozlarının yığın delignifikasyonu için ön plana çıktı. Persülfürik asit kullanılarak işleyen sistem, hem kayın hem de köknar testere tozları için hem yüksek (>%90) delignifikasyon hem de beyazlatma etkisi gerçekleştirdi. Gram testere tozu başına 3ml persülfürik asit kullanıldığı sistemin, %92,4 delignifikasyon gerçekleştirerek ideal olduğu gözlemlendi. Aynı oranda persülfürik asitin kullanıldığı karıştırmalı sistemlerde ise delignifikasyon %75,1 olarak gerçekleşti. Yeni geliştirilen sistem ayrıca üretilen ürünlerin işlenmesi için de kullanıldı. Örnek işlem olarak antibakteriyel selüloz üretimi seçildi. Köknar testere tozunun yığın delignifikasyonu işlemiyle üretilen selüloz, yine aynı yığın sistemiyle işlenerek antibakteriyel selüloz üretildi. Üretilen selülozların etkileri, hastane enfeksiyonlarına neden olan bakterilere karşı ölçülerek dirençli ve dayanıklı bakteriler belirlendi. Yığın delignifikasyonu işlemiyle üretilen selüloz, antibakteriyel özellik katmak için metalik gümüşle veya benzalkonyum klorür ile aktifleştirildi. • Gümüşle aktifleştirilmiş antibakteriyel selülozlar 2 aşamayla üretildi. İlk olarak, yığın delignifikasyonu işlemiyle üretilen selüloz, yığın halindeyken gümüş nitrat çözeltisiyle yağmurlandı. Sonra yağmurlama çözeltisine askorbik asit eklenerek metalik gümüş sentezi gerçekleştirildi. Gümüşle aktifleştirilmiş selüloz, doza bağlı olarak gram pozitif Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis bakterilerine karşı antibakteriyel etki gösterdi. Hem baskın tip hem de piyoverdin üretemeyen tatC delesyon mutant gram pozitif Pseudomonas aeruginosa (PAOtatC) bakterileri ise formülasyonlara direnç gösterdiler. • Benzalkonyum klorür aktifleştirilmiş antibakteriyel selüloz örnekleri, yığın delignifikasyonu ile üretilen selülozun benzalkonyum klorür çözeltisiyle yığın sisteminde yağmurlanmasıyla üretildiler. Benzalkonyum klorür aktifleştirilmiş selülozlar, gram pozitif Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis bakterilerine karşı antibakteriyel etki gösterdiler ve bu antibakteriyel etki, gümüşle aktifleştirilmiş selülozlarınkinden daha fazla oldu. Piyoverdin üretebilen baskın tip gram pozitif Pseudomonas aeruginosa formülasyonlara direnç gösterirken, piyoverdin üretemini engelleyen tatC delesyon mutasyonunun, direnci kırdığı gözlemlendi. Böylece, benzalkonyum klorürlü antibakteriyel selüloz, tatC delesyon mutant Pseudomonas aeruginosa’a da karşı antibakteriyel özellik gösterdi. Bu çalışmada, yığın delignifikasyonu, delignifikasyon işlemi için yeni bir yöntem olarak sunulmuştur ve endüstriyel uygulamalar için birçok fırsatlar vaadetmektedir. Sistem basit ekipmanlarla, açık havada, ortam sıcaklığı ve basıncında çalışacak şekilde tasarlanmıştır. Günümüzde kullanılan ve selüloz hamuru üretmeye yarayan delignifikasyon teknolojileri ise derişik kimyasallar, yüksek sıcaklık ve yüksek basınç kullanmaktadırlar. Ayrıca, sistemi çalıştırmak çok kolaydır. Örneğin, karıştırmalı sistemlerin aksine, sunulan yöntemde karıştırma işlemi olmadığı için, biyomalzemelerin bulamaç haline getirilmesine gerek kalmamış ve biyomalzemeler öğütülmeden de yığınlanabilmiştir. Ayrıca, mevcut sistemlerde biyomalzemeler pişirme işleminden sonra sıcak ve kötü kokulu kimyasallar içerisine karışmış halde ve yapılan işlem neticesinde daha da parçalanmış haldedirler. Endüstride bu tür malzemelerin filtrasyonu için teknik zorluklar nedeniyle son derece gelişmiş sistemler kullanılmaktadır. Sunulan sistemde ise kullanılan reaktif çözelti kendiliğinden süzülmektedir. Sunulan sistemin bu özellikleri, endüstriyel uygulama sırasında muhtemelen yatırım ve işletme maliyetlerini ve güvenlik risklerini düşürecek, işletme süresinin fizibıl olarak uzayabilmesini sağlayacak, sistem kontrolünü kolaylaştıracak ve ürün kalitesini arttıracaktır. Ayrıca, yığın delignifikasyonu yapılmış ürünleri aynı sistemle, ürünler yığın sahasındayken işlemek de mümkün olabilecektir. Bu avantajlar, günümüz teknolojileriyle işlenmesi fizibıl olmayan organik atıkların da işlenebilmesini sağlayabilir. Bu nedenlerle, yığın delignifikasyonu metodu daha büyük ölçeklerde uygulanıp endüstriyel uygulama için eniyileştirilmelidir.
-
ÖgeDemir'e Dirençli Saccharomyces Cerevisiae’nin Moleküler Ve Fizyolojik Karakterizasyonu(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017-01-16) Balaban, Berrak Gülçin ; Çakar, Zeynep Petek ; 10135132 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsYerkabuğundaki en yaygın dördüncü element olan demir, canlılar için gerekli bir element olmakla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda canlılar üzerinde toksik etki göstermektedir. Demirin en yaygın iki oksidasyon hali (Fe+3 ve Fe+2) arasındaki elektron taşınım potansiyeli, demiri tüm canlılar için önemli kılmaktadır. Demir iyonları oksidatif fosforilasyonda da önemli rol oynar. Demir; bakır, çinko, nikel ve kobalt gibi diğer geçiş metalleri ile benzer fiziksel ve kimyasal özellikler göstermektedir. Geçiş metallerinin iyonları ortak taşınım sistemlerine sahiptir veya bazı yapılarda birbirlerinin yerini alabilir. Bu nedenle, demir direnci ile diğer geçiş metallerine olan direncin ortak özelliklerinin olması beklenebilir. Kalıtsal hemokromatozis ve anemi, demire dayalı temel hastalıklardandır. Demir ile ilgili anahtar proteinlerin mutasyonları sonucunda, bu gibi hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Bu proteinler, demirin taşınması, algılanması, metabolize edilmesi ve kullanımı durumlarında fonksiyon gösterirler. Demir taşınımının aydınlatılması veya demirin ökaryotlarda kullanımı ve önemine dair elde edilen en ufak bir bilgi, bu hastalıkların temelinde yer alan mekanizmalara ışık tutabilir. Saccharomyces cerevisiae mayası, endüstriyel uygulamalarda ve temel bilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir mikroorganizmadır. Temel bilim araştırmalarında kullanılmasının en önemli sebepleri, en basit ökaryotik hücre modeli olması ve genetik modifikasyonunun kolaylıkla yapılabilmesidir. Endüstriyel uygulamalarda tercih edilme sebepleri ise; düşük pH değerlerinde kolaylıkla üreyebilmesi, antibiyotiklere karşı hassasiyetinin olmaması, bakterilere kıyasla toplum sağlığına olumsuz etkilerinin olmaması, yine bakterilere kıyasla daha büyük olduğu için daha kolay hasat edilebilmesi, hücre dışına sentezlenen proteinlerin saflaştırılmasının daha kolay olması ve post-translasyonal modifikasyonları yaparak istenilen konformasyonda proteini sentezleyebilmesidir. Metabolik mühendislik, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak, hücresel aktivitelerin arttırılmasını veya stres toleransı gibi hücresel özelliklerin geliştirilmesini sağlar. Bailey, 1991’de metabolik mühendisliği; hücrenin enzimatik, taşıma ve düzenleyici işlevlerinde rekombinant DNA teknolojisi ile değişiklikler yapılarak hücresel aktivitelerin iyileştirilmesi olarak