Altın Yüzeye Bağlanabilen Çok Yönlü Format Dehidrogenaz Füzyon Proteininin Geliştirilmiş Kinetik Aktivitesi

Abstract

NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (EC 1.2.1.2, FDH) enzimi, format iyonlarını CO2 ‘ye yükseltgeyip aynı zamanda NAD+ molekülünü NADH’a indirgeyen değerli bir enzimdir. D-özgü 2- hidroksi asit dehidrogenaz süper familyasına ait olan bu enzim, aileye mensup diğer enzimlerden yapısal ve substrat ilgisi bakımından bir takım farklılıklar içermektedir. FDH enziminin katalizlediği reaksiyonun diğer dehidrogenazlara oranla oldukça basit olması ve tek basamaklı olması sebebiyle, enzim endüstriyel ve bilimsel kullanımda oldukça yaygındır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi ilk olarak 1950’li yıllarda Mathews tarafından bezelye tohumlarından elde edilmiştir. Buna karşılık enzim popülerliğini 1970’li yılların sonunda kiral moleküllerin endüstriyel sentezinde kullanılan kofaktörlerin geri dönüştürülmesi ve tekrar tekrar kullanılması amacıyla oluşturulan biyoreaktörde kullanılması ile kazanmıştır. 2000’li yılların başında gelişen DNA dizi analizi teknolojisi sayesinde birçok farklı organizmada NAD+-bağımlı format dehidrogenaz genleri tanımlanmıştır. Bu organizmalar arasında en çok ilgiyi içerdikleri FDH enziminin dayanıklılığı ve yüksek kinetik aktivitesinden dolayı Candida cinsine ait organizmalar çekmiştir. Tüm bu çalışmalar ışığında NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin hücre içinde çeşitli stres durumlarında arttığı ve bir çeşit anti-stres proteini olarak görev alıyor olabileceği düşünülmüş ve bu alanda çalışmalara hız verilmiştir. FDH enziminin kofaktör geri dönüşümünde kullanılan en etkili enzim olmasının başlıca sebepleri arasinda ilk olarak enziminin katalizlediği reaksiyon geri dönüşümsüz olmasi, buna bağlı ikincil reaksiyonun tek yönde ilerlemesi ve bu sayede % 100’e yakın bir verim elde edilmesi gösterilebilir. Buna ek olarak FDH enziminin katalizlediği reaksiyonun son ürününün CO2 olması ve CO2’in kolayca buharlaşması sayesinde ekstra saflaştırma adımlarına gerek duyulmaz. Ayrıca, uygun çalışma pH aralığı 6.0-9.0 olması sayesinde de farklı enzimlerle kullanımı mümkündür. Son olarak metanolu karbon kaynagi olarak kullanan mikroorganizmalarda üretilebilmesi sayesinde üretim maliyeti oldukça düşüktür. Tüm bu faktörler ışığında Bommarius ve öğrencileri 1995 yılında Candida boidinii mikroorganizmasindan izole ettikleri NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimini L-tert-leucine amino asidinin kiral sentezinde kofaktör geri kazanımı amacıyla başarılı bir şekilde kullanmışlardır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin başlıca dezavantajları arasında aktif sistein amino asitlerinden kaynaklanan düşük dayanıklılığı, NADP kofaktör molekülüne özgü ilgisinin olmaması ve üretildiği metanol kullanan mikroorganizmalarin yüksek maliyetidir. Tüm bu dezavantajların üstesinden gelebilmek amacıyla protein mühendisliği yöntemleri kullanılarak enzim üzerinde çeşitli modifikasyonlar ve mutasyonlar yaratılmıştır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi doğrudan hidrit iyonu (H-) transferini gerçekleştirebilme kabiliyetine sahip olduğundan bu az görülen reaksiyonunun çalışılabilmesi ve tepkime basamaklarının aydınlatılabilmesi açısından da son derece uygun bir enzimdir. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi genel olarak çift substratlı sıralı Bi-Bi reaksiyonu mekanizması ile çalışır. Bu mekanizmada NAD+ molekülü birincil substrat olarak görev alır ve enzime bağlanması, enzimin formata iyonuna olan ilgisini üç kat arttırır. Bu reaksiyon türü dehidrogenazlarin önemli bir kısmında da oldukça yaygındır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi amino ve karboksil bölgeleri olmak üzere iki ana bölüme ayrılabilir. Amino bölgesinin enzim aktivitesinde önemli bir role sahip olduğu bilinmektedir. Maya ve mantar kökenli NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimlerinin amino asit dizilerinde herhangi bir fark olmamasına rağmen, bakteriyel kökenli NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminde bir takım amino asit