FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

http://hdl.handle.net/11527/182

Gözat

Demir'e Dirençli Saccharomyces Cerevisiae’nin Moleküler Ve Fizyolojik Karakterizasyonu

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017-01-16) Balaban, Berrak Gülçin ; Çakar, Zeynep Petek ; 10135132 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics

Yerkabuğundaki en yaygın dördüncü element olan demir, canlılar için gerekli bir element olmakla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda canlılar üzerinde toksik etki göstermektedir. Demirin en yaygın iki oksidasyon hali (Fe+3 ve Fe+2) arasındaki elektron taşınım potansiyeli, demiri tüm canlılar için önemli kılmaktadır. Demir iyonları oksidatif fosforilasyonda da önemli rol oynar. Demir; bakır, çinko, nikel ve kobalt gibi diğer geçiş metalleri ile benzer fiziksel ve kimyasal özellikler göstermektedir. Geçiş metallerinin iyonları ortak taşınım sistemlerine sahiptir veya bazı yapılarda birbirlerinin yerini alabilir. Bu nedenle, demir direnci ile diğer geçiş metallerine olan direncin ortak özelliklerinin olması beklenebilir. Kalıtsal hemokromatozis ve anemi, demire dayalı temel hastalıklardandır. Demir ile ilgili anahtar proteinlerin mutasyonları sonucunda, bu gibi hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Bu proteinler, demirin taşınması, algılanması, metabolize edilmesi ve kullanımı durumlarında fonksiyon gösterirler. Demir taşınımının aydınlatılması veya demirin ökaryotlarda kullanımı ve önemine dair elde edilen en ufak bir bilgi, bu hastalıkların temelinde yer alan mekanizmalara ışık tutabilir. Saccharomyces cerevisiae mayası, endüstriyel uygulamalarda ve temel bilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir mikroorganizmadır. Temel bilim araştırmalarında kullanılmasının en önemli sebepleri, en basit ökaryotik hücre modeli olması ve genetik modifikasyonunun kolaylıkla yapılabilmesidir. Endüstriyel uygulamalarda tercih edilme sebepleri ise; düşük pH değerlerinde kolaylıkla üreyebilmesi, antibiyotiklere karşı hassasiyetinin olmaması, bakterilere kıyasla toplum sağlığına olumsuz etkilerinin olmaması, yine bakterilere kıyasla daha büyük olduğu için daha kolay hasat edilebilmesi, hücre dışına sentezlenen proteinlerin saflaştırılmasının daha kolay olması ve post-translasyonal modifikasyonları yaparak istenilen konformasyonda proteini sentezleyebilmesidir. Metabolik mühendislik, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak, hücresel aktivitelerin arttırılmasını veya stres toleransı gibi hücresel özelliklerin geliştirilmesini sağlar. Bailey, 1991’de metabolik mühendisliği; hücrenin enzimatik, taşıma ve düzenleyici işlevlerinde rekombinant DNA teknolojisi ile değişiklikler yapılarak hücresel aktivitelerin iyileştirilmesi olarak tanımladı. Bu tanım, bilimsel bir disiplin olarak metabolik mühendisliğin literatürdeki ilk tanımı oldu. Mikrobiyal metabolik mühendislikte genel olarak, özellikleri geliştirilmek istenilen mikrobiyal suşa heterolog genler ve/veya suşun iyileştirilmesi için gerekli olan düzenleyici elementler kazandırılmaktadır. Metabolik mühendislik çalışmaları; belirli bir genetik manipülasyon setinin hangi hücresel işlevde istenilen değişimin elde edilmesinde etkili olduğunun belirlenmesine, uygulanmasına ve geliştirilmesine yardımcı olur. Fakat bu çalışmalarda sıkça karşılaşılan bir kısıtlama ise; bu süreçte, reaksiyona girebilecek potansiyele sahip yeni bileşiklerin ortaya çıkmasıdır. Diğer sıkça rastlanan kısıtlamalar ise; ifade edilen heterolog proteinin proteolize uğramaması, düzgün şekilde katlanması, gerekli bağlanmaların gerçekleşmesi, prostetik grubun eklenmesi, uygun şekilde konumlanması, ilgili mikroorganizmanın gerekli tüm sübstratlara erişimi ve engelleyici bir çevreye maruz kalmaması gibi gereksinimlerdir. Bailey'nin yapmış olduğu ilk metabolik mühendislik tanımı, mikrobiyal stres toleransının iyileştirilmesi gibi çalışmaları kapsamıyor