FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Yüksek Lisans
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Gözat
Yayın Türü "Master Thesis" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Yüksek Lisans'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeAbrb Ve Spo0a Transkripsiyon Faktörlerinin B. Subtılıs Yvfı Promotorundaki Bağlanma Bölgelerinin Bulunması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2010-09-23) Tayran, Hüseyin ; Yazgan Karataş, Ayten ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsGram-pozitif organizmalar için model organizma olarak kabul edilen B.subtilis, ağırlıklı olarak peptid olan 20’den fazla antibiyotik üretebilmektedir. Basilisin, N ucunda L-alanine ve C ucunda doğal olmayan bir aminoasit olan L-anticapsine bulunduran iki aminoasitten oluşan bir dipeptidtir. B. Subtilis’un bazı şuşları tarafından üretilen basilisin, bazı bakteri ve mayalara karşı kullanılmaktadır ve mikrobiyal hücre duvarı sentezini engellemektedir. Basilisinin doğal olmayan L-antikapsin amino asidinin, sırasıyla ywfBG genlerinin ürünleri olan prefenat dehidrataz ve aminotransferaz enzimleri aracılığıyla üretildiği düşünülmektedir. Basilisinin biyosentezi, daha sonra bacABCDE olarak adlandırılan ywfBCDEF gen kümesi tarafından gerçekleşmektedir. Söz konusu gen kümesinin, plazmid entegrasyonu ile bozulması sonucu basilisin üretimi durmuş, ayrıca hücre özütünde basilisin sentetaz aktivitesi kaybolmuştur. Daha sonra yapılan çalışmalarda, bacABC genlerinin antikapsin üretiminden sorumlu olduğu, bacD ve bacE genlerinin ise sırasıyla amino asid ligasyonu ve basilisine karşı korunma fonksiyonlarını gerçekleştirdiği kanıtlanmıştır. phrC, comA and oppA genlerinin Tn10 mutagenez yolu ile bozulması veya comQ::cat mutasyonunun oluşturulması, basilisin biyosentezinin durmasıyla sonuçlanmıştır. Bu çalışmalar basilisin biyosentezinin global quorum sensing kontrol sistemi tarafından regule edildiğini göstermektedir. Ayrıca, basilisin üretiminin AbrB ve GTP ile negatif olarak düzenlediği gösterilmiştir. B. subtilis, vegetatif formdan durgun faza geçerken, çevresel sinyallere tepki olarak iki bileşenli sinyal iletim sitemlerinin birçoğunu ve çeşitli global düzenleyicilerini aktif hale getirir. Bu düzenleyiciler, geçiş (dönüşüm)- düzenleyicileri olarak isimlendirilir. AbrB, Spo0A, ScoC ve Cody proteinleri bu düzenleyici protein sınıfının en önemli üyelerinden birkaçıdır. AbrB ve Spo0A geçiş-düzenleyici proteinlerinin Basillus türlerinde antibiyotik ve toksin biyosentezinde önemli görevleri olduğu kesin olarak bilinmektedir. Sözkonusu basilisine geldiğimizde, basilisinin de abrB ve spo0A genleri tarafından regule edildiği gösterilmiştir. abrB geninde oluşturulan mutasyonlar sonucu basilisin üretiminde meydana gelen artış, basilisin sentezinin abrB geninin negative kontrolü altında olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada, spo0A geni bloke edildiğinde basilisin üreteminde büyük bir düşüş olduğu gösterilmiştir. Bacillus subtilis PY79 şuşunda basilisin üretimiyle ilgili genleri açığa çıkarmak için son zamanlarda yapılan Tn10 mutagenesis çalışmaları, transkripsiyonel düzenleyiciye benzeyen yvfI geninin (GntR ailesi) basilisin biyosenteziyle ilgisi olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, yvfI geninin basilisin üretiminden sorumlu olması nedeniyle, yvfI geninin düzenlenmesinde görev alan herhangi bir gen dolaylı olarak basilin üretiminden de sorumludur. Yukardaki çıkarımdan hareketle, DBTBS veritabanı (Sierro et al, 2008) kullanılarak B. subtilis yvfI geninin promoter dizisi, aday düzenleyici proteinlerin bağlanabileceği cis-elementlerinin bulunması için incelendi, ve AbrB ile Spo0A düzenleyici proteinleri için olası bağlanma bölgeleri bulundu. Elektromobility shift deneyi ile AbrB ve Spo0A proteinlerinin yvfI promoter DNA dizisine bağlandıkları bulunduktan sonra, söz konusu düzenleyici proteinlerin (trans-acting protenlerin) yvfI promoter dizisinde bağlandıkları bölgeleri açığa çıkarmak için DNase I footprinting deneyi gerçekleştirildi. Kapiler tabanlı araçtan elde edilen ve sonrasında GeneMapper programı kullanılarak düzenlenen electrophoregramlar incelendi ve her bir düzenleyici protein için yvfI promoter dizisi üzerinde bir bağlanma bölgesi bulundu. Elde edilen sonuçlar, AbrB ve Spo0A düzenleyici proteinlerinin, basilisin üretimini yvfI geninin ekspresyonunu transkripsiyon düzeyinde değiştirerek düzenlediklerini açığa çıkarmıştır.
-
ÖgeAcıgöl’deki Mikrobiyal Çeşitliliğin Ve Bu Türlerin Biyomineralizasyon Üzerindeki Etkilerinin Belirlenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-02-13) Menekşe, Meryem ; Karagüler, Nevin Gül ; 423163 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışmada, Türkiye’nin güneyinde Afyon, Denizli, Burdur il sınırları arasında yer alan aşırı tuzlu (200g/l) bir karakter gösteren Acıgöl’ün bakteriyel topluluğu belirlenmiş ve bu türlerin biyomineralizasyon üzerindeki etkileri belirlenmiştir. Acıgöl’den alınan toprak örnekleri kullanılarak %3 ve %6 NaCl içeren Nutrient Broth besiyerinde zenginleştirme kültürleri hazırlanmış ve bu kültürlerden hem tür analizleri hem de biyomineralizasyon deneyleri yapılmıştır. Göldeki bakteriyel çeşitliliğin ortaya koyulması için 16S rDNA PZR ( polimeraz zincir reaksiyonu ) metodu kullanılmıştır. Biyomineralizasyon deneyleri için gölün fizikokimyasal koşulları göz önünde bulundurularak özel bir besiyeri (%1 yeast extract, %0,1 glikoz, %0,5 pepton, % 4,5 NaCl ve 84 mM Mg+2, 11 mM Ca+2 g/L ) dizayn edilmiş ve deneyler dört farklı sodyum sülfat (Na2SO4) konsantrasyonu ( 0, 14, 28, 56 mM Na2SO4) olacak şekilde kurulmuştur. Hazırlanan besiyerleri zenginleştirme kültürleriyle aşılanmış ve 30°C’de 180 rpm’de çalkalamalı olarak inkübe edilmiştir. Oluşan mineraller saflaştırılarak XRD ve SEM ile karakterize edilmiştir. Deneyler sonucunda Acıgöl’de Halomonas, Idiomarine, Virgibacillus ve Uncultured bacteirum gibi halofil (tuz seven) türlerin baskın olduğu görülmüş ve bu türlerin Monohidrokalsit, Dypingite, Struvite, Hidromanyezit gibi minerallerin oluşumunda etkili olduğu kontrollü deneylerle gösterilmiştir.
-
ÖgeAfinite Uygulamalarını Test Etmeye Yönelik Değişken Çok İşlevli Moleküler Vektör Tasarımı(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2008-07-09) Kahraman, Hasan ; Tamerler, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBiyomoleküller peptid-protein etkileşimleri ile doğru fonksiyonel yapılar kullanı-larak her türlü materyal yüzeyine yüksek afinite ile bağlanabilir. Bizim çalışma grubumuzda işlevsel malzemeler için inorganiklere bağlanan çok farklı peptidler seçilip karakterize edilmiştir. Bu peptidler birçok biyo- ve nano-teknolojik uygulamalar için moleküler bağlayıcı olarak kullanılabilir. Ancak bu peptidlerin uygulanabilirliği yüksek afinite gösteren diğer var olan amino asit dizisinden oluşan işaret (“tag”) sistemleri ile karşılaştırılmalıdır. Burada bizim amacımız tasarladığımız vektör sistemi ile Histidin işaretli GFPuv proteinini aralarında bir bağlayıcı ile birlikte gen ifadesini sağlamaktır. Aynı vektör sistemi quartz bağlayıcı peptid (QBP) işaretli GFPuv protein için de uygulanmıştır. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan histidin işaretleme ile protein izolasyon yöntemi parallel bir çalışma ile QBP işaretli protein izolasyon yöntemi ile karşılaştırılıyor. Buradaki genel amaç uygun enzim kesim bölgelerini de içeren değişken bir vektör sistemi oluşturarak hem Histidin işaretleyici kısmı hem de biyoişlevsel protein kısmını değiştirmeye uygun başka inorganic bağlayıcı peptid işaretleyicileri ve fonksiyonel proteinler için de uygulanabilir bir yöntem geliştirmektir.
-
ÖgeAğrı Kesici Salımı Yapan Yara Örtüleri Hazırlanması Ve Karakterizasyonu(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-06-29) Şen, Beren ; Kök, Fatma Neşe ; 10115703 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsDerinin fiziksel etkenlerden, sıcaktan ya da fizyolojik sebeplerden dolayı hasar görmesine yara denir. Akut yaralar, mekanik ya da kimyasal hasarlardan ya da yanma sonucu meydana gelmektedir ve iyileme süreleri 8-12 hafta arasında değişen uzun bir süreci kapsar. Akut yaraların tedavisinde biyobozunur ve çok fonksiyonlu yara örtü malzemelerinin kullanımı medikal teknolojinin önemli çalışma konularından biridir. Yara örtü malzemeleri, yaraların iyileşmesi için nemli ortam sağlamalı, yaradan sızan fazla sıvıyı emmeli, ısı yalıtımı sağlamalı, malzeme değişimi sırasında ağrıya sebep olmamalı, toksik olmamalı ve yaranın çevresinde gaz transferini sağlamalıdır. Yaranın çeşidine uygun olarak yara örtü malzemeleri seçilmelidir. Yara örtü malzemeleri fiziksel formlarına göre film, sünger, merhem ya da jel olarak sınıflandırılabilir. Yara örtü malzemelerinde aljinat, kolajen ve kitosan son zamanlarda en sık kullanılan malzemelerdendir. Kitosan, kitin adı verilen polisakkaritin deasetillenmesi sonucu oluşmuş bir biyopolimer olup; biyobozunurluk, biyouyumluluk, toksik olmaması gibi özelliklerinden dolayı yara örtü malzemesi olarak çeşitli çalışmalarda tercih edilmektedir ve genelde film, hidrojel ya da sünger formunda kullanılmaktadır. Kitosan süngerler; yaranın etrafında gerekli nemi tutar, gaz transferini sağlar ve ayrıca yara iyileşmesine pozitif katkı sağlar. Yara örtü malzemelerinin fonksiyonellikleri değişik biyoaktif maddelerle arttırılabilinir. Yara iyileşme sürecinde ağrı kesici olarak kullanılan ilaçlardan biri ibuprofendir. Ağrı hastalarda depresyon, konsantrasyon eksikliği, uyku bozukluğu gibi çeşitli sonuçlara yol açabilir. Bu yüzden yara tedavisinde ağrı kesici kullanımı ile malzemenin fonksiyonelliğinin arttırılması hasta refahı ve kullanım kolaylığı açısından önemlidir. Kontrollü salım sistemleri sahip olduğu birçok avantaj nedeniyle, son yıllarda çeşitli tedavilerde tercih edilmektedir. Kontrollü salım sistemleri kullanılarak, ilaçların etkinliği arttırılabilir, hedef olmayan bölgelerdeki toksisite azaltılabilir ve hastalara kullanım sırasında kolaylık sağlanabilir. Jelatin, kitosan gibi polimerler kontrollü salım sistemlerinde kullanılan polimerlerdendir ve bu polimerlerle hazırlanan sistemlerden glutaraldehit gibi çeşitli çapraz bağlayıcı ajanlar kullanılarak farklı salım profilleri elde edilebilmektedir. Biyobozunur polimer mikrokapsüller kontrollü ilaç salım sistemlerinde sağladığı birçok avantaj sebebiyle tercih sebebidir. Küçük moleküller, proteinler ve nükleik asitler gibi biyoaktif ajanların spesifik bir bölgeye kontrollü salımı bu ilaçların mikroküreler içerisine enkapsülasyonu ile sağlanabilir. Biyoaktif moleküllerin ömrü ve salımı mikroküreler kullanılarak arttırılabilinir. Farklı mikroenkapsülasyon sistemleri ve kopolimerler kullanılarak veya polimer özellikleri değiştirilerek, mikroküreler istenilen salım profilini elde etmek için optimize edilebilir. Kitosan mikroküreler de tercih edilen ilaç taşıma sistemlerinden biridir. Kitosan mikroküreleri oluşturmak için çeşitli metotlar vardır ve seçilen yöntem, biyoaktif molekülün yapısına, istenilen küre boyutuna, salım