Molecular characterization of silver-resistant Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In molecular biology and metabolic engineering, one of the most widely used organisms is the yeast Saccharomyces cerevisiae that has been involved in biological applications for thousands of years among different cultures in different parts of the world. As a eukaryotic organism, S. cerevisiae reproduces by budding or sporulation, as a consequence of being able to have genetically haploid and diploid forms. It has a high level of similarity with human cells in regard of proteins and their functions, which leads to the popularity of this budding yeast in a wide range of researches related to humans. Yeast can resist many types of stress factors in the environment at various levels. Metal stress is one of these stresses that yeast may show resistance against, but the mechanism of metal stress tolerance in yeast has not been fully enlightened yet. When these metal resistance pathways are revealed, it will be also possible to increase resistance, which leads to an improved productivity in metal recovery in industrial applications for biotechnological processes and in bioremediation of metal-polluted environments. Silver stress resistance in yeast was studied in this thesis and after obtaining a silver-resistant S. cerevisiae mutant by using evolutionary engineering methods, the mutant was subjected to genetic and physiological characterization by comparison with the reference strain. Ethyl methanesulfonate (EMS) treated S. cerevisiae was the initial culture in this study, and this chemical mutagenesis caused a wide range of random mutations in the genome of the yeast cells in the population. To select a target mutant with the character of silver-resistance in the population, evolutionary engineering method was applied. To determine the initial level of silver stress for the evolutionary selection, this culture and the reference strain were both cultivated at different silver concentrations. The survival rates calculated at different silver concentrations demonstrated the most appropriate initial silver concentration with the minimum effect of silver stress on the cells. Next populations were subjected to higher concentrations of silver than the previous ones, until a significant decrease in the survival rate. While 5 µM AgNO3 was the initial stress level for the first population of the selection, the 29th population was exposed to 250 µM AgNO3. Ten individual mutants were randomly chosen from the final population, based on their high resistance to silver stress. Among these mutants, the most resistant one, called as 2E, was tested for genetic stability that revealed a genetically stable trait. The silver-resistant mutant 2E and the reference strain were subjected to cross-resistance tests against other stresses, using spot assay. Spot assay results showed that 2E was also highly resistant to copper stress and had a significant resistance against cobalt and oxidative (H2O2) stresses. On the other hand, it was observed that 2E was sensitive against chromium, manganese, aluminum, and ethanol stress. Reference strain and the silver-resistant mutant 2E showed similar stress responses against nickel, zinc, and lithium stresses. Transcriptomic analysis for the whole genome of the silver-resistant mutant 2E and the reference strain was applied to investigate the mechanism of silver resistance in the cell. DNA microarray analysis revealed that while 780 genes were upregulated, 877 genes were downregulated. Totally 1657 open reading frames (ORFs) had differential expression between 2E and the reference strain. By using Gene Ontology analysis, it was indicated that in the silver-resistant mutant, the highly upregulated genes were related to carbohydrate metabolic process, precursor metabolite generation, energy generation, oxidation-reduction, oxidative stress, and extracellular stimulus response. On the other hand, mutant 2E seemed to have generally repressed its protein synthesis by downregulation of the genes involved in ribosome