izlenimi vermekteydi. Bu sebeple 1998 yılında Stephanopoulos, eski tanımın "hücresel aktiviteleri" kısmını "ürün oluşumu veya hücresel özellikler" olarak değiştirerek, daha kapsamlı bir metabolik mühendislik tanımı yaptı. Rasyonel metabolik mühendislik, iyileştirilmesi istenilen mikroorganizma hakkında detaylı biyokimyasal, genetik ve regülasyon verisi gerektirdiğinden; bu durum, özellikle hakkında fazla bilgi sahibi olunmayan, ve/veya iyileştirilmesi istenilen özelliklerinin moleküler altyapısı oldukça karmaşık olan mikroorganizmalar için uygulamada ciddi kısıtlamalara neden olabilmektedir. Bu kısıtlamaları aşmak için yine Bailey tarafından 1996'da tanımlanan tersine metabolik mühendislik yaklaşımı ise, rasyonel metabolik mühendisliğin tersten uygulanması niteliğinde olup, iyileştirilmek istenilen mikroorganizma hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmayı gerektirmemesiyle araştırmacılara avantaj sağlamaktadır. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımı, öncelikle heterolog bir organizmada veya ilgili bir model sistemde istenilen fenotipi tanımlamak ya da oluşturmak, ikinci olarak bu istenilen fenotip için gerekli genetik ve çevresel faktörleri tanımlamak veya ortaya çıkarmak ve son olarak da istenilen fenotipi istenilen organizmaya aktararak uygulamayı kapsar. Bu çalışmanın amacı; bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik ile daha önce elde edilmiş olan, demire dirençli Saccharomyces cerevisiae mutant mayasının moleküler ve fizyolojik yönden karakterize edilmesi ve böylelikle demir direncinin karmaşık moleküler altyapısının incelenmesidir. Bu amaçla, demire dirençli suşun diğer stres türlerine (özellikle de diğer geçiş metal iyonlarına) karşı çapraz direnci detaylı olarak belirlenmiştir. Fizyolojik analizler de gerçekleştirilmiş ve demire dirençli mutantın yüksek düzeyde gliserol ürettiği ve yine yüksek düzeyde trehaloz biriktirdiği gözlenmiştir. S. cerevisiae mayasının toksik metal stresi varlığında iki ana direnç mekanizması ile hayatta kalabildiği bilinmektedir: ayırma/uzaklaştırma ve kaçınma. Dirençli suşun temel demir direnç mekanizması hakkında bilgi edinmek amacıyla; Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrofotometri (F-AAS) yöntemi ile, demir stresi varlığında ve yokluğunda mutant suşun ve referans suşun demir içerikleri belirlenmiştir. Sonuçlar, ortamda demir stresi yokken, demire dirençli maya suşunun, referans suşa kıyasla anlamlı ölçüde daha yüksek demir düzeyine sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, demir stresi varlığında, demire dirençli mutant, referans suş kadar yüksek düzeyde demir iyonunu bünyesine almamıştır. Bu bulgular; demir stresi varlığında, demire dirençli mutantın demir iyonlarının hücre içine taşınımından kaçınarak hayatta kalabildiğine işaret etmektedir. Demire dirençli S. cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu için, kantitatif Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ve mikroarray yöntemleri kullanılarak, demir stresi varlığında ve yokluğunda transkriptomik analizler gerçekleştirilmiştir. Mikroarray analiz sonuçları; demire dirençli S. cerevisiae suşunun oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerinin, demir stresi yokluğunda bile, referans suşa kıyasla daha yüksek düzeyde olduğunu göstermiştir. Mikroarray analiz sonuçları doğrultusunda, lipid peroksidasyon testi ve hücre içi reaktif oksijen türü (ROS) düzeyi tespit testi gerçekleştirilmiştir. Demire dirençli suşun hücre içi ROS düzeyinin referans suşa göre daha düşük düzeyde olduğu görülmüştür. Buna göre, demire dirençli suş muhtemelen oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerini yüksek tutarak antioksidan maddeler üretmekte, böylelikle hücre içi ROS düzeylerini düşürmekte ve yüksek düzeyde demir stresi varlığında hayatta kalabilmektedir.
Donma-erime Stresine Dirençli Saccharomyces Cerevisiae’ Nin Evrimsel Mühendisliği Ve Moleküler Karakterizasyonu