profiline ve son ürünün stabilitesine bağlı olarak seçilmelidir. Bu çalışmanın amacı akut yaralar için; hastanın acısını dindiren, enfeksiyon kaynaklı pH değişikliklerinden etkilenmeden ağrı kesici (ibuprofen) salımı yapan sistemin geliştirilmesi ve işlevsel, biyobozunur bir yara örtüsünün oluşturulmasıdır. Enfeksiyon varlığında derinin pH değeri asidikten (normal, pH=5) bazik değerlere (enfekte yara, pH=8) kadar değiştiğinden ağrı kesici ilacın salımının yara pH’sından etkilenmeyecek ya da çok etkilenmeyecek şekilde tasarlanması gerekmektedir. Sistemin kurulması için yara iyileşmesi uygulamalarında üstün özellikleri yüzünden iyi bilinen kitosan seçilmiştir. Çalışmada ilk olarak, tek katmanlı süngerlerin yapımı optimize edilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda oluşturulan tek katlı kitosan süngerlerin (%1, %2 ve %3 (w/v)) yapıları taramalı elektron mikroskobunda incelenmiş ve kitosan konsantrasyonu arttıkça daha yoğun bir yapı oluştuğu gözlemlenmiştir. Ayrıca bu süngerlerin sulu ortamdaki davranışlarına bakılmıştır. Su alma kapasitesi testinin sonucunda, %1’lik kitosan süngerin hızlıca dağıldığı görülmüş, bu yüzden çalışmanın diğer aşamalarına daha dayanıklı olan ve benzer davranış gösteren %2 ve %3 kitosanla devam edilmiştir. İki katmanlı kitosan sünger yapımında, alt katmanın deriyle doğrudan temas halinde olup aseptik ortam sağlaması istenirken, üst katmanın derinin çevreyle temasını engellemesi ve yarayı çevresel etkilerden koruması istenmektedir. Alt katmanı oluşturmak için %2 veya %3 kitosan kullanılırken, üst katmanda daha yoğun %4 kitosan kullanılmıştır. Taramalı elektron mikroskobunda yapılan incelemeler sonucunda, hem %2-%4 hem de %3-%4 iki katmanlı kitosan süngerlerin alt katmanı gözenekliyken, üst katmanın katmanlı bir yapıya sahip olduğu gözlemlenmiştir. Su alma kapasitesi testlerine göre %2-%4 iki katmanlı süngerin %3-%4’e göre daha stabil bir davranış sergilediği ve bozunma hızının daha az olduğu görülmüştür. Çalışmanın diğer aşamalarına %2-%4 iki katmanlı kitosan süngerle devam edilmiştir. Kitosan süngerlerin hızla çözünmemesi/bozunmaması için farklı oranlarda çapraz bağlanması gerektiği görülmüş ve çözünme/bozunma davranışlarına göre %0,5 gluteraldehit ile çapraz bağlanan %2-%4 iki katmanlı kitosan süngerler seçilmiştir. Ayrıca, lizozim çözeltisi içerisinde bekletilen %0,5 glutaraldehit ile çapraz bağlanmış %2-%4 kitosan süngerlerde 1 ayın sonunda herhangi bir ağırlık kaybı gözlemlenmemiştir ve bu süngerlerin ibuprofen içeren kitosan mikroküreleri taşıyacak ana yapı olmasının uygun olacağına karar verilmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise, ibuprofenin kontrollü salımı için mikroküre optimizasyonu yapılmıştır. İlk olarak ibuprofen içeren jelatin mikrokürelerden farklı çapraz bağlama oranlarında (%5 ve %7,5) pH 4,5 ve pH 8,0’da ilaç salımı gerçekleştirilmiştir. Salım çalışmaları sonucu, her iki tip küre için de ilk 3 saatte ani salım gerçekleşmiş ve daha sonra salımın yavaşladığı görülmüştür. Daha düşük gluteraldehit içeren (%5) mikrokürelerden daha yüksek miktarda ani salım gerçekleşmiştir fakat salım profili pH değerinden etkilenmemiş gözükmektedir. Glutaraldehit oranı arttırıldığında (%7,5) ise ilacın salım miktarının pH 4,5 ve pH 8,0 için farklı olduğu gözlemlenmiştir. Düşük çapraz bağlama çok hızlı bir salıma, daha yüksek çapraz bağlama ise pH’dan etkilenen bir salım profiline sebep olmaktadır. Bu iki davranış da istenilen sistem için uygun olmadığından daha iyi bir salım profili elde edebilmek için sadece kitosandan oluşan kürelerin yapımı denenmiştir. Kitosan ile hazırlanan mikrokürelerden ibuprofen salımında pH 4,5 ve pH 8,0 için benzer ve uzun süreli salım profili elde edilmiştir. Bu yüzden çalışmanın diğer aşamalarına bu mikrokürelerle devam edilmiştir. Çalışmanın en son aşamasında, ibuprofen içeren kitosan mikroküreler %0,5 glutaraldehit ile çapraz bağlanmış %2-%4 iki katmanlı kitosan süngerlere yerleştirililerek tüm sistemin entegrasyonu tamamlanmıştır.
-
ÖgeAğır Metallerin Yaratmış Olduğu Stres Koşullarının Çeşitli Aktif Çamur Bakterilerinin Metabolizmalarına Olan Etkileri(Fen Bilimleri Enstitüsü, ) Çelikyılmaz, Gamze ; Tamerler Behar, Candan ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışmada, bakır, kobalt ve nikel metallerinin aktif çamur sistemlerinde sıkça rastlanan Paracoccus pantotrophus, Microlunatus phosphovorus, ve Escherichia coli bakteri suşları üzerindeki etkileri incelenmistir. Büyüme profilleri boyunca her metalin, her suş uzerindeki minimum inhibisyon konsantrasyonları bulunmuştur. Bu konsantrasyonlar, hem katı, hem de sıvı ortamda kimyasal olarak tanımlı bir besiyeri olan M9’da belirlenmiştir. Katı ortamdaki deneyler Petri kutularında, sıvı ortamlardaki deneyler de erlen, biyoreaktör ve respirometrede gerçekleşmiştir. Yapılan deneylerde üç metalin de bakterilerin büyüme verimleri, maksimum büyüme hızları ve substrat tüketim seviyeleri üzerindeki etkileri belirlenmiş ve karsilastirilmiştir. Bunun için spektrofotometrik yöntemlerin yanında artık substratın belirlenmesi için yüksek basınçlı likit kromatografisi de kullanılmıştır. Respirometrik deneyler, Escherichia coli kültürü üzerinde yapılmıştır. Bu deneylerin sonucunda, biyoreaktör deneylerinde elde edilen sonuçların yanında OUR profilleri de elde edilmiştir. Respirometre denyleri sonucunda KS, μmax, ve Yh gibi parametreler de elde edilmiştir. Elde edilen büyüme verimi, maksimum büyüme hızı gibi sonuçlar biyoreaktör deney sonuçları ile karşılaştırılmıştır.
-
ÖgeAilesel Akdeniz Ateşi Hastalarında Histon Modifikasyonlarının Kromatin İmmünopresipitasyon Dizileme Kullanarak Analizi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-06-26) Fidan, Begüm ; Turanlı, Eda Tahir ; 10077717 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAilesel Akdeniz Ateşi (AAA) büyük çoğunlukla Türk, Ermeni, Yahudi ve Arap gibi Akdeniz kökenli toplumlarda görülen otoinflamatuar bir hastalıktır. Türkiye’de yaygınlığı 1:1000 ve yaygınlık frekansı 1:5’dir. AAA periton, plevra ya da sinovyum seröz membranlarından birinde oluşan inflamasyonun neden olduğu iltihap sonucu ortaya çıkan yüksek ateşle (38,5-40˚C) birlikte ciddi karın, göğüs ve eklem ağrılarının eşlik ettiği ani ve düzensiz ataklarla birlikte seyreder. Ataklar genellikle 1-3 gün boyunca sürer. Hastaların 70%’inde hastalık belirtileri ilk 10 yılda ortaya çıkar ve 90%’nında ise ilk 20 yılda hastalık başlangıç gösterir. Atak bölgeleri ve şiddeti bir hasta için farklılık gösterebileceği gibi her hasta için de farklı olabilmektedir. Klinik tanıda yüksek ateş, karın ağrısı, göğüs ağrısı ve hastanın Kolşisin ilacına verdiği cevap dikkate alınır. 1972 yılından beri hastalığın tedavisinde kolşisin ilacı kullanılır. Tedavi düzenli ve uzun süreli olmalıdır. Hastaların 90%’nında yeterli dozda ve düzenli olarak kullanıldığında atakların tamamen düzeldiği, 30%’unda ise atakların şiddeti ve sıklığının azaldığı, 5%’inde ise bu ilaca yanıt vermediği gözlenmiştir. Kolşisin tedavisine cevap vermeyen hastalarda amiloidoz birikimi riski çok yüksektir. Amiloidoz, başta böbrek olmak üzere diğer organlarda fonksiyon bozukluğu veya yetersizliğe yol açan suda erimeyen bir proteinin gelişimiyle ortaya çıkan bir hastalıktır. Klinik tanıda idrar testlerinin yapılması amiloidoz varlığının tespitinde önemli yer tutar. Hastalığa kesin tanı koyacak bir laboratuar testi yoktur. Atak döneminde bazı laboratuar bulguları anormal olarak tespit edilebilir ancak hiç biri tanı koymaya yeterli değildir. AAA’nde görülen klinik bulgular pek çok hastalıkta da görülebildiği için hastalığın tanısı çoğu zaman gecikebilmektedir. Aile geçmişinde AAA hastalığı olan, klinik bulguları ve etnik yapısı uygun olan kişilerde tanının kesinleşmesi için genetik test yapılabilir. Ancak unutulmamalıdır ki genetik testi pozitif olanların hepsi AAA olmadığı gibi, negatif olanlar da AAA olabilir. AAA otozomal resesif (çekinik) geçiş gösteren kalıtsal bir hastalıktır. Yani hastalığın ortaya çıkması için anne ve/veya babanın bu hastalık genlerini taşıması gerekir. Stres, enfeksiyon, aşırı fiziksel egzersiz, yorgunluk, travma gibi tetikleyici çevresel etkenlerin dışında MEFV geninde meydana gelen mutasyonlar AAA’ne yol açar. MEFV geni 1992’de haritalanmış ve 1997’de ise klonlanmıştır. MEFV 16. kromozomun kısa kolu üzerinde (16p13.3 noktasında) yerleşim gösterir ve 10 ekzondan oluşur. MEFV geni 781 amino asitten oluşur ve pyrin/marenostrin adı verilen bir proteini kodlamaktadır. Bu proteinin fonksiyonu tam olarak bilinmemekle birlikte inflamasyon kontrolünde rol oynadığı ve özellikle nötrofillerde ifade olduğu ileri sürülmektedir. Şimdiye kadar MEFV geni üzerinde büyük çoğunluğunu yanlış anlamlı (missense) mutasyonların oluşturduğu amino asit dizisinde değişikliğe yol açan ve proteinin yapısını ve fonksiyonunu bozan 200’den fazla mutasyon/varyasyon tespit edilmiştir. Bu mutasyonlardan en sık görülen 5 tanesi M694V, M694I, M680I, E148Q, V726A’dır ve ekzon 2 ve ekzon 10 üzerinde meydana gelirler. MEFV mutasyonların çoğu 10. ekzon üzerinde birikmiştir ve pyrin proteinin PRYSPRY alanı tarafından kodlanmaktadırlar. Bunun dışında çoğu nadir görülen mutasyonlar 2. ve 5. ekzonlarda yoğunlaşmışlardır ve pyrin proteini’nin bu mutasyonlar üzerine etkisi henüz bilinmemektedir. MEFV geni 3700 baz çiftlik (bç) bir mRNA kodlamaktadır. Bu gen genellikle nötrofiller, eozinofiller, sitokin aktive monositler, dendritik hücreler ve sinovyal fibroblastlarda ifade edilir fakat lenfositlerde ifade edilmez. FMF hastalarının atak döneminde polimorfik nükleer hücrelerde anormal trafik ve ataksız döneminde MEFV mRNA ifadesinin periferik kandaki löksitlerde azaldığı tespit edilmiştir. MEFV mRNA çoğunlukla 2., 3., 4. ve 8. ekzonu içeren alternatif birleşmeye maruz kalmaktadır. En az 16 tane farklı mRNA formu tespit edilmiştir: tam boy, MEFV-d2 (2 Δ), ekzon 2a (2a), ekzon 4a (4a), ekzon 8ext (8ext), Δ2/4a, 2a/4a, Δ2/8ext, 2a/8ext, del234, del2345, del34, del7, del78, 9ext and 2Δ /9ext. MEFV geninin tam boy kopyası olan pyrin proteini sitoplazmik bölgede yerleşim gösterirken, 2. ekzonu içermeyen alternatif kopyasının ise nükleusta yerleşim gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca bu formun AAA hastalarında sağlıklı gruba oranla daha çok kodlandığını daha önceki çalışmalarımızda gösterilmiştir. MEFV genindeki genetik değişikliklerin yanı sıra pek çok epigenetik olay AAA hastalığının ortaya çıkmasında rol oynamaktadır. Epigenetik, DNA dizisi üzerinde bir değişiklikle meydana gelmeden ancak gen ifadesinde değişikliğe yol açan yani kalıtsal olan fenotipik değişiklikleri inceler. 