tanımladı. Bu tanım, bilimsel bir disiplin olarak metabolik mühendisliğin literatürdeki ilk tanımı oldu. Mikrobiyal metabolik mühendislikte genel olarak, özellikleri geliştirilmek istenilen mikrobiyal suşa heterolog genler ve/veya suşun iyileştirilmesi için gerekli olan düzenleyici elementler kazandırılmaktadır. Metabolik mühendislik çalışmaları; belirli bir genetik manipülasyon setinin hangi hücresel işlevde istenilen değişimin elde edilmesinde etkili olduğunun belirlenmesine, uygulanmasına ve geliştirilmesine yardımcı olur. Fakat bu çalışmalarda sıkça karşılaşılan bir kısıtlama ise; bu süreçte, reaksiyona girebilecek potansiyele sahip yeni bileşiklerin ortaya çıkmasıdır. Diğer sıkça rastlanan kısıtlamalar ise; ifade edilen heterolog proteinin proteolize uğramaması, düzgün şekilde katlanması, gerekli bağlanmaların gerçekleşmesi, prostetik grubun eklenmesi, uygun şekilde konumlanması, ilgili mikroorganizmanın gerekli tüm sübstratlara erişimi ve engelleyici bir çevreye maruz kalmaması gibi gereksinimlerdir. Bailey'nin yapmış olduğu ilk metabolik mühendislik tanımı, mikrobiyal stres toleransının iyileştirilmesi gibi çalışmaları kapsamıyor izlenimi vermekteydi. Bu sebeple 1998 yılında Stephanopoulos, eski tanımın "hücresel aktiviteleri" kısmını "ürün oluşumu veya hücresel özellikler" olarak değiştirerek, daha kapsamlı bir metabolik mühendislik tanımı yaptı. Rasyonel metabolik mühendislik, iyileştirilmesi istenilen mikroorganizma hakkında detaylı biyokimyasal, genetik ve regülasyon verisi gerektirdiğinden; bu durum, özellikle hakkında fazla bilgi sahibi olunmayan, ve/veya iyileştirilmesi istenilen özelliklerinin moleküler altyapısı oldukça karmaşık olan mikroorganizmalar için uygulamada ciddi kısıtlamalara neden olabilmektedir. Bu kısıtlamaları aşmak için yine Bailey tarafından 1996'da tanımlanan tersine metabolik mühendislik yaklaşımı ise, rasyonel metabolik mühendisliğin tersten uygulanması niteliğinde olup, iyileştirilmek istenilen mikroorganizma hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmayı gerektirmemesiyle araştırmacılara avantaj sağlamaktadır. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımı, öncelikle heterolog bir organizmada veya ilgili bir model sistemde istenilen fenotipi tanımlamak ya da oluşturmak, ikinci olarak bu istenilen fenotip için gerekli genetik ve çevresel faktörleri tanımlamak veya ortaya çıkarmak ve son olarak da istenilen fenotipi istenilen organizmaya aktararak uygulamayı kapsar. Bu çalışmanın amacı; bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik ile daha önce elde edilmiş olan, demire dirençli Saccharomyces cerevisiae mutant mayasının moleküler ve fizyolojik yönden karakterize edilmesi ve böylelikle demir direncinin karmaşık moleküler altyapısının incelenmesidir. Bu amaçla, demire dirençli suşun diğer stres türlerine (özellikle de diğer geçiş metal iyonlarına) karşı çapraz direnci detaylı olarak belirlenmiştir. Fizyolojik analizler de gerçekleştirilmiş ve demire dirençli mutantın yüksek düzeyde gliserol ürettiği ve yine yüksek düzeyde trehaloz biriktirdiği gözlenmiştir. S. cerevisiae mayasının toksik metal stresi varlığında iki ana direnç mekanizması ile hayatta kalabildiği bilinmektedir: ayırma/uzaklaştırma ve kaçınma. Dirençli suşun temel demir direnç mekanizması hakkında bilgi edinmek amacıyla; Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrofotometri (F-AAS) yöntemi ile, demir stresi varlığında ve yokluğunda mutant suşun ve referans suşun demir içerikleri belirlenmiştir. Sonuçlar, ortamda demir stresi yokken, demire dirençli maya suşunun, referans suşa kıyasla anlamlı ölçüde daha yüksek demir düzeyine sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, demir stresi varlığında, demire dirençli mutant, referans suş kadar yüksek düzeyde demir iyonunu bünyesine almamıştır. Bu bulgular; demir stresi varlığında, demire dirençli mutantın demir iyonlarının hücre içine taşınımından kaçınarak hayatta kalabildiğine işaret etmektedir. Demire dirençli S. cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu için, kantitatif Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ve mikroarray yöntemleri kullanılarak, demir stresi varlığında ve yokluğunda transkriptomik analizler gerçekleştirilmiştir. Mikroarray analiz sonuçları; demire dirençli S. cerevisiae suşunun oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerinin, demir stresi yokluğunda bile, referans suşa kıyasla daha yüksek düzeyde olduğunu göstermiştir. Mikroarray analiz sonuçları doğrultusunda, lipid peroksidasyon testi ve hücre içi reaktif oksijen türü (ROS) düzeyi tespit testi gerçekleştirilmiştir. Demire dirençli suşun hücre içi ROS düzeyinin referans suşa göre daha düşük düzeyde olduğu görülmüştür. Buna göre, demire dirençli suş muhtemelen oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerini yüksek tutarak antioksidan maddeler üretmekte, böylelikle hücre içi ROS düzeylerini düşürmekte ve yüksek düzeyde demir stresi varlığında hayatta kalabilmektedir.
-
ÖgeDesign of a bioactive scaffold system for hard tissue engineering(Institute of Science and Technology, 2013) Güngör Özkerim, Perihan Selcan ; Kök, Fatma Neşe ; 349784 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ProgrammeNanofibrous double-layer matrices were prepared by electrospinning technique with the bottom layer formed from PCL (poly--caprolactone) / PLLA (poly-l-lactic acid) blend nanofibers and the upper layer from PCL/Gelatin blend nanofibers. Gelatin microspheres were incorporated physically in the middle of these two layers for controlled growth factor delivery. This sandwich system prevented microsphere leakage from the scaffold. Bead-free nanofibers with uniform morphology could be obtained by 10% w/v concentrations of PCL/PLLA and PCL/Gelatin solutions. Microspheres prepared by 500-rpm stirring rate and cross-linked with 7.5% glutaraldehyde solution were chosen after in vitro release studies. The optimized conditions were used to prepare fibroblast growth factor-2 (FGF-2) loaded microspheres. Cell culture studies with FGF-2 loaded microspheres showed that the growth factor could be actively loaded into the system and enhanced the cell attachment and proliferation. To test the effect of gelatin on cell adhesion, cell culture was performed with PCL/PLLA matrices with or without PCL/Gelatin layer. Cell attachment was significantly higher when PLLA replaced by gelatin. To investigate cell differentiation on the designed scaffold system adipose tissue derived stem cells (ADMSCs) were used and microspheres within the scaffolds were loaded with bone morphogenic protein2 (BMP-2). The effect of scaffolding on differentiation of ADMSCs towards osteogenic lineage was evaluated by various markers. According to the results, all experimental samples were biocompatible and supported the proliferation and differentiation of ADMSCs.