biogenesis, ribosomal subunit and RNA metabolic processes. When compared to the reference strain, there were 64 mutations in the silver resistant mutant 2E, based on the results of whole genome re-sequencing. These mutations were composed of 61 nonsynonymous and 3 stop-loss ones. The most relevant mutation in 2E that may have caused an improvement in silver resistance was the one on CCC1 gene, a transporter of Fe2+/Mn2+ in vacuole, since silver has similar atomic properties with copper. This study also implied that the resistance of 2E against silver might be by upregulating copper resistance genes, CTR3, CUP2, CUP1-1, and CUP1-2, that bind copper and are responsible for copper-homeostasis in the yeast cell. Silver causes oxidative stress in cell and the mutant 2E had oxidative stress resistance. This study showed that a number of oxidative stress responsive genes were oppositely expressed in the mutant 2E and the reference strain that showed no resistance against neither silver nor oxidative stress. Oxidative stress resistance of 2E was also supported by the missense mutation detected on the DNA helicase gene PIF1. In addition to this, 2E had a highly differentiated mitochondrial gene expression profile that led to a more active aerobic metabolism and electron transfer system, which may explain the better growth of the mutant 2E under silver stress condition. The membrane-bound transport and cell wall proteins are damaged when subjected to silver ions and nanoparticles during growth phase, that leads to disruption in cell wall and membrane integrity. However, while 2E upregulated some of the mannoprotein genes (such as YPK2, USV1, YPS6, SRL1) to keep its cell wall integrity, it downregulated the ones related to anaerobic growth (TIP1 and TIR1-4 genes). Additionally, some ergosterol synthesis genes and many of the sugar transporter genes along with some TCA cycle genes for NADH regeneration were significantly upregulated. All these findings indicated a strong aerobic metabolism in the evolved strain 2E, but a more robust cell wall was most likely provided by the upregulation of other cell wall-associated genes and the observed mutations in some cell wall-associated genes, particularly RLM1, a gene that encodes a transcription factor responsible for the activation of the MPK1 mitogen-activated protein kinase pathway, and the maintenance of cell wall integrity. Some of the missense mutations of 2E were found in vesicle protein sorting and vacuole biogenesis (VPS45, PEP5), and endocytosis (ENT1, YAP1802, MYO5, AKR2) genes. Also AAC1 that encodes a vesicular transport protein was upregulated in 2E. As a result, the silver-resistant evolved strain 2E kept higher levels of silver in/on itself, compared to the reference strain, according to Flame Atomic Absorption Spectrometry (F-AAS) analysis results, that possibly made a significant contribution to its silver resistance. This study was about selecting and characterizing a silver-resistant mutant of S.cerevisiae at a molecular level. The possible reasons for the silver resistance in yeast cell were discussed, regarding molecular and functional factors. Some potentially important genes and pathways for the silver resistance mechanism have been identified in this study, which have been discussed, based on the previous studies found in the literature about silver response. Despite these major findings, further investigations are still needed to fully enlighten the complex molecular mechanisms of silver resistance, regarding copper resistance, oxidative stress, cell wall integrity, aerobic metabolism and vesicular transport.