3 temel epigenetik mekanızma; DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve RNA alternatif kırpılmalarıdır. Epigenetik mekanizmalar gen ifadesini dolaylı veya doğrudan etkilemesine bağlı olarak ikiye ayrılır. Post-translasyonel yani DNA’nın mRNA’yı kodladıktan sonra meydana gelen değişiklikler gen ifadesini dolaylı olarak etkilerler. DNA ve kromatin boyutundaki modifikasyonlar ise doğrudan gen ifadesini etkilerler. DNA düzeyindeki en bilinen modifikasyon DNA metilasyonudur ve DNA-protein etkilşimini yöneterek gen ekspresyonunu kontrol eder. DNA metilasyonu genellikle sitozin ve guanin bazlarından zengin olan ve CpG adacığı olarak adlandırılan bölgede, sitozin bazının 5. karbonu üzerine metil grubunun bağlanması ile meydana gelir. DNA metillenmesinde S-adenozil metiyonin (SAM) metil donörü olarak işlev görür ve DNA metiltransferaz enzimi reaksiyonu katalizler. Metillenen DNA sıkı bir yapılanma gösterirken (heterokromatin), metillenmemiş bölgeler daha serbest bir şekilde (ökromatin) paketlenirler. Laboratuar grubumuz daha önceki çalışmalarda MEFV geninin 2. ekzonu üzerindeki DNA metilasyonun AAA hastalarında sağlıklılara oranla daha yüksek olduğunu tayin etmiş (p=0.049) ve böylece DNA metilasyonu ile AAA ile ilişkisini göstermişlerdir. Kromatin boyutundaki modifikasyonlar kovalent ve nonkovalent olmak üzere ikiye ayrılırlar. Kovalent modifikasyonlar histon modifikasyonlarıdır. DNA, histon proteinler, diğer proteinler ve RNA ile birlikte paketlenerek kromatin ipliğini oluşturur. Yaklaşık 147 baz uzunluğundaki negatif yüklü DNA pozitif yüklü histon proteinlerine bağlanmak ve etrafında 2 defa dönmek suretiyle histon oktomerine (H2A, H2B, H3 ve H4 proteinlerinin ikişer kopyasından oluşur) bağlanır ve kromatinin temel yapısı olan nükleozomu oluşturur. DNA histon proteinlerine bağlanarak açık (ökromatin) veya kapalı (heterokromatin) bölgeleri oluşturur. Post-translasyonel histon modifikasyonları gen ifadesini etkileyen önemli epigenetik bir mekanizmadır. Histon kuyruklarının amino uçları lizin rezidülerinin asetilasyonu, metilasyonu, fosforilasyonu, übikitinasyon, sümoylasyonu, arjinin rezidüleri metilasyonu, serin ve treonin rezidülerinin fosforilasyonu gibi çok sayıda modifikasyona maruz kalır. Tersinir post-translasyonel histon modifikasyonları histon-histon ve histon-DNA etkileşimini dolayısıyla kromatin yapısını ve o geni açık veya kapalı duruma getirerek gen ekspresyonunun gerçekleşip gerçekleşmeyeceğini belirlerler. Histon kuyruğuna asetil grubunun bağlanmasıyla DNA serbest yapıya ulaşır ve gen ifadesi gerçekleşir. Asetil grubunun bağlanmasından histon asetil transferaz (HAT), ayrılmasında ise histon deasetil transferaz (HDAT) enzimi sorumludur. Diğer bir post-translasyonel modifikasyon olan histon metilasyonu yerleşimine bağlı olarak aktif veya pasif kromatinin belirleyicisi olabilir. Histon metilasyonu, histon proteinlerinde bulunan amino asitlere (lizin, arjinin, serin, treonin) histon metil transferaz (HMT) enzimleri tarafından 1, 2 veya 3 metil grubunun eklenmesiyle meydana gelir. Histon lizin metilasyonu aktif transkripsiyon ile ilişkili olabileceği gibi (örneğin Histone H3 lizin 4 (H3K4), Histone H3 lizin 36 (H3K36)), pasif transkripsiyon ile de (örneğin Histone H3 lizin 9 (H3K9), Histone H3 lizin 27 (H3K27)) ilişkili olabilir. H3K9me3 histon modifikasyonu genellikle gen susturulmasında rol oynar ve heterokromatin bölge ile ilişkilidir. H3K4me3 modifikasyonu ise aktif gen bölgelerini temsil eder ve ökromatin ile ilişkilidir. Tüm genom boyu yapılan çalışmalar H3K4me3 modifikasyonunun genellikle CpG adacığının yer aldığı promoter ve transkripsiyon başlangıç bölgesinde bulunduğunu ifade etmektedir. İki önemli epigenetik mekanizmanın, DNA metilasyonu ve kromatin modifikasyonu, birbirlerinden tamamen bağımsız olmadığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Bu çalışmanın odak noktası AAA hastalarında H3K9me3 ve H3K4me3 modifikasyonlarının tüm genom boyunca dağılımlarının yanı sıra MEFV geni üzerindeki DNA metilasyonu ve inflamasyon ile ilişkilerini analiz etmektir. 10 AAA hastasının atak ve ataksız dönemlerinde (4 kadın, 6 erkek) ve 10 sağlıklı (5 kadın, 5 erkek) bireylerinden elde edilen periferik tek nükleuslu hücreler ile hedef proteine spresifik antikorlar kullanılarak kromatin immünopresipitasyon (ChIP) analizini takiben polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile ChIP doğrulandı ve yeni nesil dizileme ile birleştirildi. Metillenmiş H3K9(me3) ve H3K4(me3)’ün genom boyunca dağılımları dizileme sonuçları kullanılarak biyoinformatik analiz ile değerlendirildi. Öncelikle tüm bireylerden MEFV ekspresyonun var olduğu periferik kan tek nükleuslu hücreler yoğunluk farkı methodu ile izole edilmiştir. Formaldehit ile proteinler DNA’ya bağlanmış ve glisin solüsyonu ile bağlanma işlemi sonlandırılmıştır. PBS çözeltisi ile yıkanan hücreler formaldehitten uzaklaştırıldıktan sonra liziz buffer ile hücreler patlatılmış ve içeriği ortaya çıkartılmıştır. Sonikasyon ile proteinlere zarar vermeden kromatinler ortalamaları 500 baz olmak üzere 200 -700 baz aralığında küçük parçalara ayrılmıştır. İmmünopresipitasyon aşamasında hedef modifikasyonlara spesifik antikorlar öncelikle manyetik boncuklara bağlanmış ve daha sonra elde edilen kompleks hücre lizatı ile inkübe edilerek immün kompleks oluşturulmuştur. Hücre lizatının bir kısmı input olarak daha sonraki aşamalarda kullanılmak üzere saklanmıştır. Seri yıkamaların ardından immün kompleks ve input kontrol yüksek sıcaklığa maruz bırakılarak protein/DNA çapraz bağları tersine çevrilmiş ve protein, RNA gibi içerikler uzaklaştırıldıktan sonra saf DNA izole edilmiştir. Elde edilen DNA modifikasyonlara spesifik antikorların bağlandığı bölgeleri temsil etmektedir ve analizleri için kromatin immünopresipitasyon yeni nesil dizileme ile birleştirilmiştir. Dizileme sonucu elde edilen 50 bazlık kısa okumalar referans genoma (hg19) haritalanmış ve okumaların yarısından fazlasının genomun tek bir bölgesi ile spesifik olarak eşleştiği tespit edilmiştir. Okumaların yoğunlaştığı bölgeler pikler ile hizalanmış ve bu aşamada kontrol olarak input kullanılmıştır (Mfold=32). Bu piklerin temsil ettiği genler tespit edilmiş ve yerleşimleri görüntülenmiştir. Biyoinformatik analiz, tüm çalışma gruplarında inaktif transkripsiyonu temsil eden H3K9me3 modifikasyonunun genom boyunca dağılımının aktif transkripsiyonu temsil eden H3K4me3 modifikasyonundan yaklaşık 10 kat daha az olduğunu yansıtmaktadır. H3K4me3 modifikasyonlarının coğunlukla genin düzenleyici bölgelerinde ve H3K9me3 modifikasyonlarının ise intragenik bölgelerde yerleştikleri tespit edilmiştir. Ayrıca, her iki modifikasyona ait okumaların tüm çalışma grubuna ait örneklerde MEFV geni ile eşleştiği tespit edilirken H3K4me3 modifikasyonuna ait okumaların atak dönemdeki AAA hastalarında MEFV genin promoter, 1. ekzon ve 1. intron’un bir kısmını kapsayan bölgesinde ataksız dönemdeki AAA hastaları ve sağlıklı kontrollere göre çok daha fazla yoğunlaştığı tespit edilmiştir. Bunun yanında H3K4me3 modifikasyonunun otoinflamasyonda rol oynayan ve pyrin proteini ile ilişkili bazı genlerin çoğunlukla promoter bölgelerinde ataklı AAA hastalarında, sağlıklı ve ataksız AAA hastalarından daha fazla bulunduğu tespit edilmiştir. Biyoinformatik analiz sonucu PZR kullanılarak MEFV geninde tespit edilen pik bölgesini çoğaltan 2 ayrı PZR ve GAPDH pozitif kontrol primerleri kullanılarak doğrulanmıştır. Bu sonuç H3K4me3 modifikasyonunun AAA hastalarında DNA metilasyonu ve inflamasyon ile ilişkisi olabileceğini düşündürmektedir. Gelecekte yapılacak çalışmalarda istatistiksel analiz ve ChIP doğrulaması için daha kontrol ve hasta gruplarına ait fazla sayıda örnek kullanılmalıdır. ChIP-Seq sonucu belirlenen aday gen bölgeleri qPCR ile doğrulanmalıdır. Yeni nesil dizilemeden daha fazla okuma sayısı elde edebilmek için, dizileme tekrarlanmalı ve böylece histon modifikasyonlarının tüm genom boyunca dağılımları daha derinlemesine incelenmiş olacaktır. ChIP, ilişkili olabilecek diğer histon modifikasyonlarına spesifik antikorlar ile tekrarlanmalı ve DNA metilasyonu, alternatif kırpılmış formların analiz çalışmaları ile birleştirilmelidir. Böylece AAA hastalığının patolojisinin ve epigenetik mekanizması daha derinlemesine anlaşılabilmesine yardımcı olacaktır.
-
ÖgeAilesel Akdeniz Ateşi Hastalığında Mefv Gen Ekspresyonu Ve Metilasyon Analizleri(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2010-02-11) Kireçtepe, Kıymet Aslı ; Turanlı, Eda Tahir ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMEFV, Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA) hastalığı ile ilişkilendirilmiş ilk otoinflammatuar gendir. AAA çoğunlukla Türkler, aşkenaz olmayan yahudiler, Ermeniler ve Araplar gibi akdeniz kökenli toplumlarında görülmektedir. En sık görülen mutasyonlar, M694V, M680I, M694I, V726A ve E148Q hastalıkla ilişkili allellerin yaklaşık %70’ini oluşturmaktadır. Bu mutasyonların içinden MEFV geninin ikinci ekzonunda bulunan E148Q mutasyonunun hastalığın daha hafif bir şekilde geçirilmesiyle ilişkili olduğu görülmüştür. E148Q mutasyonu dışındaki mutasyonları taşıyanlarda MEFV gen ifade seviyesinin daha az olmasına karşın E148Q mutasyonu taşıyanlarda MEFV gen ifadesinin arttığı gösterilmiştir. MEFV geni için yapılan bioinformatik analizler sonucunda, genin ikinci ekzonunu ve birinci intronun bir kısmını içeren 998 bç uzunluğundaki bölgeye yayılmış olan bir CpG adacığı tespit edilmiştir. E148Q mutasyonu bu CpG adacığı içerisinde bir bölgede gerçekleşmektedir. DNA metilasyonu gen ifadesini etkileyen önemli epigenetik mekanizmalardan birisidir. Düşmüş olan MEFV gen ifadesi miktarının akut inflammasyonla ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle biz MEFV geninin ikinci ekzonunda ki metilasyonun gen ifadesini düzenleyip düzenlemediğini ve hastalığın gelişiminde etkin olup olmadığını bilmek istiyoruz. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları anabilim dalına başvuran 51 FMF hastası ve 11 sağlıklı kontrolde çalışma yapıldı. Probe kullanılarak yapılan tam zamanlı polimeraz zincir reaksiyonunu (qRT-PCR) temel alan bir metod olan “MethyLight” yöntemi ile genomik DNA kalıp olarak kullanılarak, ikinci ekzondaki metilasyon miktarı belirlenmiştir. Kandan elde edilen RNA’dan, MEFV gen ifade seviyesi tam zamanlı PZR yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca ikinci ekzon varyantlarını içeren MEFV cDNA raportör gen konstarktı HeLa hücrelerine transfekte edildi ve in vitro olarak ekspresyon seviyesi belirlendi. Bu çalışmada 51 FMF hastasından 33 tanesinin (%59.4 mutant allel), 11 sağlıklı kontrolden 4 tanesinin (%22.4 mutant allel) mutant alleli taşıdığı gösterildi. Bu sonuçlar beklenildiği gibi iki grup arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir (p= 0.0016, Odds Ratio: 2.7689). Sonuçlar mutasyon taşıyan AAA hastalarında, sağlıklılara oranla yaklaşık iki kat azalmış MEFV ekspresyon miktarını göstermektedir (p=0.031). FMF hastaları ve sağlıklı kontrollerde metilasyon durumuna bakıldığında, iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamasına karşın, FMF hastalarında metilasyonun sağlılıklara göre biraz daha yüksek olduğu gözlendi. Buna karşın in vitro çalışmalarda, ikinci ekzonu içermeyen MEFV cDNA ile transfekte edilmiş hücrelerde, ikinci ekzonu içeren hücrelere oranla, ekspresyonun anlamlı olarak arttığı gösterildi (p=0.0013). Bu sonuçlar MEFV geninin 2. ekzonundaki metilasyonun, gen ifade seviyesi üzerindeki önemini göstermektedir.
