FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Gözat
Konu "afinite peptid etiket" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeMalzeme Ve Medikal Uygulamalar İçin Gen Mühendisliği Yoluyla Peptid (gepı)-protein Hibritlerin Oluşturulması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012-03-26) Şahin, Deniz ; Tamerler, Candan ; 426838 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsDoğada, milyonlarca yıl süren evrimsel süreçler sonucunda, lipidler, polisakkaritler ya da proteinler gibi biyomakromoleküller yüksek seviyede sofistike olmuş sistemlerin oluşmasını sağlamıştır. Oluşan bu sistemlerle canlılar, zorlu çevre şartlarına daha iyi uyum sağlamanın yollarını keşfetmişlerdir. Bu biyomakromoleküller arasında proteinler özel bir öneme sahiptir. Proteinler diğer makromoleküller ve inorganikler ile tepkimeye girerek tüm sert ve yumuşak dokuların yapısında bulunurlar ve tüm fonksiyonların çalışmasında etkili olurlar. Kemikler, dişler, deniz kabukları ve iskeletler, proteinlerin diğer organik ve inorganik moleküllerle birlikte çalıştıkları örneklerdir. Bu yapılarda yer alan proteinler sadece organik moleküllerle değil, aynı zamanda inorganik moleküllerle de bağ yaparak değişik fonksiyonel özelliklerin kazanılmasını sağlarlar. Örneğin, magnetotaktik bakteride (Aquaspirillum magnetotacticum) hücre içerisinde inorganik nanoyapılar bakterinin yerçekimi yardımı ile hareketini sağlar. Diğer bir örnek olan S-layer bakterisi (Synechococcus strain GL24) yüzeyinde oluşan kalsit tabaka koruyucu bir yapıdadır. Benzer şekilde fare dişindeki enamel, hidroksiapatit kristallerinden oluşan ve dişe hem esneklik hem dayanıklık sağlayan bir yapıdır. Bu örneklerde görülen, nano boyuttan makroya, yüksek derecede organize olmuş yapılar hiyerarşik bir şekilde oluşmuşlar ve inorganik moleküller ile organik moleküller birlikte rol almışlardır. Evrimsel süreçler sonucunda elde edilen bu fonksiyonlar ile canlılar çevresel şartlar karşısında avantaj elde etmişlerdir. Diğer yandan, doğada gözlemlenen bu tür fonksiyonel yapıların endüstride ve teknolojide yeniden yapılması son derece zorlu bir süreçtir. Bu yapılar detaylı incelendiğinde, proteinlerin düzenleyici, kontrol eden, bir araya getiren özellikleriyle bu yapıların oluşmasının temelinde olduğunu görüyoruz. O halde bu tür fonksiyonel özellikleri elde edebilmemiz için, inorganiklere seçici olarak bağlanabilen proteinleri kullanabiliriz. Moleküler Biyomimetik doğada moleküler seviyede gerçekleşen süreçleri izleyerek, benzer sistemleri oluşturmayı ve fonksiyonel sistemler kurmayı amaçlar. Canlıların milyonlarca yıl süren evrimsel süreçlerle elde ettikleri yararlı fonksiyonların gözlenmesi ile benzer fonksiyonel sistemler laboratuvar ortamında elde edilebilir. Moleküler Biyomimetik’in temelini de inorganiklere spesifik olarak bağlanabilen peptidlerin bulunması ve uygulamalarda kullanılması yatar. İnorganiklere spesifik olarak bağlanabilen peptidlerin bulunması için aşamalı bir yol izlenmesi genel kabul görmektedir. Öncelikle, kombinatoryel biyolojik teknikler (faj gösterim, hücre yüzey gösterim metodları vb.) yoluyla istenilen inorganik malzemeye spesifik peptidler bulunur ve bağlanma dereceleri sınıflandırılarak optimize edilir. Devamında ise, deneysel verilerden elde edilen bilgiler ışığında, biyoinformatik yöntemler ve benzerlik analizleri yoluyla daha iyi bağlanabilen peptidler elde edilir ve bu peptidler de test edilerek bağlanabilirliği kontrol edilir. Bu çalışmada kullanılan QBP1 peptidi 12 amino asit uzunluğunda ve kuartza bağlanabildiği deneysel çalışmayla gösterilmiş dizilerin biyoinformatik