-
ÖgeDevelopment and structural determination of antiangiogenic recombinant antibody structures for cancer treatment(Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, 2022) Öncü Denizci, Melis ; Doğanay Dinler, Gizem ; Bahadır Özdemir, Aylin ; 724201 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve BiyoteknolojiVascular endothelial growth factor (VEGF) is a signaling molecule that plays a role in both vasculogenesis and angiogenesis. VEGFR-2/KDR (vascular endothelial growth factor receptor 2/ kinase insert domain receptor) is a tyrosine kinase that regulates a variety of angiogenesis-related cell responses. VEGFR-2/KDR is located on the surface of tumor cells and is heavily expressed in tumor-associated endothelial cells, where it modulates tumor-promoting angiogenesis. The suppression of VEGFR-2, which inhibits the angiogenic pathway in carcinogenesis, is thought to be a viable therapeutic method for the prevention and control of solid tumor growth. There are currently antibody (Ab) therapeutics targeting VEGFR-2 to treat cancer cells, but none of them is a final cure. Expectedly, the production of a novel effective anti-VEGFR-2 Abs would support cancer patients. The advancement of recombinant antibody technology and their tailored fragments has resulted in the emergence of a diverse array of antibody molecules, including the antigen binding fragment (Fab), the variable fragment (Fv), and the single chain variable fragment (scFv). Compared to the large size of a full antibody, scFvs have greater tissue penetration, decreased immunogenicity due to small molecular masses and accelerated clearance time. However, there are also some drawbacks of production of scFv structure which has poor biophysical properties, such as increased aggregation tendency and decreased thermodynamic stability, resulting in low performance and application. Protein solubility is critical in the synthesis and administration of therapeutic proteins. Inadequate solubility can lead protein aggregation, a detrimental phenomenon that can occur at any stage of recombinant protein synthesis. Numerous methods, extending from culture conditions to solubility enhancer tags, are being used to increase soluble expression. While fusing proteins to mostly soluble companions or expression with molecular chaperones may increase their total solubility, these techniques typically impair the proteins biological activity. There is no universal solution or technique for protein aggregation. anti-KDR 1.3 and anti-KDR 2.6 (anti-VEGFR-2) scFv molecules were formerly developed by phage display technique by TUBITAK MAM GMBE Immunogenetics Laboratory group. However, these antibodies are produced in inclusion bodies and form protein aggregates. Additionally, folding these molecules into active biological molecules is a laborious and uncertain process. Additionally, the protein yields are usually poor. The aim of this thesis is to address the expression and solubility problem of anti-KDR scFV molecules and to confirm the anti-angiogenic activities of the produced target molecules. In this manner, two different approaches have been adopted in the thesis, the first is the production and control of the target scFv molecules in mammalian cells, and the second approach is to transfer the target scFv molecules to a different structure using the complementarity determining regions CDR-grafting method, ensuring their production in bacteria and controlling their activity. In the first approach, the target scFv protein expression in mammalian cell culture was investigated. The existing scFv genes were utilized in the research. Different signal peptides were used for the construction of the plasmids including the target genes. Simultaneously, codon optimizations for the target cell line based on the target genes were performed. For this study, newly developed scFv genes were cloned into different mammalian expression vectors and transferred into competent cells by chemical transformation. Then, the cloned vectors were determined by colony polymerase chain reaction ( PCR) studies. The DNA sequences of the newly cloned scFv constructs were controlled by a capillary electrophoresis system. With the results obtained, sequence analysis was performed, and the proper incorporation of the gene into the plasmid, as well as the presence of mutations, were examined. The sequence of the target genest obtained were translated using bioinformatics tools, and the protein to be generated was examined for frameshifts. In accordance with these findings, the resulting vectors were purified and transfected into mammalian cells. New scFv constructs were produced in mammalian cells and purification was made by using chromatography columns. Transient transfections with vectors encoding the regulated target genes were initially conducted in different mammalian cell lines. Then, stable transfections were generated using the optimum antibiotic concentrations. The serial dilution technique was used to produce monoclonal cells from stably transfected cells. Chinese Hamster Ovary (CHO-K1) cells were adapted and suspended in serum-free media. Several feeding strategies, temperature experiments, and high volume production experimets were carried out in the cell culture studies. The resulting antibody structures were analyzed by SDS-PAGE and western blot methods. The binding of the samples to VEGFR-2 were then be checked by ELISA assays. After production and purification of the proteins, the activity and structure analysis were performed. Purified antibodies were examined by chromatographic methods based on HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Real-time PCR method was used to investigate the presence of m-RNA in cells. In addition to these studies, Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) studies were carried out to reveal the structural dynamics of the anti-KDR 1.3 protein obtained from bacteria. Unfortunately, it was not possible to achieve better expression efficiency for the target anti-KDR molecules in mammalian cells. Overall results for poor expression or none were confirmed by monoclonal cells experiments, fed-batch experiments, codon optimizations, signal peptide alternatives. The selection of high-product yielding clones was requiring significant amount of time and effort in the development of cells producing recombinant molecules. As a result, the second half of this thesis focused on developing a unique technique for the quick and simple increase in solubility and production of the target proteins. In the second approach, a CDR grafting technique was used to modify and upgrade the structure of the existing scFv with a more producible pre-existing scFv to improve the biophysical characteristics of these scFv molecules. The effect of the CDR grafting technique on the solubility and efficacy of the expressed protein was investigated in this study. Computational methods were used to model our antibody structure and physicochemical properties, followed by experimental confirmation. CDR grafting technique was employed to modify and upgrade the structure of our scFv with a more producible pre-existing scFv. We used computational methods to model our antibody structure and its physicochemical properties, followed by experimental confirmation. Soluble expression analysis, affinity determination by surface plasmon resonance (SPR), in vitro activity assays were performed. According to the computational data, CDR grafting enhanced the solubility of the grafted scFv protein in comparison to the native scFv protein. SDS-PAGE and western blot analysis showed the expressed protein's increased solubility. SPR analysis revealed that the grafted molecule exhibits comparable binding affinities to the VEGFR-2 receptor to the native molecule. Biological activity studies, including proliferation inhibition, migration and wound healing experiments studies on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), demonstrated that the newly synthesized grafted scFv protein posseses anti-angiogenic characteristics. This study reveals that a soluble scFv can be created by grafting the variable regions from an intrinsically insoluble scFv onto constant sections derived from innately soluble molecule. The drug potency of a low yield anti-angiogenic scFv (anti-KDR 1.3) with inclusion body formation tendency was highly increased by employing CDR grafting strategy.