-
ÖgeAilesel Akdeniz Ateşi, Gut Ve Erişkin Still Hastalarında Mefv Mutasyon Analizi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-06-29) Gerone, Simha Gila Benyakar ; Turanlı, Eda Tahir ; 10078155 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsOtoenflamatuvar terimi ilk olarak 1999 yılında kalıtsal periyodik ateş sendromları çalışan araştırmacı grup tarafından ortaya atılmış ve geliştirilmiştir. Sendromların asıl nedeninin doğal bağışıklık sisteminde görevli genlerde meydana gelen mutasyon/varyasyonlar ve değişen sinyal ve sitokin aktivasyon yolakları olduğu öne sürülmektedir. Ailevi Akdeniz ateşi (AAA, OMIM ID: 249100 ve 134610) otozomal resesif olarak kalıtılan, tekrarlayan ateş atakları, karın ve eklem ağrıları ile kendini gösteren, hastalığın daha ileri seyrinde amiloidoz görülebilen yaygın ve en iyi karakterize edilmiş otoenflamatuvar bir hastalıktır. Gut, ürik asit kristallerinin dokularda ve sıvılarda birikmesi ile oluşan, genellikle 40 yaşı aşmış erkek bireylerde görülen ve metabolik, kardiyovasküler ve böbrek yetmezliği ile sonuçlanabilen, eklem bölgelerinde ödem, kızarıklık ve şiddetli ağrı ile kendini gösteren enflamatuvar bir hastalıktır. Erişkin Still hastalığı (ESH) ise nadir enflamatuvar hastalık olup etiyolojisi bilinmemektedir. MEFV, MEditerranean FeVer geni, tanımlanan ilk otoenflamatuvar gen olup, AAA ile ilişkilendirilmiştir. Günümüzde MEFV geninde tanımlanmış olan 305 sekans varyansları mevcuttur. Yeni mutasyon/varyasyonlar ve AAA ile ilişkileri halen çalışılmaktadır. MEFV geni MEFV geni 10 ekzondan oluşmakta olup, mutasyon/varyasyonlar genin 1, 2, 3, 5, 9 ve 10. ekzon bölgelerinde bulunmaktadır. Mutasyon/varyasyonların çoğu yanlış anlamlı olup, 2. ve 10. Ekzon bölgeleri çevresinde yer almaktadır. En sık görülen mutasyon/varyasyonlar, 10. ekzonda yer alan V726A, M694V, M694I, M680I ve 2. Ekzonda yer alan E148Q, hastalıkla ilişkili allellerin yaklaşık %70’ini oluşturmaktadır. MEFV geninin ürünü olan Pyrin/Marenostrin (P/M) proteini, 781 aminoasitten oluşmakta ve başlıca granülosit, monosit, dendritik hücre ve eklem sıvısında bulunan fibroblast hücrelerinde anlatımı yapılmaktadır. Proteinin her alt birimi farklı proteinlerle etkileşime girerek hücre ölümü, sitokin salınımı, transkripsiyonun düzenlenmesi gibi farklı fonksiyonlar göstermekte, ancak asıl görevi enflamasyonun regülasyonu olduğu açıklanmaktadır. MEFV genindeki mutasyon/varyasyonların hastalıkla ilişkili olduğu ve klinik tabloyu etkilediği gösterilmektedir. AAA hastası olmasına rağmen, MEFV mutasyon/varyasyonları taşımayan bireylerin olması, hastalığın genetiğinin daha kompleks olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca P/M rolü tam olarak açıklanmamıştır. Bu çalışmada MEFV geninin AAA’ya ve ya genel enflamatuvar yolağına spesifikliğinin diğer otoenflamatuvar hastalıklarla karşılaştırılarak araştırılması amaçlanmıştır. MEFV geninin ikinci ve onuncu ekzon bölgelerindeki mutasyon/varyasyon frekansları AAA (N=75), Gut (N=30) ve ESH (N=28) hastalarında ve sağlıklı kontrol grubunda (N=54) karşılaştırılmıştır. Çalışmanın ikinci kısmında ise, P/M protein seviyeleri AAA (N=22) ve sağlıklı kontrollerde (N=9) araştırılmıştır. DNA ve protein örnekleri tüm kandan elde edilmiştir. İlk olarak tüm mutasyon/varyasyon frekansları gruplar arası karşılaştırılmıştır. MEFV gen mutasyon/varyasyonları AAA grubunda 73 (97.3%), ESH grubunda 21 (75%), Gut grubunda 20 (66.6%) ve sağlıklı kontrollerde 35 (64.8%) kişide bulunmuştur. AAA grubu alellerinin %16.2’si, Gut grubunun %6.8’i, ESH grubunun %5.4’ü ve sağlıklı kontrollerin %7’si mutasyon/varyasyon taşıyan alelleri kapsamaktadır. Hasta grupları ile sağlıklı kontrol grubu arasındaki MEFV mutasyon/varyasyon frekans farkı istatistiksel olarak anlamlıdır (p=
-
ÖgeAilesel Behçet Sendromu Ailelerinde Hla-b5 Geninin Genetik Ve Epigenetik Analizleri(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-06-26) Köprülü, Pelinsu ; Turanlı, Eda Tahir ; 10077636 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBehçet Sendromu, vücuttaki birçok doku ve sistemin iltihaplı tutulumuyla öne çıkan, kronik romatolojik bir hastalıktır. Başlıca belirtileri ağızda ve cinsel organda sıklıkla tekrar eden yaralar, vücutta sivilceler ve kızarıklıklardır. Bununla beraber, eklemlerde, dolaşım sisteminde, merkezi sinir sisteminde, gözün görme tabakasında, sindirim sistemininde ve akciğer, böbrek gibi organlarda iltihaplanma görülmektedir. Hastalık genellikle daha ağır bir seyirle 20’li ve 30’lu yaşlarda başlar. Behçet Sendromu’na, İpek Yolu olarak tanımlanan, Akdeniz ve Orta Doğu popülasyonlarının da üzerinde bulunduğu güzergahta sık rastlanmaktadır. Türkiye’de ise hastalığın sıklığının, 100.000’ de 20 ile 420 arasında değiştiği gösterilmiştir. Hastalık etkenleri, ailesel birikim ve Behçet Sendromlu ailelerde artan HLA-B51 sıklığı gibi indikasyonlar ile birlikte enfeksiyonel ajanlar, çevresel faktörler ve henüz tanımlanmamış immünolojik mekanizmalar olarak öne sürülmüştür. Bunların içinde HLA-B geninin bir alt aleli olan HLA-B51 aleli, bugüne kadar Behçet Sendromu ile ilişkilendirilmiş en önemli işaretlerden biridir. HLA-B geni 6. Kromozomun p(kısa) kolunda 21.3 ile tanımlanan bölgesinde bulunmaktadır.HLA-B, insan lökosit antijeni (HLA) denilen kompleks grubun başlıca genlerindendir. Görevi bağışıklık siteminde T hücrelerine antijen tanıtımını sağlamaktır. HLA-B geninin birden çok aleli bulunmaktadır. Bu alellerden Behçet Sendromu ile bağlantısı bilinen aleller HLA-B51, HLA-B15, HLA-B27 ve HLA-B57 olarak gösterilmiştir. Fakat bunların içinden HLA-B51 aleli günümüze kadar yapılan çalışmalarda, hastalık ile en çok bağlantılı bulunan alel olmuştur. HLA-B51 alelinin 89 dan fazla alt tip aleli bulunmaktadır. Günümüzde, HLA-B 51 alelinin HLA-B5101 ve HLA-B5108 gibi bazı alt alellerinin Behçet Sendromlu hastalarla bağlantısı olduğu gözlemlenmiştir. Genom genelinde yapılan bağlantı çalışmalarında, IL-10, IL-23R, IL-12A, MICA, STAT4 gibi farklı genlerinde Behçet Senromu ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Tüm bu bulgulara rağmen, HLA-B51 alelini taşıyan sağlıklı bireylerin varlığı, aynı şekilde HLA-B51 alelini taşımayan Behçet hastalarının varlığı, hastalığın oluşumunda başka mekanizmaların olabileceğini düşündürmüştür. DNA metilasyonu ve kromatin modifikasyonları gibi DNA dizisinde herhangi bir değişime sebep olmadan gen aktivitesini değiştiren epigenetik modifikasyonlar, tanımlanamayan kompleks hastalıkların nedenlerinin aydınlatılmasında önemli rol kazanmaktadır. Epigenetik modifikasyonlar içinde ise DNA metilasyonu en sık çalışılan regülasyon mekanizmalarından biridir. HLA-B geninde, 1346 nükleotit uzunluğundaki CpG adacığının varlığı ve bu bölgede CG dinükleotitlerinin %66.6 oranında yoğun olarak kümelendiği gözlemlenmiştir. CpG adacığında bulunan sitozin ve guanin bazlarının metillenmesi ile gen aktivitesinin dolayısıyla ekspresyonun değişmesi beklenmektedir. Yaptığımız öncül araştırmalarda, 4 monozigotik ve 4 dizigotik Behçet Sendrom’lu ikizlerin oluşturduğu çalışmamızda HLA-B geninin 1. ve 2. ekzonlarının epigenetik regülasyonunu düşündüren bulgulara rastladık. Bu çalışmada ise ailesel Behçet Sendromu vakaları ile birlikte ailelerinde bulunan diğer Behçet Sendrom’lu bireyler ve sağlıklı aile bireyleri de incelenmek istenmiştir. Bu sayede, HLA-B51 alelinin genetik ve epigenetik etkilerinin daha iyi anlaşılması planlanmıştır. 2013-2015 yılları arasında Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Romatoloji Polikliniği’ne tedavi olmaya gelen hastalar içerisinden irtibat kurulan yaklaşık 100 Behçet Sendrom’lu bireyden, ailesinde en az bir BS tanısı konulmuş akrabası bulunan 50 Behçet Sendrom’lu bireye ulaşılmıştır. İletişime geçilen 50 Behçet Sendrom’lu aileden 15 aile çalışmamıza katılmayı kabul etmiştir. Araştırma grubumuz toplamda 15 Behçet Sendrom’lu birey, ailelerindeki Behçet Sendrom’lu 17 akraba ve yine ailelerindeki 26 sağlıklı akrabalardan oluşmaktadır. Hastalardan ve ailelerinden alınan periferal kan örneklerindeki lökositlerden genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Çalışma grubunda bulunan tüm bireyler, bölge spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu yöntemiyle HLA-B51 aleli için genotiplenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda, HLA-B51 pozitifliği, indeks hasta grubu için 12/15, hasta akrabalar için 13/17 ve sağlıklı akrabalar için 22/26 olarak hesaplanmıştır. 25 kişiden oluşan aile dışı sağlıklı kontrollerde ise HLA-B51 pozitifliği 8/25 oranında bulunmuştur. HLA-B51 genotiplendirmesi sonrasında, HLA-B geninin 1.ekzon, 1.intron ve 2.ekzon bölgelerinin metilasyon seviyeleri Real-time PCR temelli OneStep qMethyl kiti kullanılarak analiz edilmiştir. HLA-B genine ait ekzon-1, intron-1 ve ekzon-2 bölgelerini içeren metilasyon analizlerinde, indeks hasta grubu ve ailelerindeki diğer Behçet Sendrom’lu ve sağlıklı bireyler arasında yapılan karşılaştırmada, tüm Behçet Sendrom’lu bireylerdeki metilasyon oranlarının sağlıklı akrabalarına göre anlamlı olarak yüksek olduğu görülmüştür (p=0.0065). Fakat tüm gruplar ayrı ayrı incelendiğinde, HLA-B51 taşıyıcılığının metilasyon seviyeleri üzerinde anlamlı bi fark yaratmadığı ortaya çıkmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar, Behçet ikizleriyle yaptığımız önceki çalışmamızın sonuçlarıyla tutarlı olarak bulunmuştur. Bu veriler ışığında, HLA-B51 alelinden bağımsız olarak muhtemel epigenetik mekanizmaların, hastalığın oluşumunda etkili olabileceği düşünülmüştür. Bu çalışmanın devamı niteliğinde, epigenetik mekanizmaların değişken olabildiği göz önünde bulundurularak, Behçet Sendrom’lu ailelelerdeki sağlıklı akrabalar, ortaya çıkabilecek çeşitli Behçet Sendromu benzeri bulgular açısından takip altında tutulmalıdır. Aynı şekilde HLA-B bölgesinde saptanmış DNA metilasyon farklılıklarının gen ekspresyonuna etkisinin görülmesi amacıyla, aynı bölge için gen ekpresyonu analizleri yapılmalıdır. Bu çalışmalara ek olarak, münferit Behçet vakalarında da aynı şekilde, HLA-B51 genotiplemesi ve HLA-B bölgesi için DNA metilasyon analizleri tekrarlanmalıdır. Bu sayede ailesel ve münferit vakalarda HLA-B51 sıklığı ve HLA-B genindeki DNA metilasyon farklılıkları gözlemlenebilir. Gelecekte yapılacak çalışmalar için, HLA-B51 aleline spesifik metilasyonun araştırılması, gen içerisinde ya da genler arasında etkili olabilecek faktörlerin anlaşılmasında yararlı olacaktır. Buna ek olarak, HLA-B5101 ve HLA-B5108 gibi alt alel farklılıkları, Behçet Sendrom’lu bireyler arasında saptanarak, alt alel değişimlerinin hastalık üzerindeki etkisi gösterilebilir.