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-07-19) Yılmaz, Ülkü ; Çakar, Zeynep Petek ; 10006408 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics

Saccharomyces cerevisiae içki ve fırıncılık endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılan endüstriyel bir mikroorganizmadır. İyi karakterize edilmiş bir mikroorganizmadır ve aynı zamanda temel ve biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir. Endüstriyel uygulamalarda, donma-erime stresi özellikle donmuş hamur prosesinde genel bir stres çeşididir. S. cerevisiae’ de donma-erime stres uygulamaları, hücrelerin donma-erime stresinin ölümcül etkileri ile başa çıkabilmeleri için çok yönlü çapraz-direnç mekanizmasını uyarır. Çok yönlü stres direnci ve donma-erime toleransı elde etmek için ekstra genetik mekanizmaların donma-erime stresi varlığında uyarıldığı ve aktif oldukları düşünülmektedir. S. cerevisiae’ de donma-erime stresi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır, fakat donma-erime toleransının arkasında yer alan moleküler mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Evrimsel mühendislik, donma-erime stresine direnç gibi, özel ve istenilen fenotiplerdeki mutant suşların elde edilmesinde kullanılan “doğal” bir prosestir. Genel olarak, evrimsel mühendislik dört ana basamaktan oluşmaktadır. Bu aşamalar; genetik olarak karışık hücre populasyonunun kimyasal/fiziksel mutasyon ile elde edilmesi, istenilen özellikteki geliştirilmiş suşun elde edilmesi için tekrarlayan sikluslarda seleksiyon baskısının uygulanması, elde edilen suşun performansının analizi ve bir sonraki hedefin dizaynı. Sonuç olarak, endüstriyel uygulamalarda, yüksek derecede donma-erime stresine dirençli, mayanın kendi genomu dışında yabancı herhangibir gen içermeyen, geliştirilmiş ekmek maya hücrelerinin kullanımı, daha güvenli ve kabul edilebilirdir. Böylece, bu yöntem, donma-erime stres direnci ile sonuçlanan yüksek derecede regüle edilmiş genomu ile ekmek mayasının endüstride kullanımının güvenli bir yoludur.
Evolutionary engineering and molecular characterization of freeze-thaw resistant saccharomyces cerevisiae

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013) Yılmaz, Ülkü ; Çakar, Zeynep Petek ; 352299 ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji

Saccharomyces cerevisiae içki ve fırıncılık endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılan endüstriyel bir mikroorganizmadır. İyi karakterize edilmiş bir mikroorganizmadır ve aynı zamanda temel ve biyoteknolojik araştırmalar için önemlidir. Endüstriyel uygulamalarda, donma-erime stresi özellikle donmuş hamur prosesinde genel bir stres çeşididir. S. cerevisiae? de donma-erime stres uygulamaları, hücrelerin donma-erime stresinin ölümcül etkileri ile başa çıkabilmeleri için çok yönlü çapraz-direnç mekanizmasını uyarır. Çok yönlü stres direnci ve donma-erime toleransı elde etmek için ekstra genetik mekanizmaların donma-erime stresi varlığında uyarıldığı ve aktif oldukları düşünülmektedir. S. cerevisiae? de donma-erime stresi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır, fakat donma-erime toleransının arkasında yer alan moleküler mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Evrimsel mühendislik, donma-erime stresine direnç gibi, özel ve istenilen fenotiplerdeki mutant suşların elde edilmesinde kullanılan ?doğal? bir prosestir. Genel olarak, evrimsel mühendislik dört ana basamaktan oluşmaktadır. Bu aşamalar; genetik olarak karışık hücre populasyonunun kimyasal/fiziksel mutasyon ile elde edilmesi, istenilen özellikteki geliştirilmiş suşun elde edilmesi için tekrarlayan sikluslarda seleksiyon baskısının uygulanması, elde edilen suşun performansının analizi ve bir sonraki hedefin dizaynı. Sonuç olarak, endüstriyel uygulamalarda, yüksek derecede donma-erime stresine dirençli, mayanın kendi genomu dışında yabancı herhangibir gen içermeyen, geliştirilmiş ekmek maya hücrelerinin kullanımı, daha güvenli ve kabul edilebilirdir. Böylece, bu yöntem, donma-erime stres direnci ile sonuçlanan yüksek derecede regüle edilmiş genomu ile ekmek mayasının endüstride kullanımının güvenli bir yoludur.
Evrimsel Mühendislik Yöntemiyle Elde Edilmiş Tuza Dirençli Bir Saccharomyces Cerevisiae Mutantının Moleküler Ve Fizyolojik Karakterizasyonu

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015-08-05) Tekarslan, Şeyma Hande ; Çakar, Zeynep Petek ; 10083257 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics

