Duktal Meme Kanseri Olgularında Cyp17a1 Ve Cyp19a1 gen Bölgelerinin Ekspresyonlarının Ve Aromataz Aktivitelerinin İncelenmesi

Abstract

Meme kanseri tüm dünyada kadınlar arasında en sık görülen kanser türüdür. 2012 yılı verilerine göre yaklaşık 1.7 milyon yeni meme kanseri tanısı konulmuştur. Genel olarak bakıldığında ise en sık rastlanan ikinci kanser türüdür. Bunun anlamı tüm yeni tanı konmuş kanserlerin %12'sini ve tüm kadınlarda görülen kanserlerin %25'ini meme kanseri oluşturmaktadır. Sıklık ve ölüm oranları özellikle Türkiye gibi gelişmekte olan ülkelerde artış göstermektedir. Meme kanseri için bazı risk faktörleri belirlenmesine karşın tanısı konulan hastaların çoğu için spesifik risk faktörleri tespit etmek mümkün değildir. Yüksek penetrasyon genleri olarak adlandırılan, özellikle BRCA1, BRCA2 ve p53 gibi, bir takım genlerdeki mutasyonların meme kanseri riskini çok yükselttiği bilinmektedir. Ancak, bu mutasyonlara çok sık rastlanmaz ve dolayısıyla mevcut vakaların az bir kısmını açıklamaktadır. Erken menarş, geç menopoz, geç yaşta ilk doğum gibi endojen östrojenlere uzun süre maruz kalma ile ilişkili üreme faktörleri meme kanseri için en önemli risk faktörleri arasında yer almaktadır. Duktal epitel meme hücrelerindeki proliferasyonun uyarılmasının, östrojenlerin karsinogenez üzerindeki ana etkisi olduğu ileri sürülmüştür. Meme kanseri sıklıkla hormonal kaynaklı olup, bu kanseri modifiye eden risk faktörleri menopoz öncesi ve menopoz sonrası teşhis edildiğinde farklılıklar göstermektedir. Yirmi yılı aşkın süredir süren yoğun çalışmalar ve klinik gözlemler kadınlarda menopoz sonrası yumurtalık fonksiyonlarının kaybedilmesine rağmen cinsiyet steroid hormonlarının sentezlenmesinin devam ettiğini kanıtlamıştır. Günümüzde, yumurtalık dışı bazı dokuların yumurtalıklardakine benzer ve patolojik bir takım sonuçlara sebebiyet verebilecek kapasitede hormon sentezi yapabilecek bir enzimatik sisteme sahip olduğu bilinmektedir. Menopoz sonrası kadınlarda, dolaşımdaki plasma östrojen seviyelerinin düşük olduğu bilinmektedir ancak meme karsinogenezinde gerçekleşen lokal ve intratümoral sentez, tümör dokularında yüksek seviyelerde östrojen görülmesine neden olabilir. Bu durum genel anlamda "intrakrin etki" olarak adlandırılır. İntrakrinoloji teriminin ortaya atılmasının ardından yirmi yılı aşkın bir süre geçmesine karşın halen meme kanseri mikro-çevresindeki intrakrin mekanizmaları anlamak için bize yardımcı olacak bir takım sorulara henüz yanıt bulunamamıştır. Östrojen biyosentezi yolağı, kolesterolden C19 androjenler ve C18 östrojenlerin sentezine kadar bir seri uzun enzimatik adımlardan oluşur. CYP17A1 (P450c17) ve CYP19A1 (aromataz) bu seks steroidlerinin metabolizmasının merkez yolağında bulunan iki enzimdir. P450c17 ve aromatazın katalizlediği reaksiyonlar bu yolakta hız sınırlayıcı basamakları oluşturduğundan özellikle önemlidirler. C21 steroidlerinin P450c17 tarafından hidroksilasyonu ve ardından parçalanmasıyla C19 steroidleri androstenedion ve dehidroepiandrosteronlar sentezlenir. Aromataz ise son basamak olan androjenlerden östrojenlerin sentezini katalizler. Mevcut çalışmalardan elde edilen bilgiler CYP17A1 ve CYP19A1 lokal gen ifade seviyelerinin potansiyel prognostik moleküler marker olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızda invaziv duktal meme kanseri doku örneklerindeki CYP17A1 ve CYP19A1 genlerinin lokal ifadesi ve aromatazın spesifik aktivitesi incelenmiştir. Böylelikle bu parametrelerin tümör dokusunun kendi içerisindeki ve/veya çevresindeki östrojen üretimini nasıl etkilediğini değerlendirmek mümkün olmuştur. Gen ifadesi ve aromataz aktivite seviyelerinin yanı sıra hastalara ait bilinen meme sağlığı risk faktörleri ve klinikopatalojik parametreler dikkate alınarak tümör gelişimine olan etkileri incelenmiştir. Ayrıca klinik anlamda bakıldığında, östrojen bağımlı meme kanseri vakalarında aromataz aktivite seviyelerini hassas, doğru ve hızlı bir şekilde ölçen bir yönteme ihtiyaç olduğu görülmektedir. Bu amaç doğrultusunda meme dokusundan spesifik aromataz aktivite ölçümlerinin gerçekleştirilebileceği radyoimmün test ve likit kromatografi-sıralı