eklenmeleri mevcuttur. Candida methylica NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi yaklaşık alarak 46000 Dalton boyutunda ve 364 amino asitten oluşan bir moleküldür. Yapılan çalışmalarda ayrıca Candida methylica NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cmFDH) ve Candida boidini NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (cbFDH) NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimlerinin katalitik bölgesindeki amino asitlerin ayni oldukları görülmüştür. Bunlar, 77. sıradaki Prolin (Pro77), 78. sıradaki Fenilalanin (Phe78), 102. sıradaki İzolösin (Ile102), 118. sıradaki Asparajin (Asn118), 171. sıradaki Alanin veya Glisin (Ala/Gly171), 173. sıradaki Glisin (Gly173), 176. sıradaki Glisin (Gly176), 267. sıradaki Arjinin (Arg267), 287. sıradaki Glütamin (Gln287) ve 310. sıradaki Histidin (His310) amino asitleridir. FDH enzimi endüstride oldukça yaygın kullanım alanına sahiptir. Bunların başında kiral moleküllerin sentezi gelir. Nikotinamid adenin dinükleotid kullanımından doğan yüksek maliyeti azaltabilmek amacıyla bu tür üretimlerde FDH enzimi NADH indirgeni olarak kullanılır. Diğer bir kullanım alanı ise format biyosensörleridir. Format biyosensorlerinde, format iyonunun varlığını eser miktarda da olsa tanımlayabildiği için, sensör uygulamalarında oldukça yaygın olarak kullanılır. Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) yaklaşık olarak 300’den fazla dehidrogenaz enzimi tarafından kofaktör olarak kullanılan ve elektrokatalitik yükseltgenmesi sonucu katı yüzey üzerinde yüksek bir potansiyel fark meydana getiren bir moleküldür. Bu enzimlerin farklı substratlar varlığında NADH’a olan özgüllüklerinin arttırılması ve redoks kabiliyetlerinin yükseltilmesi üzerine uygulanan analitik yaklaşımlar ve çalışmalar literatürde mevcuttur. Enzimlerin endüstriyel alanda tekrar tekrar kullanılabilmesi, dayanıklılığının artırılması amacıyla günümüze kadar çeşitli tutuklama yöntemleri geliştirilmiştir. Literatürde birçok farklı tutuklama metodu mevcuttur. Bunların arasında elektriksel etkileşim aracılığı ile fiziksel tutuklama ve kovalent bağ oluşturup kimyasal olarak bağlama yöntemleri en geniş yeri kaplar. Özellikle kovalent bağ oluşturup kimyasal olarak bağlama yöntemi için literatürde onlarca farklı yaklaşım mevcuttur. Bunların arasında ilk olarak akla gelenler, amin, tiyol, karboksil reaksiyonlarıdır. Son zamanlarda ise bu söz konusu geleneksel tutuklama yöntemleri sebep olduğu çeşitli sorunlar nedeniyle yerlerini daha modern metotlara bırakmışlardır. Elektriksel etkileşim ile fiziksel tutuklama metodunda bağın zayıflığından doğan akma problemleri ve kovalent bağ ile tutuklama metodunda sıklıkla görülen enzimin kinetik aktivitesindeki azalma bu problemlere başlıca örneklerdir. Tutuklama için kullanılabilecek bir diğer yol ise biyomoleküllerin birbirine olan ilgisine dayalı histidin kuyruğu ve biyotin-avidin etkileşimi yöntemleridir. Fakat bu yöntemler de birtakım sorunlar içermektedirler. Gen mühendisliği yöntemiyle geliştirilmiş olan (GEPI) peptitler farklı inorganik yüzeylere özgün olarak bağlanabilme kapasitesine sahiptir. Bu dizilerin inorganik malzemelere olan seçici ve yüksek ilgisi enzim tutuklama teknolojisinde geleneksel metodlara iyi bir alternatif olacağı düşünülmüştür. Bu amaçla FDH enziminin amino ucuna altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenmiş ve birlikte füzyon halinde üretilmesi sağlanmıştır. Peptitin boyunun uzun olması sebebiyle eklenmesi beş farklı primer ve iki farklı PCR reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Sonrasında peptit-enzim füzyonlarının E. coli bakteriyel ekspresyon sisteminde, güçlü bir promotor altında IPTG indüklenmesi vasıtasıyla üretilmeleri sağlanmıstır. Enzimin içerdiği Histidin amino asitlerinden oluşan kuyruğun Nikel Nitrilotriasetik asit molekülüne (Ni-NTA) olan ilgisi kullanılarak saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan proteinler sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile görüntülenmiş ve yeterli saflıkta elde edildiklerini belirlenmiştir. Saflaştırma aracı olarak kullanılan enzimin amino ucunda