Dünyanın farklı bölgelerindeki farklı kültürlerde binlerce yıldır biyolojik uygulamalarda kullanılan Saccharomyces cerevisiae mayası, günümüzde de moleküler biyoloji ve metabolik mühendislik alanlarında en çok kullanılan organizmalardan birisidir. Ökaryotik bir organizma olan S. cerevisiae, genetik olarak haploid ve diploid formlarda bulunabilmesinin bir sonucu olarak tomurcuklanarak (eşeysiz) veya spor oluşturarak (mayoz bölünme) üreyebilir. Protein yapıları ve fonksiyonları açısından insan hücreleri ile önemli ölçüde benzerlikler gösterdiği için, insan ile ilgili farklı araştırmalarda da bu maya türü, bir model organizma olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Maya hücreleri, ortamlarında bulunan birçok stres faktörüne karşı, farklı seviyelerde direnç gösterebilir. Maya hücrelerinin direnç gösterebildiği bu stres faktörlerinden biri de metal stresidir; fakat mayaların metal stresine karşı gösterebildikleri direncin moleküler mekanizmaları henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu metal direnç yolizleri ortaya çıkarılabildiğinde, sahip olunan direncin arttırılması sağlanabilecek, böylece endüstriyel uygulamalarda metallerin biyolojik proseslerle geri kazanımında ve metal kirliliğinin görüldüğü çevrelerde, biyoıslah çalışmalarında üretkenlik yükseltilebilecektir. Bu çalışmada, maya hücrelerindeki gümüş direnci incelenmiştir ve evrimsel mühendislik metodu ile gümüşe dirençli S.cerevisiae mutantı elde edildikten sonra, referans maya suşu ile karşılaştırmalı olarak bu mutantın genetik ve fizyolojik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan başlangıç kültürü, etil metansülfonat uygulanmış, dolayısıyla rastgele mutasyonlar ile genetik çeşitliliği artırılmış bir S. cerevisiae maya popülasyonudur. Bu popülasyon içinde gümüş stresine direnç özelliği gösteren hedef mutant, evrimsel mühendislik metodu uygulanarak seçilmiştir. Seleksiyonda uygulanacak başlangıç gümüş stres direnç düzeyinin tespiti için bu kültür ve referans S.cerevisiae suşu, farklı gümüş konsantrasyonları varlığında üretilerek hayatta kalma oranları belirlenmiştir. Buna göre, gümüş stresinin hücreler üzerinde minimum etki ettiği en uygun gümüş konsantrasyonu, başlangıç gümüş stress değeri olarak belirlenmiştir. Birbirini takip eden iki popülasyon arasında, hayatta kalma oranları ciddi düzeyde düşene kadar, besiyerindeki gümüş konsantrasyonu kademeli olarak artırılmıştır. İlk popülasyon için gümüş stresi seviyesi 5 µM AgNO3 iken, en son 29. popülasyon için 250 µM AgNO3 kullanılmıştır. Bu son popülasyon içerisinden, gümüş stresi varlığında daha hızlı gelişme gösteren 10 farklı mutant birey seri seyreltme ve katı besiyerine ekilerek rastgele olarak seçilmiş ve bunlar arasından gümüş stresine en dirençli olan mutant birey 2E olarak adlandırılmıştır. 2E bireyine uygulanan genetik kararlılık testi de olumlu sonuç vermiştir. Gümüşe dirençli suş 2E ile referans suşu için, fizyolojik özelliklerinin belirlenebilmesi amacıyla çapraz stres direnç testleri yapılmıştır. Bu testler, 2E'nin, referans suşa kıyasla, gümüş ile birlikte bakır stresine karşı da yüksek bir dirence, kobalt ve oksidatif (H2O2) strese karşı da anlamlı düzeyde dirence sahip olduğunu göstermiştir. Fakat aynı testler sonucunda 2E'nin, kroma, manganeze, alüminyuma ve etanole karşı hassasiyeti olduğu ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, referans suş ve gümüş stresine dirençli suş 2E; nikel, çinko ve lityum stres direnci açısından anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Mutant maya bireyindeki gümüş stresine direncin moleküler mekanizmasının incelenmesi için, gümüşe dirençli suş 2E'nin ve referans suşun tüm genomunu kapsayan transkriptomik analizler gerçekleştirilmiştir. Bu doğrultuda yapılan DNA mikrodizin analizleri, 2E ile referans suş arasında toplam 1657 genin ekspresyonunda farklılık olduğunu göstermiştir. Bunlardan 780 genin ekspresyon düzeyi artarken, 877 geninki ise azalmıştır. Gümüşe dirençli suş 2E; özellikle karbonhidrat metabolizması, metabolit üretimi, enerji üretimi, oksidasyon-redüksiyon ve oksidatif stres süreçlerinde yer alan genleri çok yüksek oranda eksprese ederken, ribozom biyogenezi, ribozoma ait altbirimler ve RNA metabolik süreçlerinde yer alan genlerin ekspresyonunu ise düşürerek protein sentezini baskılamıştır. Referans suş ile karşılaştırıldığında, tüm genomun yeniden dizilenmesi sonuçlarına göre, gümüşe dirençli suş 2E'nin, 64 mutasyona sahip olduğu görülmüştür. Bu mutasyonların 61 tanesi nokta mutasyon iken, 3 tanesi durdurucu mutasyondur. Bu mutasyonlar arasında, 2E'nin gümüş direnci