Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

Gözat

Son Başvurular

Şimdi gösteriliyor 1 - 5 / 45
  • Öge
    Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2020) Sürmeli, Yusuf ; Çakar, Zeynep Petek ; 625499 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
    Caffeine, a natural purine alkaloid, is highly consumed worldwide as an ingredient of some beverages like coffee, tea and soft drinks. Although there are many reports on caffeine effects in many organisms like yeast, pleiotropic effects of caffeine, and molecular mechanisms of caffeine resistance and response are largely unknown.In this study, highly caffeine-resistant Saccharomyces cerevisiae mutants were obtained for the first time by evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering strategy, based on batch selection under gradually increasing caffeine stress, with and without applying any mutagen to the initial population before selection. The selection process was initiated at 7.5 mM caffeine concentration, and continued until 50 mM, for 48 populations. Genetically stable, caffeine-resistant mutant strains were isolated from the final populations of the selection, where they resisted as high as 50 mM caffeine, a concentration that has not been documented for S. cerevisiae so far. Among those mutants, three strains Caf905-2, Caf906-11, and Caf906-12) had the highest caffeine resistance, and they were also cross-resistant to a variety of stress conditions like coniferyl aldehyde, antimycin A, and rapamycin. One of the caffeine-hyperresistant strains (Caf905-2) was characterized at physiological, transcriptomic and genomic levels. Caf905-2 did not have a reduction of growth under 10 mM caffeine stress, where its maximum specific growth rate (µmax) was nearly three-fold of that of the reference strain. Expectedly, Caf905-2 entered the stationary phase at 12 h, but the reference strain at 30 h. Biomass levels of the two strains showed an increase under 10 mM caffeine stress, compared to the absence of caffeine. Also, ethanol yield decreased in the reference strain under 10 mM caffeine stress, but not in Caf905-2. Similarly, glycerol yield decreased in Caf905-2 under caffeine stress, but not in the reference strain. The reference strain also accumulated more intracellular trehalose than Caf905-2, particularly under caffeine stress condition. The resistance of Caf905-2 against lyticase, a β-1,3-glucan-degrading enzyme, was higher than that of the reference strain, under both caffeine stress and nonstress conditions. DNA microarray analysis identified a total of 745 overexpressed and 741 repressed genes with statistically changes of gene expression levels (corrected p < 0.05) encompassing at least 2-fold alteration in Caf905-2. Functional categorization of transcriptomic analysis results of Caf905-2 suggested that the genes implicated in energy and protein fate pathways, oxygen and radical detoxification, and drug/toxin transport associated with pleiotropic drug resistance were stimulated, whereas the genes implicated in transcription, protein synthesis, cellular transport pathways, and nucleotide metabolism were repressed in the nonstress condition. Whole genome re-sequencing analysis results unearthed only three single nucleotide variations, distributed in three different genes; PDR1, PDR5, and RIM8 in Caf905-2, relative to the reference strain. The exact roles of these genes in caffeine response and resistance in yeast should be investigated in detail in future studies.
  • Öge
    Design of a bioactive scaffold system for hard tissue engineering
    (Institute of Science and Technology, 2013) Güngör Özkerim, Perihan Selcan ; Kök, Fatma Neşe ; 349784 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology Programme
    Nanofibrous double-layer matrices were prepared by electrospinning technique with the bottom layer formed from PCL (poly--caprolactone) / PLLA (poly-l-lactic acid) blend nanofibers and the upper layer from PCL/Gelatin blend nanofibers. Gelatin microspheres were incorporated physically in the middle of these two layers for controlled growth factor delivery. This sandwich system prevented microsphere leakage from the scaffold. Bead-free nanofibers with uniform morphology could be obtained by 10% w/v concentrations of PCL/PLLA and PCL/Gelatin solutions. Microspheres prepared by 500-rpm stirring rate and cross-linked with 7.5% glutaraldehyde solution were chosen after in vitro release studies. The optimized conditions were used to prepare fibroblast growth factor-2 (FGF-2) loaded microspheres. Cell culture studies with FGF-2 loaded microspheres showed that the growth factor could be actively loaded into the system and enhanced the cell attachment and proliferation. To test the effect of gelatin on cell adhesion, cell culture was performed with PCL/PLLA matrices with or without PCL/Gelatin layer. Cell attachment was significantly higher when PLLA replaced by gelatin. To investigate cell differentiation on the designed scaffold system adipose tissue derived stem cells (ADMSCs) were used and microspheres within the scaffolds were loaded with bone morphogenic protein2 (BMP-2). The effect of scaffolding on differentiation of ADMSCs towards osteogenic lineage was evaluated by various markers. According to the results, all experimental samples were biocompatible and supported the proliferation and differentiation of ADMSCs.
