Anorganik Yapılara Bağlanan Peptitlerin Moleküler Araç Olarak Kullanılması

Abstract

Moleküler biyobenzetim, doğada varolan, biyomoleküllerin anorganik yapılar ile olan moleküler seviyedeki ilişkilerinden esinlenerek ortaya çıkmıştır. İleri derecede gelişmiş özelliklere sahip hibrid malzemelerin üretilmesi için anorganik yapılara bağlanabilen peptitlerin de içinde bulunduğu yeni moleküler araçlar sunmaktadır. Bu peptitlerden yararlanılarak yapılacak malzemeler bioteknoloji, nanoteknoloji, ve mikro/nanoeletronik gibi birçok alanda kullanılabilir. Terminolojide genetik olarak modifiye edilmiş anorganik yapılara bağlanabilen peptitler (GEPI) olarak bilinen bu moleküler araçlar, faj- ve hücre- gösterimi gibi kombinatoriyel biyolojide kullanılan methodlarla elde edilirler. FM, SPR, QCM, ve AFM gibi teknikler ile karakterize edildikten sonra GEPI’ler; bu tezin içerdiği çalışmalarda moleküler ölçekte organize edici, bağlayıcı, sentezleyici olarak kullanılmış, bu sayede aynı amaçlar için klasik olarak kullanılan sentetik moleküllerin taşıdığı dezavantajlar ortadan kaldırılarak farklı uygulamalara hizmet edebilecek, fonksiyonel yeni platformlar hazırlanmıştır. İlk olarak, spesifik olarak yüzeyi tanıması ve protein mühendisliğindeki uygulanabilirliği baz alınarak, altına bağlanabilen peptitlerden biri olan GBP1’in, AP enzimine eklenmesi sonucu ortaya çıkan recombinant proteinin mikro desenli veya düz altın yüzeylere belli bir noktadan (site-specific) tutunması gösterilmiştir. Ayrıca, GEPI’lerin uCP ve DPN gibi desenleme teknikleri kullanılarak yüzeye mikro/nano boyutlarda desenleri oluşturulmak suretiyle protein ve nanoparçacık arrayleri hazırlanmasında bağlayıcı molekül olarak kullanılabilecekleri gösterilmiştir. İki farklı anorganik yapıya bağlanan aminoasit dizileri içeren iki fonksiyonlu peptitlerin (Bi-GEPIs) kullanılması ile nanoparçacıların yüzeye immobilize (“Self-assembly” yoluyla) olmaları sağlanmıştır. Altın ve gümüş nanoparçacıklarının cam yüzeyine; silika nanoparçacılarının da altın yüzeyine bu peptitler aracığı ile tutunabildikleri gösterilmiştir. Ayrıca, makro büyüklükte düz bir yüzey yerine nano boyutlardaki silika parçacıkları da uygun Bi-GEPI kullanılarak altın nanoparçacıları ile dekore edilmiştir. GEPI’lerin nanoparçacık ve de prob molekülünü organize etmesinden yararlanarak elde edilen platformların bir uygulaması olarak, hibrid optik sensörler hazırlanmış ve uygun hedef moleküllerin algılamasında kullanılmıştır. Bu uygulamaların bir tanesinde, cam üzerine Bi-GEPI kullanılarak immobilize edilen altın nanoparçacıklar ve onların üzerine bağlanan 5GBP1-AP prob molekülünden oluşan sensör, hedef molekülü olan Anti-AP deteksiyonunda ~30 nM’ye kadar inebilmiştir. Protein ve nanoparçacıkların immobilizasyonu ve mikro/nano boyutlardaki organizasyonlarının sağlanması dışında, GEPI’ler, optik olarak aktif, hibrid nanoyapıların olışturulmasında da kullanılmış; silika nanoparçacıklarının etrafının altın ile kaplanmasını sağlamıştır. Sonuç olarak elde edilen bu parçacıkların LSPR λmaks’sında görünür bölgeden IR bölgesine kayma gözlenmiştir ki bu bölgede biyolojik materyaller ışığı çok az absorbe etmektedirler. Genel olarak bakıldığında bu doktora çalışmasında elde edilen sonuçlar, açıkça GEPI’lerin yeni, fonksiyonel ve farklı ölçeklerde platformların ortam koşullarında hazırlanmasında kullanılabilecek kapasitede olduğunu ve daha sonra bu platformların da protein mikro/nanoarray sistemler, biyosensörler, moleküler görüntüleme ve hedefleme gibi amaçlar için kullanılabileceklerini göstermektedir.

Molecular biomimetics has emerged from the inspiration from nature regarding to the interactions between biomolecules and inorganic materials at molecular level. This area has potential to provide novel molecular tools involving polypeptides with affinity towards inorganic surfaces. These peptides are used to produce new hybrid materials with advanced properties that can be utilized for various applications in different areas such as biotechnology, nanotechnology, and micro/nanoelectronics. Inorganic binding peptides, known as genetically engineered polypeptides for inorganic surfaces (GEPIs), are isolated using combinatorial biology protocols such as phage- and cell-surface display technologies. Following successful qualitative and quantitative molecular characterization using FM, SPR, QCM, and AFM, these peptides were used in this thesis as assembler, linker, and synthesizer to fabricate new functional platforms for different purposes avoiding potential problems or limitations associated with the conventional chemical methods. Firstly, due to the specific surface recognition and ease of genetic manipulation, utilization of gold binding peptide (GBP1) as a molecular linker genetically fused to AP enzyme was demonstrated for site-specific protein immobilization on non-patterned and micro-patterned gold substrates. Moreover, in protein and nanoparticle patterning, GEPIs were shown to be successful “ink” (molecular linker) for lithography techniques, i.e. uCP and DPN. Through self-assembly process, bifunctional GEPIs containing two different inorganic binding sequences, e.g., gold, silver and silica were used to immobilize gold and silver nanoparticles on silica and also, silica nanoparticle attachment was accomplished on gold substrates. At nano-scale level, Bi-GEPI was also used to decorate silica nanoparticles with gold nanoparticles. As an application of these platforms that GEPIs provide the assembly of nanoparticles and probe molecules, optical hybrid sensors composed of noble metal nanostructures and GEPI-linked probes were fabricated and utilized to detect appropriate targets. For example, glass slides where gold nanoparticles were assembled via Bi-GEPI, were utilized as platform to achieve the detection of target molecules (Anti-AP) with concentration of down to ~30 nM through a GEPI-based probe, 5GBP1-AP. Apart from assembly and micro/nano-organization of proteins and nanoparticles on solid substrates, GEPI was also employed in synthesis of optically active hybrid nanostructures where the peptide acted as nucleation site for gold formation around silica nanoparticles, resulting a red shift at corresponding LSPR λmax from vis to IR region where biological components in tissue barely absorb the light. Overall, the results reported in this thesis clearly show that polypeptides with binding affinity and specificity towards inorganic surfaces have great potential to prepare new functional platforms at different scale and under ambient conditions, which then, can be used for various purposes such as in preparation of protein micro/nano-arrays, biosensors, and reagents for molecular imaging and targeting.