geliştirmesiyle muhtemelen en ilişkili olanı, vakuol içinde Fe2+/Mn2+ taşınımı ile ilgili gen olan CCC1 üzerindekidir, çünkü bu gen bakır direnciyle doğrudan ilişkilidir ve gümüş, bakır ile benzer atom özelliklerine sahiptir. Bu çalışma ayrıca 2E'nin, maya hücrelerinde bakır bağlayan ve bakır homeostaz sürecinden sorumlu CTR3, CUP2, CUP1-1 ve CUP1-2 bakır direnç genlerini çok daha fazla eksprese ederek gümüşe karşı direnç kazanmış olabileceğini göstermektedir. Gümüş, hücre içerisinde oksidatif strese sebep olur ve bu çalışmada, mutant 2E'nin oksidatif strese karşı da direnci olduğu görülmüştür. Referans maya suşu, gümüş stresine ve oksidatif strese karşı bir direnç gösteremezken, mutant 2E, referans suşun, oksidatif strese cevap genekspresyonuna neredeyse zıt olacak şekilde ekspresyon göstermiştir. 2E'nin oksidatif stres direnci, aynı zamanda DNA helikaz geni PIF1'deki nokta mutasyonu ile de desteklenmiştir. Ayrıca, 2E'nin referans suşa kıyasla oldukça farklı bir mitokondrial gen ekspresyon profiline sahip olması, onun muhtemelen daha aktif bir aerobik metabolizmaya ve elektron transfer sistemine sahip olmasını sağlamıştır. Böylece mutant 2E, gümüş stresi şartlarında daha iyi gelişebilmiştir. Maya hücrelerinin gelişme fazında gümüş iyonlarına ve nanopartiküllerine maruz kalması durumunda, membran taşınım ve hücre duvarı proteinleri zarar görür. Bu durum hücre duvarında ve membran bütünlüğünde bozulmalara sebep olur. Ama 2E, hücre duvarının bütünlüğünü koruyabilmek için bazı mannoproteinlerin gen ekspresyonunu arttırırken (YPK2, USV1, YPS6, SRL1 gibi), anaerobik büyümeyle ilgili genlerin ise ekspresyonunu azaltmıştır (TIP1 and TIR1-4 gibi). Ayrıca, bazı ergosterol sentez genlerinin, NADH rejenerasyonu için gereken bazı Krebs döngüsü genlerinin ve birçok şeker taşınım genlerinin ekspresyonunun da arttığı tespit edilmiştir. Tüm bu bulgular, 2E suşunda güçlü bir aerobik metabolizmanın var olduğuna işaret etmektedir. 2E'nin, muhtemelen daha sağlam bir hücre duvarını sağlayabilmek için hücre duvarıyla ilişkili diğer genlerin ekspresyonunu arttırdığı da gözlenmiştir. Ayrıca, bazı hücre duvarı bağlantılı genlerdeki ve özellikle, MPK1 protein kinaz yolizinin aktivasyonundan ve hücre duvarı bütünlüğünün korunmasından sorumlu bir transkripsiyon faktörü olan RLM1 genindeki mutasyonların, bu sağlamlığa katkı sağladığı tahmin edilmektedir. 2E'deki bazı nokta mutasyonlar vesikül protein etiketleme ve vakuol biyogenez (VPS45, PEP5) ve endositoz (ENT1, YAP1802, MYO5, AKR2) genlerinde yer almaktadır. Buna ilave olarak 2E, bir vesikül taşınım proteinini kodlayan AAC1'in ekspresyonunu arttırmıştır. Böylece, Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometri analizlerine göre, referans suş ile karşılaştırıldığında 2E suşu, hücre içinde ve hücre duvarı üzerinde yüksek miktarda gümüş iyonunu tutabilmektedir. Bu tez çalışmasının amacı gümüş stresine dirençli bir S. cerevisiae maya mutantı elde ederek bu suşun moleküler karakterizasyonunu yapabilmektir. Tez çalışması kapsamında evrimsel mühendislik yaklaşımıyla elde edilen dirençli şuşun sahip olduğu gümüş direncinin, olası moleküler ve fizyolojik nedenleri tartışılmıştır. Gümüş direncinin olası moleküler mekanizmaları hakkında kritik bilgiler edinilmekle birlikte, bu mekanizmaların tam olarak aydınlatılabilmesi için daha kapsamlı araştırmalar gerekmektedir. Fakat, daha önceki bazı çalışmalarda gümüş direnci ile ilişkisi tespit edilmiş olan bazı genlerin, 2E'nin gümüş stresine direnç kazanmasında da muhtemelen görev aldığı görülmüştür. Ayrıca bu çalışmada, yakın zamanda, gümüş direnci ile ilişkisi olabileceği liteartürde belirtilmiş olan bazı genlerle ilgili teorileri destekleyici bazı sonuçlar da elde edilmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması kapsamında elde edilmiş olan, mayada gümüş stresine direnç ile ilgili tüm önemli bulgulara rağmen, gümüş direncinin karmaşık moleküler mekanizmasının aydınlatılabilmesi için bakır direnci, oksidatif stress, hücre duvarı bütünlüğü, aerobik metabolizma ve vesiküler taşınım mekanizmaları odaklı daha ileri araştırmalar gerekmektedir.