-
ÖgeAilesel Multıpl Skleroz'da Bağlantı Analizi Ve Genom Çapı İlişkilendirme Çalışması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-06-29) Everest, Elif ; Turanlı, Eda Tahir ; 10078512 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMultipl Skleroz (MS); merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen, immun-aracılı, nöroinflamatuvar, nörodejeneratif bir hastalıktır. MS, hem ak hem gri maddede demiyelinizasyon ile görülen multifokal lezyonlar, aksonal transeksiyon, nöronal dejenerasyon, gliyozis ve perivenüler inflamatuvar hücre infiltratı ile karakterize edilir. Bu patolojik özelliklerin otoreaktif lenfositlerin kan beyin bariyerinden geçerek miyelin gibi MSS bileşenlerinin yıkımına sebep olmaları sonucu ortaya çıktığı düşünülmektedir. Bu proseste T hücrelerinin ana rolü oynadığı düşünülmekle birlikte, naif CD4+ T yardımcı hücrelerinden farklılaşan Th1 ve Th17 hücrelerinin patogenezdeki rolleri önceki çalışmalarda gösterilmiştir. MS patolojisi; başta görsel, duyu, motor ve kognitif semptomlar olmak üzere geniş bir klinik tablo oluşturmaktadır. Hastalık, farklı klinik tipler olarak kendini göstermektedir. Temel olarak MS'in klinik belirtileri 20 ve 40 yaşları arasındaki genç yetişkinlerde yinelenen-düzelen MS (RRMS) formu olarak ortaya çıkmakla birlikte atak dönemleri arasında hastalarda tam ya da kısmi düzelmeler gözlenir. RRMS hastalarının birçoğu sonradan progresif MS formlarına dönüşmektedir. MS'in klinik spektrumu ayrıca presemptomatik fazlar içermektedir. Bunlardan biri olan klinik izole sendromda (KIS) hastalar tek bir atak geçirir ve ikinci bir atak ya da spesifik lezyon aktivitesi gösterdikleri takdirde klinik olarak kesin MS teşhisi konur. MS tanısı için Schumacher kriterleri başta olmak üzere Poser ve McDonald (2001, 2005 revizyonu, 2010 revizyonu) kriterleri geliştirilmiştir ve günümüzde tanıda kullanılan belli parametreler mevcuttur. Klinik muayenenin yanı sıra göz önünde bulundurulan parametreler; magnetik rezonans (MR) görüntüsünde MS-spesifik lezyonların ve beyin-omurilik sıvısında oligoklonal bantların varlığı ve tepkisel potansiyel ölçümleridir. Mevcut kriterler ile MS'in tanısı kolaylaştırılmış olsa da nöromiyelit optika (NMO) gibi MS'e benzerlik gösteren bir grup hastalığın mevcut olması kesin tanıyı zorlaştırabilmektedir. Aynı zamanda alt tipler arasındaki geçişlerin ya da hastaların tedavilere verecekleri tepkilerin tahmin edilebilmesinde de zorluklar yaşanmaktadır. Bu amaçla bir süredir hastaların vücut sıvılarında gerçekleştirilen proteomik analizlere yoğunlaşılmasıyla birlikte, henüz geliştirilmiş ve onaylanmış tanı kitleri bulunmamaktadır. Diğer taraftan, bu çalışmalar ile günümüze kadar birçok aday protein belirteci tanımlanmıştır. MS, spesifik çevresel etkenler altında genetik olarak yatkın bireylerde ortaya çıkan kompleks bir hastalıktır. Klasik genetik çalışmalar sonucu MS'in 25%-76% arasında değişen kalıtılabilirlik hesaplamalarıyla birlikte genetik bir altyapısının olduğu gösterilmiştir. MS hastalarının birinci dereceden akrabası olmanın MS riskini 20-40 kat, yaklaşık 1/1000'den 1/25-50'ye arttırdığı gösterilmiştir. Ayrıca ikiz çalışmaları sonucu tek yumurta ikizlerinin MS için konkordans oranının çift yumurta ikizlerine göre daha fazla olduğu görülmüş, böylece gözlemlenen ailesel agregasyonun ortak çevredense ortak kalıtılan faktörlere daha çok bağlı olduğu ortaya çıkmıştır. MS'in genetik temelinin ilk kez kanıtlandığı bağlantı analizleriyle 6.kromozomda bulunan majör histokompatibilite kompleks (MHC) bölgesinin MS riski ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Daha sonraki bağlantı analizleriyle ayrıntılı haritalama sonucu spesifik olarak sınıf II insan lökosit antijen (HLA) bölgesindeki HLA-DRB1 lokusunun MS ile güçlü bir asosiyasyon gösterdiği bulunmuştur. Takip eden bağlantı ve aday-gen temelli analizler ile birçok farklı HLA asosiyasyonuna ek olarak interlökin 7 reseptör alfa (IL7RA) geninin de MS ile ilişkisi gösterilmiştir. Sonrasında gerçekleştirilen çip temelli genom çapı ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) ile 110 tane HLA olmayan asosiyasyon bulunmuştur. Bu genlerin birçoğu T hücre aktivasyonu ve lenfosit proliferasyonu gibi immün yolaklarda yer aldığından, MS'in immün temelini destekleyecek niteliktedir. Ayrıca genlerin üçte birinden fazlasının daha önce farklı otoimmün hastalıklarla ilişkisi gösterilmiştir. Fakat, birçoğunun MS ile fonksiyonel olarak ilişkisi henüz bilinmemektedir. Ayrıca MS ile ilişkisi gösterilmiş bütün HLA olmayan genler düşük-orta risk etkisine sahip yaygın varyantları teşkil etmektedir ve HLA asosiyasyonları ile birlikte MS'in tahmin edilen kalıtılabilirliğinin yalnızca 27%'si kadarını açıklamaktadır. Daha yüksek işlem hacmine sahip teknolojilerin geliştirilmesiyle, mevcut verilerin meta-analizleriyle ve disiplinler arası çalışmalarla MS genetiği ile ilgili bu büyük bilgi açığının ilerleyen zamanlarda doldurulması mümkündür. Daha önce grubumuz, 2007'den beri İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Nöroloji Bölümü'nde toplanan farkli alt tiplere sahip 179 MS hastasında ve 42 MS olmayan kontrolde proteomik bir çalışma gerçekleştirmiş ve toplamda 151 proteinin kontrollerle karşılaştırıldığında MS hastalarında ya da farklı MS alt tiplerinde ekspresyon seviyesinin değiştiğini saptamıştır. Çalışmada birçok potansiyel biyobelirteçle birlikte MS'teki patolojik yolaklar açığa çıkarılmıştır. Bu yolaklar renin-anjiyotensin, aldosteron-regüle sodyum geri emilim, komplement-koagülasyon ve notch sinyal yolaklarını içermektedir. Bu çalışmada ise, bildiğimiz kadarıyla şu ana kadar ilk kez, ailesel MS soyağaçlarından ve akraba olmayan hasta/kontrol gruplarından elde edilen genetik veriler, aynı bireylerin proteomik sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Bu amaç ışığında, öncelikle MS hastalarını ve sağlıklı/hasta akrabalarını içeren 28 aileden (42 MS hastası, 37 sağlıklı kontrol) etik kurul onayı ve her bir bireyden bilgilendirme onam formu alındıktan sonra kan örneği toplanmıştır. Kan örneklerinden DNA izole edildikten sonra bilgi verici nitelikteki 10 aile seçilerek bir bağlantı analizi gerçekleştirilmiştir. Öncelikle bu ailelerdeki 18 MS hastası ve 17 sağlıklı akrabada Illumina CytoSNP 300K array kullanılarak genom boyu SNP genotiplemesi yapılmıştır. Toplamda 300.000 SNP genotiplendirilmiş ve eleme kriterlerinin ardından 245.008 adet SNP çalışmalara dahil edilmiştir. Bağlantı analizi için 1 cM aralıklarla bulunan 3118 bilgi verici SNP, SimWalk multipoint nonparametric linkage (NPL) analiziyle taranmıştır. Genomda NPL skoru 1.7'den yüksek olan 13. (37.9 cM, en yakın SNP rs612701, NPL Z = 1.72, p = 0.019) ve 21. (41.82 cM, en yakın SNP rs2834861, NPL Z = 1.7, p = 0.019) kromozomlardaki birer bölge detaylı haritalama amacıyla sırasıyla 639 ve 831 SNP ile 0.2 cM aralıklarla taranmıştır. Bunun sonucunda, bağlantı için en umut verici lokusların sırasıyla 1.82 ve 1.85 NPL skorlarıyla 13q13.3 (34.11 cM, en yakın SNP rs1461965, NPL Z = 1.82, p = 0.015) ve 21q22.2 (45.08 cM, en yakın SNP rs11701543, NPL Z = 1.85, p = 0.014) olduğu belirlenmiştir. Bu lokuslardan Interferon (Alfa, Beta, and Omega) Receptor 1 (IFNAR1) 18417, Interferon (Alfa, Beta, and Omega) Receptor 2 IFNAR2 11876 polymorphisms ve Mab-21-Like 1 (MAB21L1) CAG tekrar sayıları sonraki analizler için aday olarak seçilmiştir. Seçilen bölgeler Türk kökenli 27 akraba olmayan MS hastası ve 10 sağlıklı kontrolde polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılıp genotiplenmiştir. Genotip ve alel frekanslarının hesaplanarak istatistiksel analizler yapılmış ve bunun sonucunda IFNAR2 11876 GG genotipinin MS riskiyle ilişkisi bulunmuştur (P = 0.027, OR 3.64 [95% CI 1.09 – 12.1]). Daha sonra, proteomik çalışmaya ve bağlantı analizine dahil edilmiş olan 11 akraba olmayan MS hastası ve 60 sağlıklı kontrol ile bir genom çapı ilişkilendirme çalışması (GWAS) gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın sonucunda MS ile anlamlı derecede (P < 10-4) ilişki gösteren 14, anlamlıya yakın (P < 10-3) ilişki gösteren ise 106 SNP belirlenmiştir. Ardından, bağlantı analizi sonucu açığa çıkarılan kromozomal bölgeler ve GWAS sonucu bulunan SNP'ler analiz edilerek önceki proteom çalışması ile olası korelasyonlar incelenmiştir. GWAS sonucu MS ile anlamlı ölçüde ilişkili bulunan bir gen (INS-IGF2, P = 4.39E-07) ve anlamlıya yakın ölçüde ilişki gösteren sekiz genin (PRKCE, MAPK9, RBPJL, ADAMTSL1, NR6A1, NOTCH2, IL1R1, NTN1) MS alt tiplerinde etkilenmiş olduğu belirlenen yolaklarda rol aldığı gözlenmiştir. Ek olarak, GWAS ve bağlantı analizi için ortak olan üç gen (CLDN14, RUNX1, LINC00598) olduğu görülmüştür. Genetik analizlerde yer alan bireylerin tek tek proteom verisi incelendiğinde ise bir ya da daha fazla hastada ekspresyon seviyesi değişmiş 20 proteini kodlayan genin, GWAS sonucunda anlamlı ya da anlamlıya yakın ilişki gösteren SNP'i içerdiği belirlenmiştir. Bu genler arasından tek anlamlı SNP ilişkisi gösteren genin CNTN5 olduğu görülmüştür (P = 4.71E-05 and P = 7.79E-05). Bu çalışmada disiplinler arası bir yaklaşım izleyerek genetik, proteomik ve biyoinformatik analizler ile birçok aday gen belirlemiş bulunmaktayız. Bu genlerin MS'teki rolleri ileriki çalışmalarda araştırılacaktır.