Maya; moleküler biyoloji, hücre morfojenezi, kromozom stabilitesi ve hatta yaşlanma için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D endüstri ve akademideki metabolik mühendislik ve sistem biyolojisi çalışmalarında geniş kullanım alanına sahiptir. 1990'larda Alman maya araştırmacılarından oluşan bir konsorsiyum S.cerevisiae'ın, farklı laboratuvar suşlarını çaprazlayarak CEN.PK suşlarının izogenik ailesini geliştirmişlerdir. Alkali katyon homeostazinin sağlanması maya da dahil olmak üzere çoğu hücre tipinde anahtar prosestir. Sodyum klorür insan biyolojisi için çok önemlidir. Na+ ve K+ insanda beslenme için gereklidir ve Li+ ise kemirgen ve keçilerde gerekli bir besin bileşenidir. Tomurcuklu bir maya olan S. cerevisiae harici K+ konsantrasyonu (10 mM–2.5 M) ve Na+ (1.5 M) durumlarında büyüyebilmektedir. Bu çalışmanın amacı fizyolojik ve transkriptomik seviyede NaCl stresinin prensiplerini araştırmaktır. S.cerevisiae daha inceki bir çalışmada (Sezgin T., 2010) etil metansulfonat (EMS) ile muamele edilerek mutajenize edildi ve sonra tuz stresine maruz bırakıldı. Mutant bireyler seçilerek tuza karşı nasıl direnç kazandığı yabanıl tip ile karşılaştırılarak araştırıldı. 5 mM LiCl, 0.5 M NaCl, 0.7 M NaCl and 0.9 M NaCl varlığında YMM'de büyütülen yabanıl tip ve T8'in spesifik büyüme eğrileri oluşturuldu. Tüm bu şartlar altında T8 yabanıl tipe göre daha iyi üredi. T8 ve yabanıl tip'e ait olan fenotipik sonuçlar T8'in sodyum ve lityuma karşı olan direncinin belirgin olduğunu ve T8'in potasyum varlığında yabanıl tip ile aynı düzeyde ürediğini göstermiştir. Bu, T8 katyonik toksisiteye karşı dirençliyken osmotik strese karşı direnç göstermemektedir. %25, %30, %35 sorbitol varlığında YMM'de büyütülen T8 ve yabanıl tip karşılaştırıldığında sorbitol varlığında yabanıl tip ve T8'in aynı düzeyde ürediği görülmüştür. T8'in potasyum varlığında da aynı etkiyi gösterdiği görülmiş olup T8'in osmotik strese karşı direnç göstermediğinin kanıtıdır. pH'ın NaCl direncine olan etkisini incelemek üzere T8 ve yabanıl tip değişen NaCl miktarlarında ve farklı pH aralığına sahip YPD'de büyütülmüş. T8'in NaCl olan direncinin pH değişikliklerinden etkilenmediği gözlenmiştir. T8 ve yabanıl tip katyonik ilaçlara olan direnci test edilmiştir. Katyonik ilaç olarak Tetrametilammonyum (TMA) ve spermin seçilmiştir. Katyonik ilaçlar ile direnç testinin sebebi, eğer dirençte bir farklılık var ise, mutantta elektrokimyasal gradient değişikliği oluşmuş olma ihtimalidir. T8 ve yabanıl tip farklı spermin ve TMA miktarlarına sahip olan YPD'de büyütülmüş. T8 ve yabanıl tip'in TMA ve spermin dirençlerinin farklı olmadığı gözlenmiştir. Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometri (AAAS) sonuçları göstermiştir ki, yüksek oranda harici Na+ ve Li+ konsantrasyonları hem T8 hem de yabanıl tipteki hücre içi Na+ miktarını yükseltirken hücre içi K+ oranı düşmektedir. Hücreler toplam tek değerlikli katyon miktarını K+, Na+ and Li+ streslerinden sonra düşük tutmaktadır. NaCl dirençli mutant T8 yabanıl tip ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde lityum birikmesi görülmemektedir. T8'in lityum direncinin sebebi artmış lityum efflux olmayabilir. Çift stres koşullarında T8 yabanıl tipe göre çok az miktarda Li+ biriktirmiştir. 