işlemden geçirilmesi sonucunda ortaya çıkarılmıştır. QBP (Quartz binding peptid), kuartza seçici olarak ve yüksek afinitede bağlanabilen 12 amino asit uzunluğunda bir peptidtir. Kuartz yüzeyine bağlanabilme özelliği sayesinde, istenilen bir protein QBP1 yoluyla kuartz yüzeyinde sabitlenebilir. Ancak bunun için ilk yapılması gereken, DNA seviyesinde QBP1 peptidinin dizisini iatenilen proteinin DNA dizisine eklemektir. Burada QBP1 peptidini AP (alkalin fosfataz) enziminin N-terminal ucuna eklendi. Protein üretilmesi aşamasında ise, bakteri hücresi kullanıldı ve sonuçlar optimize edilmeye çalışıldı. Burada amaçlanan, QBP1 yoluyla istenilen bir proteinin kuartz yüzeyine bağlanabileceğini ve uygulamalar açısından kullanışlı olacağını göstermektir. Ancak dikkat edilmesi gereken en önemli konuların başında, bakteri hücresinde protein üretimi sırasında meydana gelebilecek sıkıntılardır. Projemizde 2. jenerasyon GEPI’ler (Kuartza bağlanabilen peptidler, QBP-1) kullanıldı. Bu peptidler grubumuzda daha önceden faj gösterim metodu ile elde edilen 1. jenerasyon QBP’lerin biyoinformatik yöntemlerle işlenmesi sonucu elde edildi (1). Kuartz yüzey üzerine seçici olarak bağlanmada diğer QBP’ler arasından öne çıkan QBP-1 bu çalışma için seçildi. QBP-1 ile herhangi bir fonksiyonel molekül DNA seviyesinde biraraya getirilerek hibrid moleküller oluşturulabilir ve QBP-1’in kuartz yüzeyine seçici olarak bağlanabilme özelliğinden yararlanılarak istenilen molekülün fonksiyonel özellikleri kullanılabilir. Lakkazlar (EC 1.10.3.2) ligninolitik enzimler olarak molekül başına iki ya da dört bakır atomu tasıyan ve fenolik maddeleri moleküler oksijeni suya indirgeyerek okside edebilme özelligi olan ekstraselüler fenoloksidazlardır. Kagıt ve tekstil sanayiinden gelen endüstriyel atıkların detoksifikasyonu gibi çesitli biyoteknolojik süreçlerde çok önemli uygulamaları bulunan enzimler olup, herbisit ve pestisitlerin temizlenmesi, belli su saflastırma sistemleri için temizleme ajanları ve kozmetik malzemesi olarak da kullanılabilmektedir (2,3,4). Grubumuzda Pycnoporus sanguineus suşundan elde edilen lakkaz geninin Pichia pastoris’te ekspresyonu sağlanmıştır. Projenin bu kısmında ise, QBP1 peptidi (PPPWLPYMPPWS), Pichia pastoris maya hücrelerinden elde edilen lakkaz (lcc1) enziminin N-terminal ucuna yerleştirilerek füzyon protein oluşturuldu. Öncelikle DNA seviyesinde oluşturulan füzyon protein Pichia pastoris hücrelerinde üretildi. Oluşturulan füzyon protein ile lcc1 enziminin aktiviteleri karşılaştırılarak, QBP-1 peptidinin bağlanmış olduğu enzim aktivitesi üzerine etkisi ortaya konuldu. QBP1 peptidi, N-terminale bağlı olduğu halde, enzim aktivitesinde değişikliğe neden olmamaktadır. Bu ise bir “tag” molekülü olarak QBP1 için oldukça avantajlı bir özelliktir. Yapılacak uygulamaya göre, saflaştırma sonrasında tag molekülü, enzim ile bağlı olarak bırakılabilir. Çalışmanın devamında QBP-1 peptidi bir “tag” peptid olarak görev yaptırılarak hücre ortamından füzyon proteinin saflaştırılmasında kullanılmıştır. Hazırlanan kuartz kolonlar ve batch sistem yollarıyla, QBP-1’in kuartz yüzeyine bağlanabilme özelliği kullanılarak füzyon proteini hücre ortamından saflaştırmak mümkün olmuştur. Sonuç olarak burada, Moleküler Biyobenzetim ve biyoinformatik tekniklerinin birlikte kullanılmasıyla, daha ucuz ve basit saflaştırma yöntemleri geliştirme amaçlı yeni TAG moleküllerinin elde edilebileceğini göstermiş oluyoruz. Kuartza seçici olarak bağlanabilen QBP1 peptidi, sahip olduğu özellikler sayesinde, mevcut ticari “tag” (afinite etiketi) sistemleri ile rekabet edebilecek bir tag molekülüdür.