-
ÖgeAilevi Akdeniz Ateşi Hastalığında Mefv Varyasyonlarının, Ekspresyonunun Ve Pirin Seviyesinin Analizi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-06-07) Sevinç, Neslihan ; Turanlı, Eda Tahir ; 10111694 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAilevi Akdeniz ateşi (AAA) otozomal resesif olarak kalıtılan otoinflamatuvar bir hastalıktır. Periodik olarak tekrarlayan ateş, eklem göğüs ve karın ağrısı hastalığın belli başlı bulgularıdır. AAA hastalığı bir çok popülasyonda gözlemlenmesine karşın, hastaların büyük çoğunluğunu Akdeniz kökenli popülasyonlardan bireyler oluşturur. Hastalık özellikle, Türkler, Ermeniler, Araplar ve kuzey Afrika Yahudileri arasında yaygındır. AAA hastalarında dönemsel olarak meydana gelen inflammatuvar ataklar çeşitli organlarda amiloid birikimine yol açabilmektedir. Bu durum hastalığın seyrinde ağırlaşmaya yol açmakta ve bireylerin hayat kalitesini ve ömrünü etkileyebilmektedir. Dolayısıyla hastalık prognozu organlardaki amiloid birikiminin engellenmesine bağlıdır. Anti-inflammatuvar bir ilaç olan kolşisin 1972 yılından bu yana AAA hastalığının tedavisinde kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalar ilacın AAA hastalarında pediodik atakları ve amiloid oluşumunu engellediğini göstermiştir. Ancak, hastaların yaklaşık olarak %30-40‟ı ilaca kısmi cevap vermekte, %5-10‟u ise direnç göstermektedir. Buna ek olarak, hastaların %2-5’inde ilaca hassasiyet rapor edilmiştir. Bu nedenle, kolşisine alternatif olabilecek çeşitli biyolojik ajanların AAA hastalığının tedavisindeki rolü araştırılmaktadır. Akdeniz ateşi geni (MEFV) kromozom 16’da 13.3 bölgesinde bulunur ve 10 ekzondan oluşur. Bugüne kadar MEFV geninde 200’den fazla sekans varyasyonu rapor edilmiştir ve bu varyasyonlardan ekzonik bölgelerde yer alanların büyük çoğunluğu hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Hastaların %70’inden fazlasında yaygın olarak gözlemlenen varyasyonlar MEFV geninin ekzon 2 (E148Q, R202Q) ve ekzon 10 (M680I, M694V, M694I ve V726A) bölgelerinde bulunur. Buna karşın, hastalığın teşhisini kolaylaştırmak amacıyla MEFV geni üzerindeki patalojik varyasyonların taranması AAA’nın yaygın olarak gözlemlendiği popülasyonlardaki yüksek taşıyıcılık oranı nedeniyle kesin tanıda yetersiz kalabilmektedir. Bunun yanı sıra, MEFV geni üzerinde her hangi bir patolojik varyasyon saptanamayan, buna karşın tipik AAA kliniği gösteren hastalar da mevcuttur. Bu durum, otozomal resesif geçiş gösteren kalıtsal Mendel hastalıklarında gözlemlenen modele uymamaktadır. Bu amaçla MEFV geninin ilişkili olabilecek epigenetik ve taranskiripsiyonel düzenleyici mekanizmalarını araştırdık. İlk bulgularımıza göre, MEFV geninin ekzon 2 bölgesinde meydana gelen metilasyon hücre çekirdeğinde, hücre kültürü modellerinde ve hasta lökositlerinde alternatif kırpılma sonucunda yeni bir varyant oluşmasına neden oluyor. Bu varyant daha sonra sitoplazmada protein izoformuna dönüştürülüyor. MEFV geninin kırpılmamış formu 781 amino asitten (a.a.) oluşan pirin/marenostrin proteinini kodlar. MEFV-d2 (MEFV Δ2) ise MEFV genine ait alternatif kırpılma sonucunda exon 2 bölgesinin silinmesiyle oluşan bir izoform olup, 570 a.a. uzunluğunda bir protein kodlar. Buna ek olarak pirin proteinine ait başka izoformlar da tanımlanmıştır. Bu tez çalışmasında, AAA hastaları ve kontrollerde MEFV gen varyasyonlarının transkript ve protein seviyesi ile korelasyonu araştırılmıştır. Daha önceki çalışmalar MEFV geninin dendritik hücreler, sinovyal fibroblastlar, nötrofiller, eozinofiller ve monositlerde ifade edildiğini göstermiştir. Farklı MEFV varyasyonlarını MEFV geninin transcript seviyesi ile ilişkilendiren çalışmalar mevcuttur. Yapılan bir çalışmada, AAA hastalarının mRNA seviyeleri sağlıklı bireylerden düşük bulunmuştur. Buna ek olarak, sağlıklı taşıyıcılarla karşılaştırma yapıldığında sağlıklı taşıyıcıların mRNA seviyesi orta düzeyde bulunmuş, bu da mutasyon sayısının mRNA miktarı ile ilişkili olabileceğini düşündürtmüştür. Ayrıca, mutasyonun bulunduğu gen bölgesine ve tipine göre de MEFV ekspresyonunun değişebileceği gösterilmiştir. M694V mutasyonu taşıyan bireylerde mRNA seviyesinin diğer hastalara oranla en düşük seviyede olduğu ve M694V mutasyon sayısındaki artışın bu oranı daha da düşürdüğü belirtilmiştir. Buna ek olarak E148Q mutasyonu taşıyan bireylerin mRNA seviyesinin diğer hastalardan daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Grubumuz tarafından yayınlanan daha önceki çalışmalarda da MEFV taranskript seviyesinin AAA hastalarında düştüğü gösterilmiş, buna karşın alternatif kırpılma sonucunda ekzon 2’nin silinmesiyle oluşan transkript seviyesinin kontrollere oranla hastalarda daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Ancak pirin proteininin AAA hastalığında ve inflamasyondaki rolü henüz aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, yürütülen çalışmada hasta-kontrol çalışması yönteminden yararlanılarak farklı genotiplere sahip AAA hastalarında MEFV geninin ifadesinin ve pirin protein seviyesinin araştırılması amaçlanmaktadır. Bu doğrultuda, 69 AAA hastası ve 28 sağlıklı kontolün genotiplerini belirlemek amacıyla MEFV geninde varyasyon analizi yapılmıştır. 69 AAA hastasından 8’inde (%11) her hangi bir patalojik varyasyon bulunamamıştır. Buna karşın 30 (%43) hastada ekzon 2 bölgesinde varyasyon bulunmuş, 31 (%44) hastada ise ekzon 10 bölgesinde patalojik varyasyonlar tespit edilmiştir. MEFV geninin farklı transkriptlerinin ifadesi ekzon 1-3, ekzon 2-3 ve ekzon 4-5 bağlantı bölgelerini hedefleyen primerler kullanılarak Kantitatif- gerçek zamanlı PZR (Q-PCR) yöntemi ile araştırılmıştır. Farklı genotiplere sahip hastalar ve sağlıklı kontrollerin pirin seviyelerini karşılaştırmak amacıyla ise bireylerin tam hücre lökositleri izole edilerek, bu hücrelerde anti-pirin antikoru kullanılarak western blot analizi yapılmıştır. Elde edilen sonuçların yarı kantitatif analizi Image-Lab yazılımı ile hacim densitometre yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Daha önceki çalışmalardan farklı olarak, yürütülen çalışmada MEFV transkript seviyesinin hasta ve kontoller arasında değişmediği bulunmuştur. Bugüne kadar yürütülen çalışmaların planlanmasındaki farklılıklar ve farklı çalışmalarda MEFV geninin farklı bölgelerinin hedeflenmesi, MEFV geninin farklı transkriptlerinin hedef alınmasına yol açmış, bu durum da çalışmalarda genin ifadesi ile ilgili sonuçların farklılık göstermesiyle sonuçlanmış olabilir. Ancak, daha önceki çalışmalarda sınırlı sayıda örnek ile çalışıldığı, buna karşın yürütülen tez çalışmasında daha önceki çalışmalara oranla daha fazla örnek ile çalışıldığı göz önünde bulundurulmalıdır. Yürütülen çalışmada gen ifadesinin yanı sıra pirin protein seviyesi de 48 hasta ve 24 sağlıklı kontrolde araştırılmış ve AAA hastası bireylerde pirin miktarında kontrollere oranla anlamlı bir artış gözlemlenmiştir (p= 0,0092). Hastalarda gözlemlenen yüksek pirin seviyesinin periodik inflamatuvar ataklara neden olan AAA hastalığının fenotipinin oluşmasında etkili olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen bulgular pirin proteinin imflamasyonu tetikleyici rol oynadığı yönündeki hipotezi destekleyici niteliktedir. Sunulan tez çalışmasında, MEFV geninin transkript seviyesi ile pirin proteinin seviyesi arasında bir korelasyon bulunamamıştır. Bu bulgular AAA hastalığının oluşumunda post-trasnkripsiyonel mekanizmaların etkili olabiliceğini düşündürmektedir. İleriki çalışmalarda, transkript ve protein seviyesinde hücre alt tipleri ayrıştırılarak analizlerin tekrarlanması, bunun yanı sıra transkript ve protein izoformalarının ayrı ayrı incelenmesi MEFV geninin hastalık ile ilişkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. AAA hastalarında atak dönemlerinde yoğun belirtiler gözlemlenir. Bu nedenle, ataklı hastaların çalışmaya dahil edilmesi hastalık patogenezi hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır.
-
ÖgeAkrilamidin Hücre İskelet Proteinleri Üzerine Etkileri(Fen Bilimleri Enstitüsü, ) Koyuncu, Ceren Eke ; Karabay Korkmaz, Arzu ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMikrotübüller hücre iskeletinin major elementlerinden biridir. Mikrotübüller, globuler bir protein olan tübülinden oluşan uzun protein polimerleridir. Görevlerini tübülin altbirimlerinin polimerizasyonu ve depolimerizasyonuyla ve mikrotübül motor proteinlerinin hareketiyle yerine getirirler. Mikrotübüller ayrıca nöronal hücre iskeletinin major elementlerinden biridir ve aksonal transportta rolleri vardır. Akrilamid yüksek oranda suda çözünür olan bir a,b-doymamış karbonil bileşenidir. Polimer üretimi, cevher işlenmesi, mineral işlenmesi, kozmetik katkılar gibi geniş bir endüstiriyel kullanım alanı vardır. Akrilamid nörotoksik olduğu kadar, genotoksik, karsinojenik, erkek üreme sistemi üzerine toksik etkileri olan bir maddedir. Santral-periferal distal aksonopatiye neden olur. Bu çalışmada, akrilamidin mikrotübüller üzerine in vitro etkileri farklı metodlar kullanarak araştırıldı. İlk olarak, tübülin proteinleri sığır beyninden tekrarlanan polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri sonrasında ve iyon-değiştirici kolon kromatografisiyle saflaştırıldı. Akrilamidin mikrotübüller üzerine olan etkilerini göstermek için sedimentasyon, floresan spektrometre, malakayt yeşili yöntemi ve elektron mikroskopi teknikleri kullanıldı.
-
ÖgeAlternatif Besin Yan Ürünlerinden Bakteriyel Selüloz Üretimi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011-01-04) Yılmaz, Sezin ; Tüter, Melek ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışmada, Acetobacter xylinum DSM 2004 tarafından bakteriyel selüloz sentezlenmesi için gerekli optimum fermentasyon süresi belirlenmiştir. Yapılan deneysel çalışmalar sonucunda Acetobacter xylinum DSM 2004’ün optimum büyüme süresi ve bakteriyel selüloz üretim süresi 10 gün olarak saptanmıştır. Daha sonra farklı karbon kaynakları kullanılarak bakteriyel selüloz üretimi değerlendirilmiştir. Besi yerine eklenen glikoz, fruktoz, mannitol, sukroz ve laktoz gibi basit şekerler içerisinde en yüksek verimin sukroz içeren besi yeri kullanıldığında elde edildiği görülmüştür. Karbon kaynaklarının etkisinin araştırılmasına ek olarak, Acetobacter xylinum DSM 2004 kullanılarak statik kültürde melaslı besi yerinde bakteriyel selüloz verimi araştırılmıştır. Melastaki safsızlıklardan kurtulmak amacıyla melasa ön işlem uygulanmasına rağmen, elde edilen bakteriyel selüloz verimi basit besi yerine kıyasla daha düşüktür. Yapılan farklı başlangıç şeker konsantrasyonuna sahip melaslı besi yeri deneylerinde en yüksek verim, başlangıç şeker konsantrasyonu 20 g/L ve 40 g/L olduğunda elde edilmiştir. Bu sonuçlara dayanılarak bakteriyel selüloz üretiminde düşük melas konsantrasyonlu besi yerlerinin kullanılması gerektiği görülmüştür.