  • Öge
    Evolutionary engineering and molecular characterization of freeze-thaw resistant saccharomyces cerevisiae
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013) Yılmaz, Ülkü ; Çakar, Zeynep Petek ; 352299 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji
    Saccharomyces cerevisiae içki ve fırıncılık endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılan endüstriyel bir mikroorganizmadır. İyi karakterize edilmiş bir mikroorganizmadır ve aynı zamanda temel ve biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir. Endüstriyel uygulamalarda, donma-erime stresi özellikle donmuş hamur prosesinde genel bir stres çeşididir. S. cerevisiae? de donma-erime stres uygulamaları, hücrelerin donma-erime stresinin ölümcül etkileri ile başa çıkabilmeleri için çok yönlü çapraz-direnç mekanizmasını uyarır. Çok yönlü stres direnci ve donma-erime toleransı elde etmek için ekstra genetik mekanizmaların donma-erime stresi varlığında uyarıldığı ve aktif oldukları düşünülmektedir. S. cerevisiae? de donma-erime stresi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır, fakat donma-erime toleransının arkasında yer alan moleküler mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Evrimsel mühendislik, donma-erime stresine direnç gibi, özel ve istenilen fenotiplerdeki mutant suşların elde edilmesinde kullanılan ?doğal? bir prosestir. Genel olarak, evrimsel mühendislik dört ana basamaktan oluşmaktadır. Bu aşamalar; genetik olarak karışık hücre populasyonunun kimyasal/fiziksel mutasyon ile elde edilmesi, istenilen özellikteki geliştirilmiş suşun elde edilmesi için tekrarlayan sikluslarda seleksiyon baskısının uygulanması, elde edilen suşun performansının analizi ve bir sonraki hedefin dizaynı. Sonuç olarak, endüstriyel uygulamalarda, yüksek derecede donma-erime stresine dirençli, mayanın kendi genomu dışında yabancı herhangibir gen içermeyen, geliştirilmiş ekmek maya hücrelerinin kullanımı, daha güvenli ve kabul edilebilirdir. Böylece, bu yöntem, donma-erime stres direnci ile sonuçlanan yüksek derecede regüle edilmiş genomu ile ekmek mayasının endüstride kullanımının güvenli bir yoludur.