-
ÖgeDisease Gene Identification Using Linkage and Exome Analyses(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2019) Karacan, İlker ; Turanlı, Eda Tahir ; 10265488 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and BiotechnologyNadir hastalıklar toplumda her 10.000 kişiden 5'inden daha azında görülen, genellikle yaşamı tehdit eden veya ağır kronik bulguları olan hastalıklar olarak tanımlanmaktadır. Dünyada 6.000'den fazla nadir hastalık bulunduğu ve toplumdaki sıklığının %6-8 arasında olduğu öngörülmektedir. Bu hastalıkların herbiri nadir olsa da, toplamda Türkiye'de 5 milyon kişinin nadir hastalıklardan etkilendiği düşünülmektedir. Bu hastalıkların yaklaşık %80'i genetik kökenli olup, erken yaşta ortaya çıkan ve ilerleyen hastalıklardır. Geri kalanı ise nadir kanserler, enfeksiyonlar, dejeneratif hastalıklar veya çevresel etkenlerden kaynaklanan hastalıklardır. Bu hastalıkların tekil olarak etkiledikleri hasta sayısı az olduğundan, geliştirilen tedavi yöntemleri kısıtlıdır. Nadir hastalıkların %95'inin henüz bir tedavisi yoktur. Çoğunluğu genetik olduğundan, büyük oranda çocukluk çağında ortaya çıkar ve hastaların %30'u beş yaşından önce hayatını kaybeder. Buna karşın, tanı koymadaki zorluklardan dolayı, ortalama bir hastanın doğru tanıyı alması sekiz yıl sürmekte, bu süre içerisinde 10 uzmanın klinik değerlendirmesinden geçmekte ve üç hatalı tanı almaktadır. Bu nedenlerden dolayı nadir bir hastalığın sebebini tespit ederek, ortaya çıkmadan önüne geçmek büyük önem taşımaktadır. Kalıtsal nadir hastalıklar genellikle yüksek etkili nadir genetik varyantlardan kaynaklanmaktadır. Bu genetik alleller genellikle yaşamı tehdit ettiğinden ve üreme çağından önce ortaya çıkarak sonraki nesillere aktarılamadığından dolayı negatif seçilim ya da elenme baskısı altındadır. Baskın genetik hastalıklara sebep olan alleler genellikle üreme üzerindeki etkilerinden dolayı sonraki nesillere aktarılamazken, bu hastalıklar de novo mutasyon oluşumlarıyla popülasyondaki sıklıklarını korurlar. Bunun yanı sıra çekinik genetik hastalıklara sebep olan alleller ise heterozigot durumda bireylerin sağlığını etkilemeden bulunabilirler. Akraba evliliğinin sık olduğu ülkelerde, çekinik hastalıklar diğer ülkelere göre daha yaygın görülmektedir. Türkiye İstatistik Kurumu raporlarına göre Türkiye'deki akraba evliliği oranı %23,2 olup, bunların büyük kısmı birinci derece kuzenler arasında olmaktadır. Bu durum ülkemizdeki akraba evliliği sebepli çekinik kalıtılan hastalıkların beklenenden daha çok insanı etkilemesine yol açmaktadır. Gelişen genomik teknolojilerin insan genetiği alanında kullanılmasıyla hastalık geni haritalanması artık daha etkili olarak gerçekleştirilebilmektedir. Yüksek çözünürlüklü genotiplendirme çalışmaları sayesinde bir kişi aynı anda milyonlarca tek nükleotid polimorfizmi (SNP) için genotiplenebilmekte ve genomundaki yapısal değişimler tespit edilebilmektedir. Genom-boyu elde edilen SNP genotip bilgisi kullanılarak bağlantı analizi ve homozigotluk haritalama yöntemleri sayesinde aile çalışmaları ile hastalıkla birlikte kalıtılan genom bölgeleri tespit edilebilmektedir. Ayrıca, DNA dizileme teknolojilerindeki gelişmeler sayesinde de genom dizileme metodları kullanılarak insan genomunun tümü veya yalnızca kodlayan bölgelerinin dizilenmesi mümkün olabilmektedir. Bu yöntemler özellikle kalıtım modeli öngörülebilen, birden fazla etkilenmiş bireyi bulunan geniş ailelerde daha yüksek başarı ile hastalık geninin haritalanmasını sağlayabilmektedir. Bu amaç ile, aile çalışmalarında ilk olarak genom-boyu analizler ile, aile içerisinde hastalıkla birlikte kalıtılan kromozom bölgelerinin tespit edilmesi gerekmektedir. Elde edilen hastalık-ilişkili olabilecek aday bölgelerin DNA dizisinin incelenmesi ile de hastalığa yol açan genetik değişimler tespit edilebilmektedir. İnsan genomunda 20.000'den fazla sayıda gen olmasına rağmen, bunların birçoğunun fonksiyonu ile ilgili henüz yeterli bilgi mevcut değildir. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) veritabanında, 1 Nisan 2019 tarihi itibarı ile, 4,000'den fazla gen için herhangi bir açıklama dahi mevcut değilken, Mendelyen kalıtım olduğu düşünülen 1,756 fenotipin ilişkilendirildiği bir gen veya lokus dahi bulunmamaktadır. Hastalık geni haritalama yöntemleri ile tespit edilecek gen-fenotip ilişkisi yardımı ile işlevi bilinmeyen birçok genin ilişkili olduğu biyokimyasal mekanizmalarının ortaya çıkarılması mümkün olabilecektir. Aynı zamanda, hastalığa sebep olan genlerin tespit edilmesiyle ailelerin sonraki nesillerde hasta çocuklarının olmasının önüne geçilebilmektedir. Buna ek olarak, hastalıklarla ilişkisi zaten bilinen genlerdeki bozuklukların, literatürdeki bilinenden farklı bulgulara sebep olması da, hastalığın tanısının konmasını kolaylaştırıcı yeni bilgiler üretmesine sebep olabilmektedir. Zaten nadir görülen bu hastalıkların yeni ek klinik bulgularının tespit edilmesiyle, bu hastalıklardaki tanı için geçen ortalama süreyi azaltabilecek veriler de elde edilebilir. Bu çalışmada, nadir tek gen hastalığı olan ailelerde hastalıktan sorumlu genetik varyantların bulunması amaçlanmıştır. Bu amaçla dört farklı hastalık için on ailede genom-boyu SNP genotiplendirme, bağlantı analizi ve/veya homozgiotluk haritalama tekniklerinin yanısıra aday gen ve/veya ekzom dizileme yöntemleri kullanılmıştır. Bu yöntemler her çalışılan aileye, hastalığa ve elde edilen veriye göre farklı kombinasyonlarda uygulanmıştır. Tezin ilk kısmında, klinik olarak ailesel Akdeniz ateşi (AAA) tanısı almış fakat hastalıktan sorumlu olduğu bilinen MEFV geninde hastalık yapıcı varyant bulunmayan iki aile incelenmiştir. Bu hastalardaki AAA-benzeri klinik profilin daha önce tanımlanmamış fenotipler olabileceği veya hastalık ilişkisi bilinmeyen genlerdeki bozuklukların genetik heterojenite sonucunda AAA bulgularına yol açabileceği hipotezi kurulmuş ve genetik analizler gerçekleştirilmiştir. İlk ailede hastalığın baskın geçişli kalıtıldığı öngörüldüğünden iki hastada (baba ve kız) ekzom dizileme yapılmıştır. Ham verinin biyoinformatik analizi ile ekzonik varyantlar incelenmiş, her iki hastada da ortak paylaşılanlar incelenmiştir. Sonuç olarak, tümör nekroz faktör reseptörüyle ilişkili periyodik sendrom (TRAPS) hastalığına yol açtığı bilinen TNFRSF1A geninde daha önce bildirilmemiş c.215G>T (p.Cys72Phe) varyantı heterozigot olarak tespit edilmiştir. İkinci ailede ise hastalığın çekinik geçişli olduğu öngörülmüş, genom-boyu SNP genotiplendirme verisi kullanılarak çekinik kalıtım modelinde çok noktalı parametrik bağlantı analizi gerçekleştirilerek hastalıkla ilişkili kromozom bölgeleri aranmıştır. Tespit edilen aday bölgeler arasında en büyüğünde (12 Mb) hastalıktan sorumlu olabilecek gen aranmış, bölgenin mevalonat kinaz eksikliği hastalığına sebep olduğu bilinen MVK genini barındırdığı görülmüştür. Gerçekleştirilen DNA dizi analizi sonucunda bu gende daha önce bildirilmemiş c.481T>C (p.Cys161Arg) değişimine sebep olan varyantın kalıtım modeli ile de uyumlu olarak, sadece hasta bireylerde homozigot durumda kalıtıldığı gösterilmiştir. Bu varyantın her iki ailenin hasta bireylerinde ayrıntılı klinik incelemeleriyle, AAA tanısını genetik bulguların desteklemediği durumlarda, klinik heterojenite de göz önünde bulundurularak, diğer otoinflamatuar hastalıklardan sorumlu genlerin de incelenmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Tezin ikinci kısmında, çocuk ve gençlerdeki en sık rastlanan romatolojik hastalık olan ve sebebi bilinmeyen kronik artrit ile karakterize juvenil