kütle spektrometresi yöntemleri geliştirilmiştir. Her bir hastaya (n= 20) ait bir tümör (T) ve bir çevre adipoz (P) meme doku örneği toplanmıştır. Alınır alınmaz sıvı azot ile dondurulan doku örnekleri RNA ve mikrozom izolasyonu yapılana kadar -80°C'de muhafaza edilmiştir. CYP17A1 ve CYP19A1 genlerinin dokulardaki ifade düzeyleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi ile incelenmiştir. Tüm hastalar menopoz sonrası durumunda olup, duktal invaziv meme kanseri tanısı konmuş ve sınıflandırma açısından luminal A tipine dahil olan vakalarıdır. Hastalar klinikopatolojik parametrelere ve taşıdıkları meme kanserine yakalanma risk faktörlerine göre gruplandırılmışlardır. Bunlara ek olarak meme küçültme ameliyatı olan ve herhangi bir kanser geçmişi olmadığı bilinen, menopoz öncesi durumdaki 12 hastanın rezeksiyon materyallerinden, kontrol grubu olarak kullanılmak üzere meme adipoz doku örnekleri (N) alınmıştır. Testosteronun 17ß-estradiole dönüşümü radyoimmün test ve likit kromatografi-sıralı kütle spektrometresi yöntemleri kullanılarak tespit edilerek mikrosomal fraksiyonlardaki spesifik aromataz aktivitesi hesaplanmıştır. Mikrozomal fraksiyon her bir örnekten diferansiyel santrifüjleme ile elde edilmiştir. Örneklerdeki toplam protein miktarı bikinkoninik asit protein analiz yöntemi ile tespit edilmiştir. Gruplar arası mRNA seviyelerindeki ve spesifik aromataz aktivitelerindeki anlamlı farklılıkların belirlenmesinde uygunluğuna göre Wilcoxon, Mann-Whitney U ve McNemar testleri gibi non-parametrik testler ile analizler gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar meme tümörü mikro-çevresinde gerçekleşen ve kötü huylu meme kanseri epitel hücrelerinin proliferasyonunda temel bir rol üstlenen estradiol biyosentezinin, CYP17A1 ve CYP19A1 gen ifadeleri ve lokal aromatizasyon aktivitesi tarafından etkilendiğini göstermektedir. Doku tiplerine göre bakıldığında CYP17A1 gen ifadesi seviyeleri sağlıklı bireylerdeki meme dokusunda (N) en yüksek olmak üzere, ardından tümörün çevresinde yer alan doku (P) ve tümör dokusunun kendisi (T) şeklinde sıralanmaktadır. CYP19A1 gen ifadesi seviyesi ise çevre dokularda diğer doku gruplarına göre oldukça yüksek bulunmuştur. Tüm vakalara bakıldığında, çevre dokularda tümöre göre CYP19A1'in kuvvetli bir şekilde upregüle olduğu (p=0.001) buna karşın CYP17A1'de ise hafif bir upregülasyon (p=0.687) olduğu gözlenmiştir. Bulgular menapoz sonrası dönemde estrojen kaynağının tümörün yakın çevresinde yer alan fibroblast ve preadipozit hücreler olduğu hipotezini destekler niteliktedir. Mevcut literatür bilgisi dikkate alınarak iki gen birlikte ifade düzeylerine göre lokal estrojen sentezini arttırıcı (IP) ve azaltıcı (DP) olarak gruplanarak analiz edilmiştir. CYP17A1 ve CYP19A1'in upregüle ve değişmemiş olduğu durumların birleşiminden oluşan arttırıcı grubun, çevre dokularda görülen yüksek aromataz aktivitesi ile korelasyona sahip olduğu tespit edilmiştir. Çevre doku ve tümör doku arasındaki gen ifade seviyelerini farkının birçok hasta karakteristiği tarafından etkilendiği görülmüştür. Özetle, bu çalışma meme kanseri mikroçevresindeki CYP17A1 ve CYP19A1 gen ifadesi değişimlerinin, karmaşık bir mekanizma üzerinden meme kanseri gelişimini etkilediği göstermektedir. Bahsedilen genlerin ifadesi ile birlikte meme tümörü mikroçevresindeki aromataz aktivitesinin çeşitli klinikopatolojik bulgular ve hastalık risk faktörleri de dikkate alınarak incelenmesinin, klinisyenlere kişiye göre, özelikle menapoz sonrası hastalarda, teşhis ve tedavi stratejilerini belirlemede yardımcı olacağı düşünülmektedir. Çalışma sonucu geliştirilmiş olan likit kromatografi-sıralı kütle spektrometresi yöntemi hızlı ve spesifik aromataz aktivite ölçümü için rutinde kullanılabilecek yüksek çıktılı bir analiz olma potansiyeli yüksektir. Ancak daha etkin ve güvenilir sonuçlar elde etmek adına, steroidogenez yolağındaki bölgesel östrojen sentezini etkileyebilecek 3β-hidroksisteroid dehidrogenaz ve 17β-hidroksisteroid dehidrogenaz gibi diğer önemli enzimlerin de aktivite değişimlerini değerlendirerek, daha büyük bir örneklem boyutu ile çalışmalar düzenlemek faydalı olacaktır.