  • Öge
    Genome-wide analysis of Yvfi gene in bacillus subtilis
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) İrigül sönmez, Öykü ; Yazgan Karataş, Ayten ; 315332 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji
    Transkripsiyonel düzenleyici proteinleriden GntR ailesi yaygın olarak kanatlı sarmal-dönüş-sarmal motifi ile karakterize edilmişlerdir. GntR ailesine mensup, FadR alt grubunun üyesi olan proteinler aminoasit metabolizmasının regülasyonuyla ve aspartat, pirüvat, glikolat gibi metabolik yol izleriyle ilişkilidir. Bu çalışmanın da hedef aldığı, basilisin üretiminde gerekli olduğu da ortaya konmuş olan B. subtilis yvfI geninin GntR ailesi transkripsiyonel düzenleyici proteinleriyle benzerlik gösterdiği bilinmektedir. Bu sunulan çalışmada, YvfI transkripsiyonel faktörü tarafından etkilenmesi mümkün genleri tanımlayabilmek için YvfI kodlayamayan TEK1 mutantı ve kontrol suşu PY79 arasında, logaritmik faz sırasında ve durağan fazda detaylı karşılaştırmalı transkriptom analizi gerçekleştirilmiştir. Büyümenin durağan evresinde YvfI proteini tarafından düzenlenmiş bir çok yolizi tanımlanmasının keşfi sağlanmıştır. Ek olarak, logaritmik fazda YvfI proteinin birçok önemli metabolik prosesde görevli genleri düzenlemede rol aldığı gösterilmiştir. Bunların yanı sıra, karşılaştırmalı transkriptom çalışmaları IPTG ile indüklenen B. subtilis PY79 amyE::Pspac::yvfI, yvfI::Tn10 mutant suşu ve aynı suşun indüklenmeyen hali arasında yürütülmüştür. Bu çalışma YvfI'nın olağandan fazla düzeyde ifade edilmiş olmasının farklı elementlerin ve metabolizmaların uyarılmasına ya da baskılanmasına sebebiyet verdiği ortaya konmuştur. Ayrıca, bu araştırma 5'-RACE-PCR analizi ile yvfI geninin promotör bölgesinin tanımlanması ve yerinin saptanmasını amaçlanmaştır. Sonuç olarak yvfI transkripsiyonunun ? A-tipi promotör tarafından kontrol edildiği, yvfI gen dizisi ve promotör bölgesi üzerinde global düzenleyici proteinlerin bağlanma motifleri olduğu gösterilerek, bu genin quorum-sensing yol izi üzerinden düzenlendiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, YvfI'nın muhtelif düzenleyici davranışları YvfI'nın, bir çok değişik tipte regulona baskı ve indüksiyon uygulayarak düzenleyici aktivite gösteren GntR ailesine ait olduğu önerisi ile uyum göstermektedir.
  • Öge
    Evolutionary engineering and molecular characterization of ethanol-resistant Saccharomyces cerevisiae
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) Turanlı Yıldız, Burcu ; Çakar, Z. Petek ; 323823 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology
    Saccharomyces cerevisiae'de etanol direnci, etanol üretimini etkileyen en önemli faktörlerden biri olduğu için, endüstriyel etanol üretim biyoprosesleri konusunda çalışan pek çok araştırma grubu için önemli bir konudur. Etanol direncinin moleküler mekanizması karmaşık olduğundan, bir veya birkaç gen üzerinde yapılacak değişikliklere dayalı rasyonel metabolizma mühendisliği yaklaşımı ile bu mekanizmanın aydınlatılması mümkün görünmemektedir. Bu çalışmada, etanole dirençli S. cerevisiae mutantlarının elde edilmesi ve karakterizasyonu için, bir tersine metabolizma mühendisliği stratejisi olan evrimsel mühendislik yöntemi benimsenmiştir. Yüksek etanol direncine sahip mutant bireyler, dereceli olarak artan etanol stres koşulları altında elde edilmiştir. Sonuçlar, benimsenen stratejinin istenilen özellikte kültürler elde etmede oldukça etkili bir yöntem olduğunu göstermiştir. Elde edilen dirençli mayaların karakterizasyonu da gerçekleştirilmiştir. Etanol stresi altında etanole dirençli mayalarda eşey tipi dönüşümü ve buna bağlı diploitleşmenin meydana gelişi, endüstriyel maya suşlarında olduğu gibi, etanole dirençli laboratuvar suşlarında da birden fazla kromozom kopyası bulundurma (multi-ploidy) eğilimini ortaya koymuştur. Bu çalışma, dereceli olarak artan etanol stresi koşullarına cevaben, S. cerevisiae hücrelerinde eşey tipi dönüşümünün tetiklendiğini ortaya koyan öncü bir çalışmadır.