idiyopatik artrit (JIA) hastalığı bulunan aileler incelenmiştir. JIA hastalığı kompleks kalıtımlı olarak bilinmekte olup, aile ve ikiz çalışmaları hastalığın oluşunda genetik faktörlerin de rol oynayabileceğini işaret etmektedir. Tez kapsamında akraba evliliği sonucunda ikişer hasta kardeş bulunan iki ailede genom-boyu SNP genotiplendirme verisi kullanılarak, çekinik kalıtım modelinde çok noktalı parametrik bağlantı analizi ile hastalıkla birlikte kalıtılan kromozom bölgeleri aranmıştır. İki ailede birden yapılan bağlantı analizi sonucunda en yüksek LOD skor 4.81 olarak 6.8 Mb'lık 13q13.3-13.14.13 bölgesinde hesaplanmıştır. Tespit edilen hastalık-ilişkili kromozom bölgesinde yer alan 38 protein kodlayan gen incelenmiş, daha önce nadir ailesel vakalarda hastalık-ilişkili olarak bildirilen ve çalışma sırasında da başka gruplar tarafından Mendelyen kalıtım gösteren JIA ailelerinde hastalık-ilişkili patojenik varyantlar tanımlanmış olan LACC1 geni en güçlü aday olarak belirlenmiştir. Bu ailelerde LACC1 geninin kodlayan bölgelerinin Sanger yöntemi ile dizilenmesi sonucunda sırasıyla başlangıç kodonunu bozan c.3G>A (p.0) ve erken bitiş kodonu oluşturan c.1240C>T (p.Arg414Ter; rs184370809) değişimleri kalıtım modeli ile uyumlu olarak sadece hasta bireylerde homozigot durumda tespit edilmiştir. Devamında çalışmaya dahil edilen ikişer hasta kardeş bulunan diğer beş ailede de LACC1 geninin kodlayan bölgeleri dizilenerek taranmıştır. Üçüncü ailede yine kalıtım modeli ile uyumlu olarak çerçeve kayması olmadan amino asit silinmesi yapan c.998_990del (p.Ile330del; rs776489319) varyantı tespit edilmiştir. Son ailede ise hasta bireylerde ortak genotipte, işlevsel etkisi bildirilen yaygın bir polimorfizm olan c.760A>G (p.Ile254Val; rs3764147) varyantı homozigot olarak, daha önce bildirilmemiş c.1109G>A (p.Cys370Tyr) varyantı ise heterozigot durumda tespit edilmiştir. Fakat bu ailede bir sağlıklı birey daha hastalarla aynı genotipte bulunduğundan, daha önce bildirilmemiş p.Cys370Tyr varyantının hastalık oluşumundaki rolü net olarak belirlenememiştir. Önceki yayınlanan çalışmalarla birlikte bu çalışmada da LACC1 geni bozukluklarının nadir görülen ailesel JIA vakalarında hastalıktan sorumlu olduğu belirlenmiş, erken başlangıçlı JIA vakalarında LACC1 gen analizinin göz önünde bulundurulması önerilmiştir. Diğer üç ailede ise LACC1 geninin kodlayan bölgelerinde herhangi bir nadir varyant tespit edilmemiştir. Tezin üçüncü kısmında ise, ilk klinik incelemelerde mikrosefali, zihinsel yetmezlik ve dismorfik bulguların yanında kanama eğilimi ile yetersiz yara iyileşmesi bulguları olan bir aile çalışılmıştır. Anne-baba akraba olup, hastalık bulgularını taşıyan iki hasta çocukları vardır. Hasta bireylerin çalışmaya dahil edilmeden önce tıbbi genetik birimlerinde yapılan kromozom analizinde ve hematolojik bulgularla ilişkili olabilecek aday genlerde hastalık yapıcı bir değişim tespit edilememiştir. Bu sebeplerle çekinik kalıtılan yeni bir hematolojik hastalık olabileceği hipotezi ile çalışmaya dahil edilmiştir. Aile bireylerinde genom-boyu SNP genotip verisi kullanılarak gerçekleştirilen çok noktalı parametrik bağlantı analizi sonucunda 12q24.21-24.32 kromozomal bölgesinde en yüksek LOD skor 2.59 olarak elde edilmiştir. Bu aday bölgedeki 112 protein kodlayan genin incelenebilmesi için ekzom dizileme gerçekleştirilmiştir. Ham verinin biyoinformatik analizi ile saptanan ekzonik varyantlar incelenerek önceliklendirilmiştir. Otozomal çekinik kutis laksa tip IIA (ARCL2A) hastalığına sebep olduğu bilinen ATP6V0A2 geninde daha önce bildirilmemiş, çerçeve kaymasına sebep olan c.2085_2088del (p.Ser695Argfs*) varyantı protein yapısını da bozması sebebiyle en güçlü aday olarak belirlenmiştir. Ailedeki hasta bireyler bu hastalık yönünden tekrar klinik olarak incelenmiş, onlarda ARCL2A bulgularından buruşuk ve gevşek deri gözlenmiştir. Tüm aile bireyleri aday varyant için taranmış, varyant kalıtım modeline uygun olarak yalnızca hasta bireylerde homozigot olarak tespit edilmiştir. Böylece, hastalığın ARCL2A ile uyumlu olduğu görülse de, mikrosefali dışında yapısal beyin bozukluğu, şaşılık, miyop, büyüme ve gelişme geriliği görülmediği, ama kanama eğilimi ve yetersiz yara iyileşmesi bulgularının varlığı tespit edilmiştir. Ailedeki hasta ve sağlıklı bireylerden alınan kan ve cilt dokusu örnekleri ışık ve elektron mikroskopisi çalışmalarıyla da incelenmiştir. Bu incelemeler, literatür bilgisi ile de uyumlu olarak, yalnızca hastalarda deri dokusunda elastik fiber eksikliğini doğrulamıştır. Ayrıca yalnızca hasta bireylerde büyük hacimli trombositler görülmüştür. Hastalardaki ek hematolojik bulguları açıklayacak başka bir genetik bozukluk tespit edilememiş olup, bu ek bulguların genel hücresel glikolizasyondaki bozulmanın etkisiyle von Willebrand faktör multimerizasyonunda veya trombosit yüzey glikoproteinlerinin işlevini etkileyerek yol açtığı düşünülmüştür. Sonuç olarak, tez çalışması kapsamında dört farklı nadir hastalıktan etkilenmiş ailelerde genom-boyu bağlantı, homozigotluk ve ekzom dizileme analizleri gerçekleştirilmiştir. Ailelerin hastalarında ayrıntılı klinik ve laboratuvar incelemelerinin yanısıra gerektiği durumlarda histolojik analizler de yapılmış, çalışmalar sonucunda bu hastalıklardan sorumlu daha önce bildirilmemiş genetik bozukluklar tespit edilmiş, bilinen hastalıklarda yol açtıkları yeni klinik bulgular belirlenerek rapor edilmiştir.
-
ÖgeDonma-erime Stresine Dirençli Saccharomyces Cerevisiae’ Nin Evrimsel Mühendisliği Ve Moleküler Karakterizasyonu(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-07-19) Yılmaz, Ülkü ; Çakar, Zeynep Petek ; 10006408 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsSaccharomyces cerevisiae içki ve fırıncılık endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılan endüstriyel bir mikroorganizmadır. İyi karakterize edilmiş bir mikroorganizmadır ve aynı zamanda temel ve biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir. Endüstriyel uygulamalarda, donma-erime stresi özellikle donmuş hamur prosesinde genel bir stres çeşididir. S. cerevisiae’ de donma-erime stres uygulamaları, hücrelerin donma-erime stresinin ölümcül etkileri ile başa çıkabilmeleri için çok yönlü çapraz-direnç mekanizmasını uyarır. Çok yönlü stres direnci ve donma-erime toleransı elde etmek için ekstra genetik mekanizmaların donma-erime stresi varlığında uyarıldığı ve aktif oldukları düşünülmektedir. S. cerevisiae’ de donma-erime stresi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır, fakat donma-erime toleransının arkasında yer alan moleküler mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Evrimsel mühendislik, donma-erime stresine direnç gibi, özel ve istenilen fenotiplerdeki mutant suşların elde edilmesinde kullanılan “doğal” bir prosestir. Genel olarak, evrimsel mühendislik dört ana basamaktan oluşmaktadır. Bu aşamalar; genetik olarak karışık hücre populasyonunun kimyasal/fiziksel mutasyon ile elde edilmesi, istenilen özellikteki geliştirilmiş suşun elde edilmesi için tekrarlayan sikluslarda seleksiyon baskısının uygulanması, elde edilen suşun performansının analizi ve bir sonraki hedefin dizaynı. Sonuç olarak, endüstriyel uygulamalarda, yüksek derecede donma-erime stresine dirençli, mayanın kendi genomu dışında yabancı herhangibir gen içermeyen, geliştirilmiş ekmek maya hücrelerinin kullanımı, daha güvenli ve kabul edilebilirdir. Böylece, bu yöntem, donma-erime stres direnci ile sonuçlanan yüksek derecede regüle edilmiş genomu ile ekmek mayasının endüstride kullanımının güvenli bir yoludur.