-
ÖgeAltın Yüzeye Bağlanabilen Çok Yönlü Format Dehidrogenaz Füzyon Proteininin Geliştirilmiş Kinetik Aktivitesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-02-03) Yücesoy, Deniz Tanıl ; Karataş, Ayten ; 422803 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsNAD+-bağımlı format dehidrogenaz (EC 1.2.1.2, FDH) enzimi, format iyonlarını CO2 ‘ye yükseltgeyip aynı zamanda NAD+ molekülünü NADH’a indirgeyen değerli bir enzimdir. D-özgü 2- hidroksi asit dehidrogenaz süper familyasına ait olan bu enzim, aileye mensup diğer enzimlerden yapısal ve substrat ilgisi bakımından bir takım farklılıklar içermektedir. FDH enziminin katalizlediği reaksiyonun diğer dehidrogenazlara oranla oldukça basit olması ve tek basamaklı olması sebebiyle, enzim endüstriyel ve bilimsel kullanımda oldukça yaygındır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi ilk olarak 1950’li yıllarda Mathews tarafından bezelye tohumlarından elde edilmiştir. Buna karşılık enzim popülerliğini 1970’li yılların sonunda kiral moleküllerin endüstriyel sentezinde kullanılan kofaktörlerin geri dönüştürülmesi ve tekrar tekrar kullanılması amacıyla oluşturulan biyoreaktörde kullanılması ile kazanmıştır. 2000’li yılların başında gelişen DNA dizi analizi teknolojisi sayesinde birçok farklı organizmada NAD+-bağımlı format dehidrogenaz genleri tanımlanmıştır. Bu organizmalar arasında en çok ilgiyi içerdikleri FDH enziminin dayanıklılığı ve yüksek kinetik aktivitesinden dolayı Candida cinsine ait organizmalar çekmiştir. Tüm bu çalışmalar ışığında NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin hücre içinde çeşitli stres durumlarında arttığı ve bir çeşit anti-stres proteini olarak görev alıyor olabileceği düşünülmüş ve bu alanda çalışmalara hız verilmiştir. FDH enziminin kofaktör geri dönüşümünde kullanılan en etkili enzim olmasının başlıca sebepleri arasinda ilk olarak enziminin katalizlediği reaksiyon geri dönüşümsüz olmasi, buna bağlı ikincil reaksiyonun tek yönde ilerlemesi ve bu sayede % 100’e yakın bir verim elde edilmesi gösterilebilir. Buna ek olarak FDH enziminin katalizlediği reaksiyonun son ürününün CO2 olması ve CO2’in kolayca buharlaşması sayesinde ekstra saflaştırma adımlarına gerek duyulmaz. Ayrıca, uygun çalışma pH aralığı 6.0-9.0 olması sayesinde de farklı enzimlerle kullanımı mümkündür. Son olarak metanolu karbon kaynagi olarak kullanan mikroorganizmalarda üretilebilmesi sayesinde üretim maliyeti oldukça düşüktür. Tüm bu faktörler ışığında Bommarius ve öğrencileri 1995 yılında Candida boidinii mikroorganizmasindan izole ettikleri NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimini L-tert-leucine amino asidinin kiral sentezinde kofaktör geri kazanımı amacıyla başarılı bir şekilde kullanmışlardır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin başlıca dezavantajları arasında aktif sistein amino asitlerinden kaynaklanan düşük dayanıklılığı, NADP kofaktör molekülüne özgü ilgisinin olmaması ve üretildiği metanol kullanan mikroorganizmalarin yüksek maliyetidir. Tüm bu dezavantajların üstesinden gelebilmek amacıyla protein mühendisliği yöntemleri kullanılarak enzim üzerinde çeşitli modifikasyonlar ve mutasyonlar yaratılmıştır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi doğrudan hidrit iyonu (H-) transferini gerçekleştirebilme kabiliyetine sahip olduğundan bu az görülen reaksiyonunun çalışılabilmesi ve tepkime basamaklarının aydınlatılabilmesi açısından da son derece uygun bir enzimdir. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi genel olarak çift substratlı sıralı Bi-Bi reaksiyonu mekanizması ile çalışır. Bu mekanizmada NAD+ molekülü birincil substrat olarak görev alır ve enzime bağlanması, enzimin formata iyonuna olan ilgisini üç kat arttırır. Bu reaksiyon türü dehidrogenazlarin önemli bir kısmında da oldukça yaygındır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi amino ve karboksil bölgeleri olmak üzere iki ana bölüme ayrılabilir. Amino bölgesinin enzim aktivitesinde önemli bir role sahip olduğu bilinmektedir. Maya ve mantar kökenli NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimlerinin amino asit dizilerinde herhangi bir fark olmamasına rağmen, bakteriyel kökenli NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminde bir takım amino asit eklenmeleri mevcuttur. Candida methylica NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi yaklaşık alarak 46000 Dalton boyutunda ve 364 amino asitten oluşan bir moleküldür. Yapılan çalışmalarda ayrıca Candida methylica NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cmFDH) ve Candida boidini NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cbFDH) NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimlerinin katalitik bölgesindeki amino asitlerin ayni oldukları görülmüştür. Bunlar, 77. sıradaki Prolin (Pro77), 78. sıradaki Fenilalanin (Phe78), 102. sıradaki İzolösin (Ile102), 118. sıradaki Asparajin (Asn118), 171. sıradaki Alanin veya Glisin (Ala/Gly171), 173. sıradaki Glisin (Gly173), 176. sıradaki Glisin (Gly176), 267. sıradaki Arjinin (Arg267), 287. sıradaki Glütamin (Gln287) ve 310. sıradaki Histidin (His310) amino asitleridir. FDH enzimi endüstride oldukça yaygın kullanım alanına sahiptir. Bunların başında kiral moleküllerin sentezi gelir. Nikotinamid adenin dinükleotid kullanımından doğan yüksek maliyeti azaltabilmek amacıyla bu tür üretimlerde FDH enzimi NADH indirgeni olarak kullanılır. Diğer bir kullanım alanı ise format biyosensörleridir. Format biyosensorlerinde, format iyonunun varlığını eser miktarda da olsa tanımlayabildiği için, sensör uygulamalarında oldukça yaygın olarak kullanılır. Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) yaklaşık olarak 300’den fazla dehidrogenaz enzimi tarafından kofaktör olarak kullanılan ve elektrokatalitik yükseltgenmesi sonucu katı yüzey üzerinde yüksek bir potansiyel fark meydana getiren bir moleküldür. Bu enzimlerin farklı substratlar varlığında NADH’a olan özgüllüklerinin arttırılması ve redoks kabiliyetlerinin yükseltilmesi üzerine uygulanan analitik yaklaşımlar ve çalışmalar literatürde mevcuttur. Enzimlerin endüstriyel alanda tekrar tekrar kullanılabilmesi, dayanıklılığının artırılması amacıyla günümüze kadar çeşitli tutuklama yöntemleri geliştirilmiştir. Literatürde birçok farklı tutuklama metodu mevcuttur. Bunların arasında elektriksel etkileşim aracılığı ile fiziksel tutuklama ve kovalent bağ oluşturup kimyasal olarak bağlama yöntemleri en geniş yeri kaplar. Özellikle kovalent bağ oluşturup kimyasal olarak bağlama yöntemi için literatürde onlarca farklı yaklaşım mevcuttur. Bunların arasında ilk olarak akla gelenler, amin, tiyol, karboksil reaksiyonlarıdır. Son zamanlarda ise bu söz konusu geleneksel tutuklama yöntemleri sebep olduğu çeşitli sorunlar nedeniyle yerlerini daha modern metotlara bırakmışlardır. Elektriksel etkileşim ile fiziksel tutuklama metodunda bağın zayıflığından doğan akma problemleri ve kovalent bağ ile tutuklama metodunda sıklıkla görülen enzimin kinetik aktivitesindeki azalma bu problemlere başlıca örneklerdir. Tutuklama için kullanılabilecek bir diğer yol ise biyomoleküllerin birbirine olan ilgisine dayalı histidin kuyruğu ve biyotin-avidin etkileşimi yöntemleridir. Fakat bu yöntemler de birtakım sorunlar içermektedirler. Gen mühendisliği yöntemiyle geliştirilmiş olan (GEPI) peptitler farklı inorganik yüzeylere özgün olarak bağlanabilme kapasitesine sahiptir. Bu dizilerin inorganik malzemelere olan seçici ve yüksek ilgisi enzim tutuklama teknolojisinde geleneksel metodlara iyi bir alternatif olacağı düşünülmüştür. Bu amaçla FDH enziminin amino ucuna altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenmiş ve birlikte füzyon halinde üretilmesi sağlanmıştır. Peptitin boyunun uzun olması sebebiyle eklenmesi beş farklı primer ve iki farklı PCR reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Sonrasında peptit-enzim füzyonlarının E. coli bakteriyel ekspresyon sisteminde, güçlü bir promotor altında IPTG indüklenmesi vasıtasıyla üretilmeleri sağlanmıstır. Enzimin içerdiği Histidin amino asitlerinden oluşan kuyruğun Nikel Nitrilotriasetik asit molekülüne (Ni-NTA) olan ilgisi kullanılarak saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan proteinler sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile görüntülenmiş ve yeterli saflıkta elde edildiklerini belirlenmiştir. Saflaştırma aracı olarak kullanılan enzimin amino ucunda yer alan altı adet Histidin amino asidi altına özgül olmayan şekilde bağlanma kapasitesine sahip olduklarından dolayı PreScission Proteaz enzimi vasıtası ile uzaklaştırılmıştır. Histidin kuyruğu denilen bu bölge saflaştırılmış enzimlerden uzaklaştırıldıktan sonra aktivite tayinleri literatürde varolan yöntemler uygulanarak yapılmıştır. Bu amaçla, format iyonunun substrat olarak kullanıldığı ve NAD+ kofaktörü aracılığı ile gerçekleşen reaksiyon koşulları literatürde belirtilen koşullarda hazırlanmış ve değişen format iyonu konsantrasyonunda oluşan NADH molekülü tayini 340 nanometre dalga boyunda UV-spektrofotometresi kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar ışığında, amino ucuna altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenen NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin kinetik aktivite değerlerinde altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenmemiş NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimine oranla herhangi bir azalma olmadığı gözlemlenmiştir. Sonrasında yüzey plasmon rezonans spektroskopisi (SPR) yöntemiyle oluşturduğumuz füzyon proteininin altın kaplı SPR yüzeylerinde tutuklama kapasitesi ölçülmüş ve AuBP2 eklenmemiş NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi ile karşılaştırılmıştır. Bu sonuçlar ışığında da amino ucuna altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenen NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin, AuBP2 eklenmemiş NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimine oranla altın yüzeye 12 kat daha güçlü bağlandığı tayin edilmiştir. Sonuç olarak tüm bu veriler ışığında AuBP2 peptidinin enzim aktivitesinde herhangi bir azalmaya yol açmadığı buna karşılık enzime altın yüzeye özgün şekilde bağlanabilme yeteneği kazandırdığı gösterilmiş ve bu amaçla enzimlere eklenebilecek ideal bir molekül olduğu ispatlanmıştır.
-
ÖgeAltına Özgül Bağlanan Peptit İçeren Alkalin Fosfataz Enzimi İle Kalsiyum Fosfat Biyomineralizasyonunun Gerçek Zamanlı İzlenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-02-20) Çalışkan, Hüseyin Burak ; Tamerler, Candan ; 423593 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAnorganik yüzeylere özgül olarak bağlanan genetik yöntemlerle tasarlanmış peptitler, doğadan esinlenen çok işlevli sistemlerin oluşturulması için bir önemli üstünlükler sağlamaktadır. Kısa amino asit zincirlerinden oluşan bu peptitler moleküler bağlayıcılar olarak geleneksel yöntemlerin karşılaştığı güçlüklere çözüm olarak kullanılabilecek işlevsel biyomoleküllerdir. Bu çalışmada beş sıralı tekrar biçiminde altına özgü bağlanan peptitin alkalin fosfataz enzimine moleküler biyoloji yöntemleriyle eklenmiş yapısı, kalsiyum fosfat mineralizasyonunun gerçek zamanlı takip edilmesi amacıyla kullanılmıştır. Kalsiyum fosfat kemik ve diş gibi sert dokuların ana maddesi olan önemli bir biyomineral olarak hem omurgalı hem de omurgasız canlılarda farklı kristal yapılarda bulunmaktadır. Kuramsal açıdan olduğu kadar tedavi alanında pratik bakımından da önemli olmasından dolayı kalsiyum fosfatın hem oluşum hem de kristal faz geçişleri hakkında birçok çalışma yürütülmektedir. Alkalin fosfataz enzimi fosfat grubu içeren kimyasal yapılarndan hidroliz tepkimesi ile anorganik fosfat grubu açığa çıkmasını sağlama özelliğine sahiptir. Bu nedenle mineral oluşumu çalışmalarında biyominerallerin üretilmesi için söz konusu enzimin bu tür tepkimelerinden esinlenilmektedir. Yüzey plazmonik rezonans spektroskopisi moleküler etkileşimlerin gerçek zamanlı incelenmesini sağlayan çok hassas bir karakterizasyon yöntemidir. Ayrıca SPR proteinlerin katı yüzeylerle özellikle altın yüzeyle etkileşimini incelemek açısında yararlı bir tekniktir. Bu çalışmada GEPI molekülleriyle güçlendirilmiş altına özgü bağlanma özelliği olan alkalin fosfataz enzimi SPR yöntemi kullanılarak mineral oluşumunun gerçek zamanlı incelenmesi amaçlanmıştır. Bu deneysel çalışmalarda izlenen yöntemler hem biyomineral oluşumunun gerçek zamanlı takibine olanak sağlamış hem de genetik yöntemlerle tasarlanan çok işlevli alkalin fosfataz enziminin altına özgü bağlanma özellikleri incelenme imkânı sunmuştur. Ayrıca doğal enzime kıyasla GEPI molekülleriyle işlevselleştirilmiş alkalin fosfatazın daha yüksek aktivite gösterdiği bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre GEPI bağlı alkalin fosfataz altın yüzey üzerinde biyomineral oluşumunu tetikleme özelliğine ek olarak kalsiyum fosfat oluşumunun yüzey plazmonik rezonans yöntemi ile takibine olanak sağlamıştır. Yüzey plazmonik resonans spektroskopisinin biyomineral oluşumu hakkında uzun süredir tartışmalı bir konu olan kalsiyum fosfatın olası kristal faz geçişlerini destekleyen veriler sağladığı düşünülmektedir.
-
ÖgeAnalysis of HLA-B51 alleles methylation profiles in Behçet syndrome twins(Institute of Science and Technology, 2013) Özkılınç, Merve ; Turanlı, Eda Tahir ; 332909 ; Molecular Biology - Genetics and Biotechnology ProgrammeBehçet Syndrome, a chronic reumatologic disease, has effect on multiple tissues and organs with an onset generally at 20- 30 ages. Its most definite symptoms are lesions in mouth and genital organs, big and common acnes with inflammation under the skin. Addition to them, inflammation on vision layer, panicula and aches on joints of knee and ankles are the other important diagnosis. In our country, frequency of disease is changing between 20 and 420 of 100.000. Familial aggregation, increase of frequency of disease at Middle East and Mediterrian populations, and the strong linkage of HLA- B gene with disease points out the importance of the genetic factors in the etiology of disease.
