Yönlendirilmiş Evrim Yöntemiyle Saccharomyces Cerevısıae’nın Endüstriyel Açıdan Önemli Özelliklerinin Geliştirilmesı

Abstract

Genel olarak ekmek üretimi, bira üretimi ve fermentasyon gibi pek çok biyoteknolojik süreçte, maya hücreleri çok çeşitli stres koşullarına maruz kalmaktadır. Binlerce yıllık biyoteknolojik kullanım Saccharomyces cerevisiae mayasını evcilleştirerek çok çeşitli uygulamalar için farklı suşlarının gelişmesine yol açmıştır. Bununla birlikte çeşitli stres koşullarına dayanıklı maya suşlarının elde edilmesi halen endüstriyel uygulamaların en önemli gereksinimlerinden biridir. Stres adaptasyon mekanizmalarının ökaryotlar arasında genellikle benzer olması sebebiyle, bir model organizma olan Saccharomyces cerevisiae’nın stres tepki mekanizmaları önemli ölçüde ilgi çekmektedir. Diğer yandan, çeşitli streslere dayanıklı fenotipler klasik metabolik mühendislik stratejileri ile elde edilmesi kolay olmayan çok faktörlü genetik farklılaşmalara sahiptir. Bu nedenle, rastgele mutasyon ve seleksiyona dayalı deneysel prosedürler, stres koşullarına dayanıklılığın optimize edilmesi açısından yararlı yaklaşımlardır. Bu çalışmada ozmotik, tuz ve asit streslerine dayanıklı maya hücreleri elde etmek amacıyla, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik stratejisi uygulanmıştır. Bu amaçla, S. cerevisiae başlangıç populasyonunun genetik çeşitliliği, etil metan sülfonata maruz bırakılarak arttırılmıştır. Bu mutant popülasyona, stres düzeyi sürekli ve kademeli olarak arttırılarak kesikli seleksiyon stratejisi olarak uygulanmıştır. Ozmotik, tuz ve asit stres seleksiyonlarının, uygulanan en yüksek stres koşulunda hayatta kalabilen son populasyonlarından rastgele bireyler seçilmiştir. En muhtemel sayı (MPN) ve seri seyreltme yöntemleriyle tuza ve sorbitole dirençli bireylerin, hem seçildikleri stres koşuluna hem de olası çapraz dirençleri belirlemek için endüstriyel açıdan önemli diğer stres türlerine dirençleri incelenmiştir. Bu streslere, oksidatif, etanol, donma-erime,ısı ve bazı ağır metal stresleri dahildir. Ayrıca oksidatif stres ve kontrol koşullarında mutantların katalaz aktiviteleri incelenmiştir. Tuz stresine en dirençli bireylerden biri olarak seçilen ‘T8’ mutantının tetrat analizi sonucu strese direncini sağlayan mutasyonun tek bir resesif gen mutasyonundan kaynaklandığı belirlenmiştir. Son olarak T8 mutantının, stres koşullarında belirli genlerinin ekspresyon düzeyleri kantitatif olarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile incelenerek yaban türün ekspresyon düzeyleri ile karşılaştırılmıştır. İlginç olarak, stres direnci ile ilgili olduğu beklenen belirli genlerin ekspresyon düzeylerinin, mutantta stressiz koşullarda bile yaban türe kıyasla yüksek olduğu gözlenmiştir. Transkriptomik analizleri içerecek yeni deneysel çalışmalar, karmaşık direnç mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olabilecektir.

Generally, in many biotechnological processes such as baking, brewing and wine fermentation, yeast cells are exposed to a variety of stress conditions. Usage for thousands of years has domesticated Saccharomyces cerevisiae and resulted in the development of various strains for specific applications. However, obtaining multiple stress resistant yeast is still an important requirement of the industry. Since principles of stress adaptation are generally similar in eukaryotes, stress response mechanism of Saccharomyces cerevisiae, as a model organism, has attracted significant attention. On the other hand, multiple stress resistant phenotypes appear to have multi-factorial alterations which are not easy to obtain via classical metabolic engineering strategies. Thus, empirical procedures based on random mutation and selection are useful approaches to optimize robustness. In this study, ‘evolutionary engineering’ an inverse metabolic engineering strategy was applied to obtain osmotic, salt and acid stress resistant mutants. For this purpose, genetic diversity of S. cerevisiae initial population was increased by exposure to ethyl methane sulphonate mutagen. Batch selection strategies were applied to this mutant population by applying stress conditions continuously, at gradual increasing levels. Individuals were selected randomly from the final populations of osmotic, salt and acid stress selection, which have survived in the highest possible stress conditions. By most probable number ‘MPN’ and serial dilution method, salt and sorbitol resistant individuals were investigated for their resistance to the stress type at which they have been selected and to other industrially relevant stress types, to detect any potential cross-resistance. Those stresses included oxidative, ethanol, freezing- thawing, heat and some heavy metal stresses. Also catalase activities of the mutants were measured under control and oxidative stress conditions. Tetrad analysis of ‘T8’ mutant, which was one of the highest resistant individual to salt stress, indicated that a single recessive gene mutation was responsible for the resistance. Finally, expression levels of particular genes of mutant T8 in stress conditions were investigated quantitatively using real time PCR and compared to wild type expression levels. Interestingly, expression level of particular genes which were expected to be important for resistance had increased in the mutant compared to wild type, even in the absence of stress conditions. Future experimental studies including transcriptomic analysis could help to clarify the complex mechanism of stress resistance.