-
ÖgeDuktal Meme Kanseri Olgularında Cyp17a1 Ve Cyp19a1 gen Bölgelerinin Ekspresyonlarının Ve Aromataz Aktivitelerinin İncelenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017-01-16) Tüzüner, Mete Bora ; Bermek, Hakan ; 10135333 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMeme kanseri tüm dünyada kadınlar arasında en sık görülen kanser türüdür. 2012 yılı verilerine göre yaklaşık 1.7 milyon yeni meme kanseri tanısı konulmuştur. Genel olarak bakıldığında ise en sık rastlanan ikinci kanser türüdür. Bunun anlamı tüm yeni tanı konmuş kanserlerin %12'sini ve tüm kadınlarda görülen kanserlerin %25'ini meme kanseri oluşturmaktadır. Sıklık ve ölüm oranları özellikle Türkiye gibi gelişmekte olan ülkelerde artış göstermektedir. Meme kanseri için bazı risk faktörleri belirlenmesine karşın tanısı konulan hastaların çoğu için spesifik risk faktörleri tespit etmek mümkün değildir. Yüksek penetrasyon genleri olarak adlandırılan, özellikle BRCA1, BRCA2 ve p53 gibi, bir takım genlerdeki mutasyonların meme kanseri riskini çok yükselttiği bilinmektedir. Ancak, bu mutasyonlara çok sık rastlanmaz ve dolayısıyla mevcut vakaların az bir kısmını açıklamaktadır. Erken menarş, geç menopoz, geç yaşta ilk doğum gibi endojen östrojenlere uzun süre maruz kalma ile ilişkili üreme faktörleri meme kanseri için en önemli risk faktörleri arasında yer almaktadır. Duktal epitel meme hücrelerindeki proliferasyonun uyarılmasının, östrojenlerin karsinogenez üzerindeki ana etkisi olduğu ileri sürülmüştür. Meme kanseri sıklıkla hormonal kaynaklı olup, bu kanseri modifiye eden risk faktörleri menopoz öncesi ve menopoz sonrası teşhis edildiğinde farklılıklar göstermektedir. Yirmi yılı aşkın süredir süren yoğun çalışmalar ve klinik gözlemler kadınlarda menopoz sonrası yumurtalık fonksiyonlarının kaybedilmesine rağmen cinsiyet steroid hormonlarının sentezlenmesinin devam ettiğini kanıtlamıştır. Günümüzde, yumurtalık dışı bazı dokuların yumurtalıklardakine benzer ve patolojik bir takım sonuçlara sebebiyet verebilecek kapasitede hormon sentezi yapabilecek bir enzimatik sisteme sahip olduğu bilinmektedir. Menopoz sonrası kadınlarda, dolaşımdaki plasma östrojen seviyelerinin düşük olduğu bilinmektedir ancak meme karsinogenezinde gerçekleşen lokal ve intratümoral sentez, tümör dokularında yüksek seviyelerde östrojen görülmesine neden olabilir. Bu durum genel anlamda "intrakrin etki" olarak adlandırılır. İntrakrinoloji teriminin ortaya atılmasının ardından yirmi yılı aşkın bir süre geçmesine karşın halen meme kanseri mikro-çevresindeki intrakrin mekanizmaları anlamak için bize yardımcı olacak bir takım sorulara henüz yanıt bulunamamıştır. Östrojen biyosentezi yolağı, kolesterolden C19 androjenler ve C18 östrojenlerin sentezine kadar bir seri uzun enzimatik adımlardan oluşur. CYP17A1 (P450c17) ve CYP19A1 (aromataz) bu seks steroidlerinin metabolizmasının merkez yolağında bulunan iki enzimdir. P450c17 ve aromatazın katalizlediği reaksiyonlar bu yolakta hız sınırlayıcı basamakları oluşturduğundan özellikle önemlidirler. C21 steroidlerinin P450c17 tarafından hidroksilasyonu ve ardından parçalanmasıyla C19 steroidleri androstenedion ve dehidroepiandrosteronlar sentezlenir. Aromataz ise son basamak olan androjenlerden östrojenlerin sentezini katalizler. Mevcut çalışmalardan elde edilen bilgiler CYP17A1 ve CYP19A1 lokal gen ifade seviyelerinin potansiyel prognostik moleküler marker olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızda invaziv duktal meme kanseri doku örneklerindeki CYP17A1 ve CYP19A1 genlerinin lokal ifadesi ve aromatazın spesifik aktivitesi incelenmiştir. Böylelikle bu parametrelerin tümör dokusunun kendi içerisindeki ve/veya çevresindeki östrojen üretimini nasıl etkilediğini değerlendirmek mümkün olmuştur. Gen ifadesi ve aromataz aktivite seviyelerinin yanı sıra hastalara ait bilinen meme sağlığı risk faktörleri ve klinikopatalojik parametreler dikkate alınarak tümör gelişimine olan etkileri incelenmiştir. Ayrıca klinik anlamda bakıldığında, östrojen bağımlı meme kanseri vakalarında aromataz aktivite seviyelerini hassas, doğru ve hızlı bir şekilde ölçen bir yönteme ihtiyaç olduğu görülmektedir. Bu amaç doğrultusunda meme dokusundan spesifik aromataz aktivite ölçümlerinin gerçekleştirilebileceği radyoimmün test ve likit kromatografi-sıralı kütle spektrometresi yöntemleri geliştirilmiştir. Her bir hastaya (n= 20) ait bir tümör (T) ve bir çevre adipoz (P) meme doku örneği toplanmıştır. Alınır alınmaz sıvı azot ile dondurulan doku örnekleri RNA ve mikrozom izolasyonu yapılana kadar -80°C'de muhafaza edilmiştir. CYP17A1 ve CYP19A1 genlerinin dokulardaki ifade düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile incelenmiştir. Tüm hastalar menopoz sonrası durumunda olup, duktal invaziv meme kanseri tanısı konmuş ve sınıflandırma açısından luminal A tipine dahil olan vakalarıdır. Hastalar klinikopatolojik parametrelere ve taşıdıkları meme kanserine yakalanma risk faktörlerine göre gruplandırılmışlardır. Bunlara ek olarak meme küçültme ameliyatı olan ve herhangi bir kanser geçmişi olmadığı bilinen, menopoz öncesi durumdaki 12 hastanın rezeksiyon materyallerinden, kontrol grubu olarak kullanılmak üzere meme adipoz doku örnekleri (N) alınmıştır. Testosteronun 17ß-estradiole dönüşümü radyoimmün test ve likit kromatografi-sıralı kütle spektrometresi yöntemleri kullanılarak tespit edilerek mikrosomal fraksiyonlardaki spesifik aromataz aktivitesi hesaplanmıştır. Mikrozomal fraksiyon her bir örnekten diferansiyel santrifüjleme ile elde edilmiştir. Örneklerdeki toplam protein miktarı bikinkoninik asit protein analiz yöntemi ile tespit edilmiştir. Gruplar arası mRNA seviyelerindeki ve spesifik aromataz aktivitelerindeki anlamlı farklılıkların belirlenmesinde uygunluğuna göre Wilcoxon, Mann-Whitney U ve McNemar testleri gibi non-parametrik testler ile analizler gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar meme tümörü mikro-çevresinde gerçekleşen ve kötü huylu meme kanseri epitel hücrelerinin proliferasyonunda temel bir rol üstlenen estradiol biyosentezinin, CYP17A1 ve CYP19A1 gen ifadeleri ve lokal aromatizasyon aktivitesi tarafından etkilendiğini göstermektedir. Doku tiplerine göre bakıldığında CYP17A1 gen ifadesi seviyeleri sağlıklı bireylerdeki meme dokusunda (N) en yüksek olmak üzere, ardından tümörün çevresinde yer alan doku (P) ve tümör dokusunun