-
ÖgeAnoksik Ortamda Biyolojik Fosfor Giderimi Yapan Bakteri Çeşitliliğinin Floresan Yerinde Hibritleşme (fısh) Tekniği İle İncelenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-07-19) Ulutaş, Mehmet Sefa ; Akarsubaşı, Alper Tunga ; 10005548 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsEBPR (Enhanced Biological Phosphate Removal) biyolojik aşırı fosfor giderimi olarak tanımlanan proses, fosfatın atık sulardan uzaklaştırılması işlemidir. Fosfor gideriminin yapıldığı EBPR reaktörlerindeki mikrobiyal toplulukların ne olduğunu ve belirli aralıklarla nasıl değiştiğini öğrenmek; hem EBPR prosesinin performansı hem de reaktördeki biyokimyasal yolağın nasıl işlediği ile ilgili soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu çalışmada oksik ve anosik ortamda biyolojik aşırı fosfor giderimi (BAFG) yapan önde ve sonda denitrifikasyon örneklerin mikrobiyal toplulukların içerisindeki değişimini karakterize etmektir. Önde ve sonda denitrifikasyon örneklerin mikrobiyal topluluklarından oluşan 5 tane sonda denitrifikasyon 10 tane önde denitrifikasyon olmak üzere toplamda 15 tane örnek 16S rRNA geninin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılıp DGGE analizi yapılmış ve klon kütüphanesi oluşturulmuştur. Mikrobiyal yakıt hücrelerinden farklı zamanlarda alınan 15 örneğin analizinde post denitrifikasyon örneklerinin mikrobiyal topluluklarının zaman içerisinde değiştiği, pre-denitrifikasyon örneklerinin ise kısmen mikrobiyal biyo-çeşitliliğini koruduğu sonucuna varılmıştır. Tercih edilen bir BAFG sistemi olması açısından, önde denitrifikasyon prosesinin ilk ve son örneğinin klon kütüphanesi oluşturulmuş ve seçilen klonların sekanslaması yapılmıştır. DGGE analizleri, klon kütüphanesi, sekans verileri ve FISH teknikleri kullanılarak yapılan mikrobiyal kominite analizleri önde denitrifikasyon prosesindeki örneklerin mikrobiyal çeşitliliğinin daha fazla olduğu belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında ise; Önde ve sonda denitrifikasyon örnekleri fosfat depolayan organizmalara (PAOs) ve glikojen depolayan organizmalara (GAOs) ait spesifik problar yardımıyla floresan yerinde hibritleşme tekniği kullanılarak reaktör sisteminde bulunan PAO-GAO oranının belirlenmesidir. Pre-denitrifikasyon ve post-denitrifikasyon EBPR örneklerinin PAOmix probu ile yapılan FISH sonuçlarına göre tüm örneklerde fosfat depolayan bakteriler (PAO) baskın olarak gözükmektedir.
-
ÖgeAnoksik Ortamda Biyolojik Fosfor Giderimi Yapan Bakteri Çeşitliliğinin Kantitatif Gerçek Zamanlı Zincir Tepkimesi Tekniği İle İncelenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-09-13) Ergal, İpek ; Akarsubaşı, Alper Tunga ; 10006137 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsGünümüzde uygulanan biyolojik aşırı fosfor giderimi (BAFG) karışık bir proses olduğu kadar oldukça gelişmiş; maliyeti düşük, çevreye dost atıksu arıtma proseslerinden biridir. BAFG Fosforun giderimi ve potansiyel yeniden fosfor kazanımında, su kaynaklarını ötrofikasyona karşı korumada sürdürülebilir bir yol olduğundan, gün geçtikçe Dünya çapında daha da popüler hale geliyor. BAFG, karmaşık mikrobiyal komünite ile uygulanan iyi bilinen, belirlenmiş sınırları nedeniyle mikrobiyal ekolojide model ekosistem olmak için oldukça uygun bir prosestir. BAFG prosesinin prensibi ardışık anaerobik-aerobik ve/veya anaerobik-denitrifiye koşullarda hücre içinde aşırı miktarda polifosfatı depolayan mikroorganizmaların (PAO) zenginleşmesine dayanır. Yüksek fosfor içeriğine sahip bu mikroorganizmaların fazla çamurla sistemden atılması ile biyolojik aşırı fosfor giderimi gerçekleşmiş olur. Ham atıksuyun içindeki kompleks yapıdaki organik madde anaerobik ortamda fermantasyon sonucu daha basit yapıda uçucu yağ asitlerine (UYA) (örn. asetik asit (HAc)) dönüşürler. Fosfat depolayan mikroorganizmalar anaerobik ortamda oluşan uçucu yağ asitlerini hücre içinde poli- -hidroksialkanoatlar (PHA) (örn. poly-β-hidroksibütirat (PHB)) olarak sentezlerler. Sentezleme için gerekli olan enerji hücre içindeki polifosfat (ATP) ve glikojenin parçalanması ile elde edilir ve bunun sonucunda yüksek miktarlarda fosfor salınımı gerçekleşir. Daha sonra aerobik faza gelen PAO lar aerobik ortamda büyürler. Bünyelerindeki polifosfatı ve glikojeni geri kazanmak için gerekli olan karbon ve enerji kaynağı olarak daha önce anaerobik ortamda depoladıkları PHB’ları kullanırlar. Polifosfatın hücre içinde tekrar depolanması için gerekli olan enerji aerobik ortamda PHB oksidasyonu ile sağlanır. Aerobik ortamda hücreye geri alınan fosfat miktarı anaerobik ortamda salınan fosfattan daha fazla olduğu için biyolojk aşırı fosfor giderimi gerçekleşmiş olur. Son yıllarda biyolojik besi giderimi (BBG) prosesleri ile ilgili yapılan çalışmalar anoksik ortamda elektron alıcısı olarak nitratı (NO3-N) ve/veya nitriti (NO2-N) kullanarak fosfat depolama kabiliyetine sahip organizmaların (denitrifikasyon yapabilen fosfat depolayan organizmalar (DPAO)) varlığını ortaya çıkarmıştır. Klasik biyolojik fosfor giderimi (anaerobik-aerobik) ile kıyaslandığında çamur üretiminde %50, oksijen tüketiminde %30 azalma sağlayan ve karbon kaynağının verimli bir şekilde kullanıldığı anoksik ortamda biyolojik fosfor giderimini etkileyen faktörlerin incelenmesi önem teşkil etmektedir. Literatür incelendiğinde Accumulibacter türlerinin aerobik ve anoksik BAFG giderim sistemlerinde etkin türlerden biri olduğu görülür. Bu nedenle bu mikroorganizmaların BAFG prosesi üzerine etkilerini belirlemek ilginç bir bilimsel araştırma konusu haline gelmiştir. Bu çalışmada, başarıyla işletilmiş iki farklı denitrifiye fosfor giderim prosesi ve onların mikrobiyal komünite yapılarının arasındaki bağlantıyı araştırmak hedeflenmiştir. Bu amaçla Marmara Üniversitesindeki proje ortaklarımız; iki farklı ardışık kesikli reaktör, oksik-anoksik koşullarda ve sonda denitrifikasyon-önde denitrifikasyon konfigürasyonlarında incelenmiştir. Konvansiyonel datalara göre, karbon/azot oranlarına sahip atıksular için önde denitrifikasyon proses konfigürasyonu daha uygundur. Sonda denitrifikasyon-önde denitrifikasyon konfigürasyonlarından belirli zamanlarda alınan örneklerle, ortamda varsayılan Candidatus Accumulibacter phosphatis ‘in varlığını kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi metoduyla belirlenmesi için çalışılmıştır. Önde denitrifikasyon proses örneklerinde Candidatus Accumulibacter phosphatis sayısal olarak yükselen bir profil sergilerken, sonda denitrifikasyon proses örnekleri dalgalanan bir profil sergilemiştir. Önde denitrifikasyon konfigürasyonunda Candidatus Accumulibacter phosphatis miktarsal olarak fosfat giderimiyle doğru orantılı olacak şekilde artmıştır. Önde denitrifikasyon konfigürasyonlarında Candidatus Accumulibacter phosphatis’ in baskınlığını öne sürerken, sonda denitrifikasyon konfigürasyonlarında; Actinobacter türü fosfat depolama kabiliyetine sahip organizmalar ya da henüz belirlenememiş mikroorganizma grupları baskın olabileceğini işaret etmektedir. Tüm bu sonuçlar ışığında; her iki proses konfigürasyonu için ortak bir problem olan nitrit ve/veya nitrat iyonunun anaerobik faza taşınmasını engellemek amacı ile anaerobik faz öncesinde çamurun anoksik koşullar altında gideriminin avantajlı sistem olarak önerilebilir.
-
ÖgeAtp Hidrolizinin Hsp70 Şaperon Proteini Tarafından Katalizlenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-01-22) Maraba, Oğuzhan ; Balta, Bülent ; 10098998 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsMoleküler şaperon proteinleri yeni sentezlenmiş proteinlerin doğal yapılarına katlanmalarında onlara yardımcı olur. Şaperon proteinlerinin çoğu aynı zamanda ısı-şok proteinidir. Bu proteinler stres koşullarında denatüre olmuş proteinlerin yeniden katlanmasına yardım etmede görev almaktadır. Hsp70 de bu proteinlerden bir tanesidir. Bu çalışmada Hsp70'in ATP hidroliz mekanizması QM/MM ONIOM methoduyla QM bölge için M06-2X, MM bölge için AMBER kuvvet alanı kullanılarak incelenmiştir. Grubumuzda daha önceden yapılan moleküler dinamik simülasyonlarına dayanarak D201'in protonasyon durumlarına göre iki ana model düşünülmüştür. Önceki çalışmalarda hidroliz için kritik bir aminoasit olduğu bulunan K70'in üzerinde özellikle durulmuştur. K70'in asit-baz katalizine girip girmediği de araştırılmıştır. Bununla birlikte, asit-baz katalizinde rol oynayabileceği düşünülen başka aminoasitlerle de asit-baz katalizi reaksiyonlarını ifade eden modeller hazırlanmıştır. Asit adayı olarak D194 ve Mg2+ ile K+ arasında bulunan bir su, baz olarak ise E171 seçilmiştir. Kristallografik çalışmalarda ATP'ye koordine olmuş bir Mg2+ iyonunun beta-fostat grubu ile etkileştiği gözlemlenmiştir. Literatürde bu iyonun beta ile gamma-fosfatın arasına kaymasıyla reaksiyonun başlayabileceği öne sürülmüştür. Bu durum da test edilmiştir. Sonuçlanan çalışmalarda, D201'in nötral olduğu yapılarda ATP hidroliz mekanizmasının nükleofilik suyun doğrudan saldırısıyla gerçekleştiği görülmüştür. Bununla birlikte asit-baz katalizi içeren çalışmalar enerjetik olarak uygun sonuçlar vermemişlerdir. Mg2+ iyonunun iki fosfat grubu arasına kaymasının reaksiyonu başlatması da mümkün görünmemektedir. Diğer yandan, D201'in iyonize olduğu durumlardaki yapılarda Pi'ın E171'e veya yakındaki bir su molekülüne proton verme eğiliminde olduğu görülmektedir. Bu durum E171'in ürün oluşumundan sonra proton alabileceğine işaret etmektedir. Ortamdan bir proton silindiğinde ise Mg2+ iyonunun iki fosfat grubu arasına kaymasının enerjetik olarak uygun bir durum olduğu gözlemlenmiştir.
-
ÖgeAtık Aktive Ağartma Toprağından Enzimatik Alkoliz Yoluyla Biyodizel Eldesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, ) Gençoğlu, Aytuğ ; Tüter, Melek ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBu çalışmada, bir yemeklik yağ rafinasyon prosesinden atık olarak çıkan Türkiye kökenli ayçiçek yağından, enzimatik alkoliz yoluyla biyodizel eldesi incelenmiştir. Kullanılan atık yağ, aktive ağartma toprağı (AAT) adı verilen bir adsorbana adsorbe olmuş durumdadır. Çalışmada tepkimenin yağ AAT’den ayrılarak ve yerinde (in situ) yürütüldüğü durumlar karşılaştırılmış, yağın AAT’den ayrılmadığı in situ alkoliz reaksiyonunda daha yüksek verim elde edildiği anlaşılmıştır. Daha sonra alkoliz tepkimesinde katalizör olarak kullanılacak lipaz enziminin belirlenmesi için Lipozyme TL IM ve Lipozyme RM IM lipazları karşılaştırılmış ve Lipozyme RM IM’nin bu uygulama için daha uygun olduğuna karar verilmiştir. Daha sonra tepkimenin gerçekleştirilmesi için en uygun koşulların bulunması amacıyla, enzim/yağ ağırlık oranı, tepkime sıcaklığı, yağ/alkol mol oranı parametrelerinin etkisi ayrı ayrı incelenmiş ve en uygun koşulların 0,20 enzim/yağ ağırlık oranı, 40 oC ve 1:3 yağ/alkol mol oranı olduğu saptanmıştır.