yer alan altı adet Histidin amino asidi altına özgül olmayan şekilde bağlanma kapasitesine sahip olduklarından dolayı PreScission Proteaz enzimi vasıtası ile uzaklaştırılmıştır. Histidin kuyruğu denilen bu bölge saflaştırılmış enzimlerden uzaklaştırıldıktan sonra aktivite tayinleri literatürde varolan yöntemler uygulanarak yapılmıştır. Bu amaçla, format iyonunun substrat olarak kullanıldığı ve NAD+ kofaktörü aracılığı ile gerçekleşen reaksiyon koşulları literatürde belirtilen koşullarda hazırlanmış ve değişen format iyonu konsantrasyonunda oluşan NADH molekülü tayini 340 nanometre dalga boyunda UV-spektrofotometresi kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar ışığında, amino ucuna altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenen NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin kinetik aktivite değerlerinde altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenmemiş NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimine oranla herhangi bir azalma olmadığı gözlemlenmiştir. Sonrasında yüzey plasmon rezonans spektroskopisi (SPR) yöntemiyle oluşturduğumuz füzyon proteininin altın kaplı SPR yüzeylerinde tutuklama kapasitesi ölçülmüş ve AuBP2 eklenmemiş NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi ile karşılaştırılmıştır. Bu sonuçlar ışığında da amino ucuna altın yüzeylerine özgün bağlanan peptit dizisi (AuBP2) eklenen NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enziminin, AuBP2 eklenmemiş NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimine oranla altın yüzeye 12 kat daha güçlü bağlandığı tayin edilmiştir. Sonuç olarak tüm bu veriler ışığında AuBP2 peptidinin enzim aktivitesinde herhangi bir azalmaya yol açmadığı buna karşılık enzime altın yüzeye özgün şekilde bağlanabilme yeteneği kazandırdığı gösterilmiş ve bu amaçla enzimlere eklenebilecek ideal bir molekül olduğu ispatlanmıştır.

NAD+-dependent formate dehydrogenases (EC 1.2.1.2, FDH) belonging to superfamily of D-specific 2-hydroxy acid dehydrogenases plays an important role in the energy supply mechanisms of methylotrophic microorganisms. FDHs mainly catalyze the oxidation of formate ion to CO2 where the reaction coupled with the reduction of NAD+ to NADH. As a result, a single C-H bond in the substrate breaks down and a new C-H bond in the NADH forms. NAD+-dependent FDHs are versatile biocatalysts in the enzymatic synthesis of valuable optically active chiral compounds in the industry. However, the yield of the reaction is too low due to the laborious purification steps. Moreover, chemical immobilization methods cause a sharp decrease in the activity of enzyme. Controlled binding and assembly of proteins onto inorganic substrates are at the core of bio-nanotechnology. Genetically engineered peptides for inorganics (GEPI) provide molecular linkage between the proteins and inorganic surfaces. GEPI-mediated immobilization techniques do not have such drawbacks that chemical immobilization methods have like random orientation of proteins on solid surfaces and multi-step chemical reactions requirements. Moreover, GEPIs have certain benefits like ability to work in physiological conditions and enhanced functional durability. The aim of this study is to construct fusion protein by attaching the biocombinatorially selected Gold Binding Peptide (AuBP2) to the N-terminal of Candida methylica FDH enzyme (cmFDH) and characterize the multifunctional properties, and finally demonstrate the effects of AuBP2 conjugation on binding and kinetic properties of FDH enzyme on both soluble and immobilized forms on the gold surface. With this purpose, AuBP2-FDH fusion enzyme has successfully cloned and expressed. Purification of both fusion and wild type enzymes performed. Then, kinetic and binding characteristics were calculated. Data showed that AuBP2 addition to the enzyme did not make a significant change in the kinetic parameters of the FDH enzyme but cause 12-fold increase in adsorption behavior of enzyme on gold surface, which demonstrates that gold specific AuBP2 peptide, is an ideal linker molecule for FDH immobilization on gold surface.