kendisi (T) şeklinde sıralanmaktadır. CYP19A1 gen ifadesi seviyesi ise çevre dokularda diğer doku gruplarına göre oldukça yüksek bulunmuştur. Tüm vakalara bakıldığında, çevre dokularda tümöre göre CYP19A1'in kuvvetli bir şekilde upregüle olduğu (p=0.001) buna karşın CYP17A1'de ise hafif bir upregülasyon (p=0.687) olduğu gözlenmiştir. Bulgular menapoz sonrası dönemde estrojen kaynağının tümörün yakın çevresinde yer alan fibroblast ve preadipozit hücreler olduğu hipotezini destekler niteliktedir. Mevcut literatür bilgisi dikkate alınarak iki gen birlikte ifade düzeylerine göre lokal estrojen sentezini arttırıcı (IP) ve azaltıcı (DP) olarak gruplanarak analiz edilmiştir. CYP17A1 ve CYP19A1'in upregüle ve değişmemiş olduğu durumların birleşiminden oluşan arttırıcı grubun, çevre dokularda görülen yüksek aromataz aktivitesi ile korelasyona sahip olduğu tespit edilmiştir. Çevre doku ve tümör doku arasındaki gen ifade seviyelerini farkının birçok hasta karakteristiği tarafından etkilendiği görülmüştür. Özetle, bu çalışma meme kanseri mikroçevresindeki CYP17A1 ve CYP19A1 gen ifadesi değişimlerinin, karmaşık bir mekanizma üzerinden meme kanseri gelişimini etkilediği göstermektedir. Bahsedilen genlerin ifadesi ile birlikte meme tümörü mikroçevresindeki aromataz aktivitesinin çeşitli klinikopatolojik bulgular ve hastalık risk faktörleri de dikkate alınarak incelenmesinin, klinisyenlere kişiye göre, özelikle menapoz sonrası hastalarda, teşhis ve tedavi stratejilerini belirlemede yardımcı olacağı düşünülmektedir. Çalışma sonucu geliştirilmiş olan likit kromatografi-sıralı kütle spektrometresi yöntemi hızlı ve spesifik aromataz aktivite ölçümü için rutinde kullanılabilecek yüksek çıktılı bir analiz olma potansiyeli yüksektir. Ancak daha etkin ve güvenilir sonuçlar elde etmek adına, steroidogenez yolağındaki bölgesel östrojen sentezini etkileyebilecek 3β-hidroksisteroid dehidrogenaz ve 17β-hidroksisteroid dehidrogenaz gibi diğer önemli enzimlerin de aktivite değişimlerini değerlendirerek, daha büyük bir örneklem boyutu ile çalışmalar düzenlemek faydalı olacaktır.
-
ÖgeEndüstriyel Uygulamalar İçin Yeni Biyokatalizörlerin Geliştirilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-02-22) Binay, Barış ; Karagüler, Nevin Gül ; 0 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsKüresel ısınma odaklı tartışmalar ve bu konuda oluşan kaygılar son yıllarda bilim insanları ve toplum içinde giderek artmaktadır. Bu durum, petrol kaynaklı üretimler yerine yenilenebilir biyolojik kaynaklara yönelimi teşvik etmektedir. “Yeşil proses” olarak adlandırılabilecek biyokatalizörlerin farklı endüstriyel alanlarda kullanımının önemi yakın zamanda idrak edilmiştir. Kimyasal katalizörler yerine hayvansal, bitkisel ve bakteriyel kaynaklardan elde edilen enzimlerin kullanımı endüstriyel proseslerde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Kiral merkezli moleküllerin sentezi kimyasal yöntemlerle gerçekleştirildiğinde rasemik karışımlar elde edilmektedir. Enzimatik reaksiyonlar ise enantiomerik saflıkta ürün üretimine imkan verdiklerinden, biyokatalizörlerin kiral bileşik üretiminde kullanılması çok uygundur. Biyokatalizör kullanımının diğer avantajları enzimlerin biyobozunur olmaları, katalizledikleri reaksiyonda stereo-seçici, bölgesel-seçici ve kimyasal-seçici davranmaları, görece düşük sıcaklıkta, ılıman pH ve basınç koşullarında fonksiyon göstermeleri ve çevre dostu olmaları şeklinde sıralanabilir. Bu avantajlarından dolayı biyokatalizörlerin tıp, kimya, gıda üretimi ve tarım endüstrilerinde kullanım alanları giderek artmaktadır. Fakat doğal çevreden izole edilen enzimlerin doğrudan endüstriyel proseslerde kullanılabilmeleri herzaman mümkün olmamaktadır. Enzim karakteristik özelliklerinin (aktivite, stabilite, çözünürlük, substrat ve koenzim seçiciliği ve optimum pH aralığı) sıklıkla ilgili endüstriyel üretime göre optimize edilmesi gerekmektedir. Protein mühendisliği yöntemleri, ilgili proses koşullarına uygun enzimlerin dizayn edilmesine olanak tanımaktadır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji tekniklerinin kullanılması yolu ile enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının moleküler düzeyde anlaşılıp, genetik yapılarının değiştirilerek, istenilen yapı ve fonksiyona sahip yeni enzimlerin üretilmesini mümkün kılmaktadır. Burada, endüstriyel öneme sahip olan Bacillus stearothermophillus laktat dehidrogenaz (bsLDH) ve Rhodotorula graminis fenilalanin liyaz (rgPAL) olarak adlandırılan enzimlerin substrat özgüllüklerinin iyileştirilmesini hedefledik. Bu iki enzimin özelliklerinin iyileştirilmesi için protein mühendisliğinin üç yöntemi uygulanmıştır; DNA shuffling (DNA karıştırma), bölgeye özel mutasyon yaklaşımları ile kombinatoryal saturasyon aktif bölge testi (CASTing). bsLDH’ın substrat spesifikliği, DNA karıştırma ve bölgeye özel mutasyon yaklaşımları ile başarıyla değiştirilmiştir. rgPAL’ın aktivitesi ise seçilen farklı substratlara karsı CASTing yöntemi kullanılarak arttırılmıştır. Bu tez kapsamında yeni bsLDH ve rgPAL proteinlerinin üretilmesine yönelik farklı stratejiler detaylı bir şekilde incelenmiştir. Üç deneysel bölümden oluşan tezin ilk iki bölümü bsLDH’ın düzenlenmesini tanımlarken, son bölüm rgPAL için CASTing metodunun uygulanmasını açıklamaktadır. bsLDH, okzo-asitlerin (pirüvat) hidroksi asitlere (laktat) karşılıklı dönüşüm reaksiyonunu NADH/NAD+ çiftini redoks kofaktörü olarak kullanarak katalizler. Enzim, eczacılık ve tarım alanında anahtar role sahip kiral moleküllerin sentezinde kullanılan ara ürünlerin üretiminde kullanıldığından ticari öneme sahiptir. İlgili okzo-asitlerin kiral hidroksi asitlerinin yüksek stereokimyasal seçicilikle üretilmesine imkan vermesine rağmen; bsLDH enziminin en önemli dezavantajı son derece sınırlı substrat özgüllüğüne sahip olmasıdır. Tezin ilk kısmında; bsLDH’ın substrat seçiciliğini değiştirmek için DNA karışım yöntemi kullanılmıştır. DNA karışım yöntemi ile elde edilen rekombinant mutant bsLDH kolonilerinden, malatın oksidasyonunu katalizleyebilenler uygun tarama ve seçme test yöntemi kullanılarakdiğerlerinden ayırt edilmişlerdir. Yönlendirilmiş evrim sonucunda sekiz (8) tane amino asit değişimine - Asn4Gln, Ser19Thr, Gln86Arg, Thr91Ser, Ala173Val, Glu183Asp,Gln221Asn ve Val267Thr- sahip olan mutant bsLDH proteininin substrat seçiciliğini pirüvat/laktatdan