Breast cancer is the most common cancer in women worldwide, with nearly 1.7 million new cases diagnosed in 2012. It is the second most common cancer overall. This represents about 12% of all new cancer cases and 25% of all cancers in women. The numbers of incidence and mortality is increasing especially in developing countries as well as in Turkey. Breast cancer is more commonly hormone driven and the factors that modify the risk of this cancer when diagnosed premenopausally and when diagnosed postmenopausally are not the same. Extensive research and clinical observations in the past 20 years confirmed that the cessation of ovarian function at menopause does not stop the process of sex steroid hormone synthesis in females. Currently we acknowledge that multiple extra-ovarian tissues contain the same enzymatic machinery the ovary uses which can maintain a significant rate of local hormonal synthesis sufficient to cause pathological outcomes. This is commonly termed "intracrine". The term intracrinology was first coined over 2 decades ago but there are still questions to be answered, which could help us to understand the intracrine mechanisms in the breast cancer microenvironment. CYP17A1 (P450c17) and CYP19A1 (aromatase) are two of the key enzymes in the central pathways of sex steroid metabolism. In current study, local expressions of CYP17A1, CYP19A1 genes and specific activity levels of aromatase in invasive ductal breast carcinoma tissues were investigated by means of revealing their effect over peripheral and/or intratumoral estrogen production in invasive ductal breast carcinoma tissues. The relationship between these expressions and specific activity status along with the patients' known breast health risk factors and clinicopathological parameters were also reported in order to investigate the effect of tumor progression. One tumor and one peripheral mammary adipose tissue sample (P) adjacent to the tumor was obtained from each patient (n= 20) and snap frozen in liquid nitrogen and kept at -80°C until use for the extraction of total RNA and microsome isolation. Real-time polymerase chain reaction was employed for the detection of CYP17A1 and CYP19A1 gene expression. All patients were postmenopausal, diagnosed for invasive ductal breast carcinoma and classified as luminal A. Patients were divided into groups according to cilinicopathologic features and breast cancer risk factors. In addition, 12 tumor-free breast tissue samples (N) were obtained from premenopausal women with no history of breast cancer who underwent reduction mammoplasty surgery as the control group. The conversion of testosterone to 17ß-estradiol was determined via radioimmunoassay and liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and the specific activity of aromatase in microsomal fractions were calculated. Microsomes were isolated from each specimen by employing differential centrifugation method for the activity assays. Bicinchoninic acid protein assay was used for detection and quantitation of the total protein in the samples. The acquired data pointed out the estradiol at the breast tumor microenvironment, which plays a major role in proliferation of malignant epithelial breast cancer cells, was depending on the power of local aromatization activity and the basis of this estrogen drive in the postmenopausal period is the adipose tissue adjacent to the tumor itself. The local aromatase overexpression and high aromatase activity are important factors for the survival of estrogen dependent breast carcinoma cells. Furthermore, there was a pattern consisting the combination upregulated and unaltered gene expressions of CYP17A1 and CYP19A1 which was observed to be coralated with higher aromatase activity levels in peripheral tissues compared to tumor tissues. To summarize, present study suggesting a complex breast tumor progression mechanism altered by CYP17A1 and CYP19A1 at the breast tumor microenvironment. The evaluation of various clinicopathological and disease risk factors along with the expression levels of CYP17A1 and CYP19A1 and the aromatase activity levels at breast tumor microenvironment might help clinicians to decide on treatment startegies and diagnosis for individual cases, particularly with postmenapausal status. The in-house liquid chromatography-tandem mass spectrometry method has the potential to be further developed to a commonly applied high-throughput technique for aromatase activity measurement which might be an invaluable asset for rapid and specific analysis. However, future studies must be conducted using greater sample size and addition of other key enzyme activities evaluations such as 3β-hydroxysteroid dehydrogenase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in streidogenesis pathway which effect local estrogen levels for confirmation and gettting more strong and reliable results.