okzaloasetat/malata değiştirmiştir. Bahsedilen sekiz mutasyonun bsLDH’de malat dehidrogenaz aktivitesi oluşumuna neden olduğu ve malatın oksidasyonunu, pirüvata kıyasla 1009 kat daha hızlı olacak şekilde gerçekleştirdiği görülmüştür. Bu sonuç, yapı bilgisi kullanılarak yüksek verimli tekli mutasyonlarla hedeflenenin gerçekleştirildiği tasarımlara göre, yönlendirilmiş evrimin de özgüllüklerde yüksek değişikliklere yol açabileceğini göstermiştir. Tezin ikinci kısmında; X-ışını kristal yapısı ve biriken literatür bilgisi kullanılarak bsLDH rasyonel olarakmandelik asitle reaksiyona girecek şekilde dizayn edilmiştir. Mandelat dehidrogenaz aktivitesi, InsightII moleküler modelleme programı kullanılarak; bsLDH enziminde oluşturulmuştur. Modelleme programı enerji minimizasyonu sonucunda; Thr246Gly ve Ile240Ala mutasyonları ile bsLDH enziminin L-mandelik asidi substrat olarak kullanabileceği gösterilmiştir. Mutanlar oluşturulmuş ve mutant gen E.coli‘ye aktarılarak sentezi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca mutant ve doğal bsLDH‘i saflaştırmak için TAGZyme saflaştırma sistemi oluşturulmuştur. Rasyonel olarak tasarlanan bsLDH’ın aktivitesi mandelat varlığında ölçülmüştür. Enzim kinetiği sonuçları, bu iki mutasyonun, yüksek saflıkta elde edilen mutant bsLDH’ın substrat özgüllüğünü laktatdan L-mandelik asite dönüştürdüğünü göstermiştir. Tezin son kısmında; E.coli’ye ekspresyon vektörüyle klonlanmış Rhodotorula graminis kaynaklı fenilalanin amonyum liyaz (rgPAL) enziminin doğal olmayan amino asitlere karşı aktivite kazandırılmasını amaçladık. PAL, oksijensiz ortamda L-fenilalaninin trans-sinamik aside dönüşümünü katalizlemektedir. Bu reaksiyonun geri dönüşüm reaksiyonu, farmakoper olarak birçok peptidomimetrik ilaç molekülünün üretiminde L-fenilalanin analoglarının sentezinde kullanıldığından, enzim kimya endüstrisinde özel bir öneme sahiptir. Yarı rasyonel dizayn olarak değerlendirilen CASTing metodu çerçevesinde, her bir kütüphane için en az iki tane amino asit içeren beş kütüphane oluşturulmuştur. NRT yıkıcı kodon olarak bütün kütüphaneler için kullanılmıştır. 2000 koloni, geliştirilen protokol 1 ile taranmıştır. Birçok tarama adımından sonra seçilen substrata karşı yüksek aktivite gösteren dört rgPAL varyantı belirlenmiştir. PAL varyantlarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için iki tane test yöntemi geliştirilmiştir. Birinci test yöntemi, elde edilen kütüphaneleri taramak ve oluşan trans sinamik asit (t-CA) miktarını ölçmek için uygulanmıştır. İkinci test yönteminde ise, belirleyici enzim olarak kullanılan oksidaz enzimi, PAL enzimleri tarafından üretilen fenilalaninin miktarının niceleyici olarak ölçülmesine olanak tanıyacak şekilde eşleştirilmiştir. Uygun saflaştırma prosesleri sonrasında, mutant bsLDH ve rgPAL enzimleri kinetik olarak karakterize edilmişlerdir. Enzim kinetiği çalışmaları, bsLDH ve rgPAL enzimlerinin substrat özgüllüklerinin başarılı bir şekilde değiştirildiğini göstermiştir. Elde edilen bu sonuçlar, uygun strateji uygulandığında protein mühendisliğinin, enzimlerin yeniden tasarlanmasında çok güçlü bir teknoloji olduğunu göstermiştir.
-
ÖgeEnterobacter Grubu Mikroorganizmaların Kolon Kanseri Üzerine Etkilerinin Araştırılması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-12-27) Yurdakul, Dilşad ; Karataş, Ayten ; 10022853 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBakteri türleri ve kanser arasındaki ilişkiyi tespit etmek üzere pek çok çalışma yapılmıştır. Fakat Enterobacter spp. ve kolon kanseri arasındaki muhtemel ilişkiyi gösterebilecek herhangi bir girişimde bulunulmamıştır. Bu nedenle, bu çalışmada, Enterobacter grubu mikroorganizmaların kolon kanseri üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmaktadır. Test edilen suşlardan altısı CRL1790 veya NCM460 hücre hattı üzerinde etkili olarak tanımlanmıştır. Bütün etkili suşlar, en uygun konsantrasyonlarda hücre canlılığı ve çoğalmasını arttırmış, apoptozu düşürmüştür. COX-2 ekspresyonu negatiftir. Etkili suşlardan üçünün NFKB ve Bcl2 ekspresyonunu arttırarak apoptozu düşürdüğü saptanmıştır. Bunlardan birisi ise CRL1790’da CD24 seviyesini arttırmıştır. DE8, filogenetik analize göre başka bir yolak takip ederek CRL1790’da CD24 seviyesini ve NFKB ekspresyonunu arttırmıştır. Fakat, Bcl2 ekspresyonunu etkilememiştir. Sonuç olarak, veriler Enterobacter suşlarının kolon kanserine yol açabileceğini göstermektedir. Bu çalışma, kolon kanseri başlangıcı ve ilerlemesinde Enterobacter spp. nin klinik olarak önemli bir faktör olabileceğini gösteren ilk çalışmadır. Tedavi için yeni stratejiler geliştirilmesine yönelik çalışmalar hayvan modelleriyle genişletebilinir.
-
ÖgeEvolutionary engineering and molecular characterization of ethanol-resistant Saccharomyces cerevisiae(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) Turanlı Yıldız, Burcu ; Çakar, Z. Petek ; 323823 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and BiotechnologySaccharomyces cerevisiae'de etanol direnci, etanol üretimini etkileyen en önemli faktörlerden biri olduğu için, endüstriyel etanol üretim biyoprosesleri konusunda çalışan pek çok araştırma grubu için önemli bir konudur. Etanol direncinin moleküler mekanizması karmaşık olduğundan, bir veya birkaç gen üzerinde yapılacak değişikliklere dayalı rasyonel metabolizma mühendisliği yaklaşımı ile bu mekanizmanın aydınlatılması mümkün görünmemektedir. Bu çalışmada, etanole dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edilmesi ve karakterizasyonu için, bir tersine metabolizma mühendisliği stratejisi olan evrimsel mühendislik yöntemi benimsenmiştir. Yüksek etanol direncine sahip mutant bireyler, dereceli olarak artan etanol stres koşulları altında elde edilmiştir. Sonuçlar, benimsenen stratejinin istenilen özellikte kültürler elde etmede oldukça etkili bir yöntem olduğunu göstermiştir. Elde edilen dirençli mayaların karakterizasyonu da gerçekleştirilmiştir. Etanol stresi altında etanole dirençli mayalarda eşey tipi dönüşümü ve buna bağlı diploitleşmenin meydana gelişi, endüstriyel maya suşlarında olduğu gibi, etanole dirençli laboratuvar suşlarında da birden fazla kromozom kopyası bulundurma (multi-ploidy) eğilimini ortaya koymuştur. Bu çalışma, dereceli olarak artan etanol stresi koşullarına cevaben, S. cerevisiae hücrelerinde eşey tipi dönüşümünün tetiklendiğini ortaya koyan öncü bir çalışmadır.