1 M KCl varlığında yabanıl tip ve T8 karşılaştırıldığında, T8 en yüksek potasyum ve sodyum miktarına sahiptir. T8 LiCl ve NaCl varlığında en yüksek LiCl miktarına sahiptir. AAAS sonuçlarına göre, her stres koşulu altında T8 yabanıl tipe göre yüksek K+/Na+ oranına sahiptir. T8 ve yabanıl tipin K+/Na+ oranları arasındaki fark 5 mM LiCl stresi altında çok belirgindir. LiCl stresinde bu oranın daha fazla olmasının sebebi lityum efflux genlerinin az eksprese olmasından kaynaklı olabilir. Bu durumda T8, NaCl stresindeki gibi LiCl stresinde etkin efflux sistemine sahip olmayabilir. Glikojen ve trehaloz S. cerevisiae'da iki önemli glikoz depolasudur ve bunların üretimi bir çok çevresel stres koşullarına bağlı olarak değişmektedir. Disakkarit trehaloz, tuz adaptasyonunda birikmektedir. Glikojen ve trehaloz miktarının ölçümü sonucunda T8'deki trehaloz ve glikojen miktarı stressiz koşulda göze çarpan bir şekilde yüksektir. Lityum glikojen ve trehaloz miktarını sodyuma göre daha fazla tetiklemektedir. Bu sonuç, lityumun yüksek toksisitesi ile açıklanabilir. Lityum ve sodyumlu stres ve stressiz koşullarda T8'deki trehaloz miktarı glikojene göre daha yüksektir. NaCl ve LiCl varlığında ve yokluğunda T8 ve yabanıl tipin metabolik ürün üretimi Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile incelenmiş. 0.5 M NaCl varlığında T8'in glukoz kullanımının ve etanol üretiminin yabanıl tipe göre daha az olduğu ve en yüksel gliserol üretimine sahip olduğu gözlenmiştir. LiCl varlığında yabanıl tipin glikoz kullanımının belirgin bir şekilde az olduğu ve en yüksek gliserol üretimine sahip olduğu gözlenmiştir. NaCl dirençli evrilmiş S. cerevisiae suşu T8'de, yabanıl tipe göre gliserol ve etanol üretimi daha azalmıştır. Evrilmiş mutantın metabolizması gliserola doğru ve etanol üretiminden uzağa doğru yönlenmiştir. Organizmalar strese karşı korunmak için birçok fizyolojik mekanizmalar kullanılmaktadır. Bu mekanizmalardan birisi çapraz direnç mekanizmasıdır. Bu mekanizmanın amacı bir çevresel faktöre kazanılan direnç sayesinde ikincil strese karşı direnç kazanılmasıdır. fakat, her strese başka bir strese karşı çapraz direnç sağlamamaktadır. YMM ve YPD katı besiyeri ortamında, T8'in LiCl, ZnCl2, H2O2, CoCl2, KCl, etanol, CuCl2, MnCl2, CrCl3, AlCl3 için çapraz direnci incelenmiştir. T8, lityum için yüksek çapraz dirence sahiptir. T8; Co+2, Mn+2 Ni+2, Zn+2'ye az miktarda direnç gösterirken alüminyuma ise hassastır. S. cerevisiae genomu hücre lokalizasyonu, sübstrat spesifikliği ve fizyolojik fonksiyonları açısından birbirlerinden farklılaşan alkali metal katyon/H+ antiporterlarını (Nha1p, Nhx1p, Kha1p) kodlayan 3 gene sahiptir. NHX1, NHA1, ve KHA1 genleri, mutant suşu T8 ile karşılaştırılmak için sekanslanmıştır. Sekanslama sonuçları, EMS ve NaCl stresinin NHX1, NHA1 ve KHA1 gen sekanslarını etkilemediğini göstermiştir. S. cerevisiae'nın yüksek NaCl stresine olan transkripsiyonal cevabı, DNA mikroarray kullanılarak analiz edilmiştir. Mikroarray sonuçlarında, enerji, hücre kurtarma, savunma ve virülans; metabolizma; hücresel transport, transport yolları; hücresel haberleşme/sinyal iletimi mekanizması dahil olmak üzere fonksiyonel kategorileri de içeren NaCl toleransı ile bağlantılı birkaç yüz gen tespit edilmiştir. Mikroarray sonucuna göre, 548 genin ekspresyonu artmış, 22 genin ise ekspresyonu azalmıştır. Hücresel transport ve transport yollarına ait genlerden ise 98 genin ekspresyonu artmışken 32 genin ekspresyonu azalmıştır. Flokülasyon ve biyofilm için gerekli olan GPI-bağlantılı hücre yüzeyi glikoproteini (flokkulin) kodlayan FLO11 geni T8'de en fazla eksprese olan gendir. T8'in microarray sonuçlarında, HOG yolizi indüklenmemiştir. T8 yavaş glukoz alımına sahip olup, yüksek seviyelerde süksinat ve asetat biriktirmemiştir. FLO11 glukoz represyon yolizi ile de kontrol edilmektedir. Bu yolizinde, glukoz heksoz transporterları tarafından besiyerinden hücreye alınır ve hücre içinde glukoz heksokinazlar tarafından glukoz-6-fosfatta fosfatlanır. Bu fosfatlama Snf1 protein kinaz'ı ve Nrg1 inhibitör proteinini de inaktive eder. Bu inaktivasyon FLO11'in regulasyonunu baskılar. Glukoz miktarı az olduğunda Snf1 aktive olarak FLO11 eksprese olur. S.cerevisiae'nin pH değişiklilerine cevabını kontrol eden transkripsiyon faktörü Rim101p hem ENA6 hem de FLO11 ekspresyonunu kontrol etmektedir. T8'de HXT genleri, HXTK1, NRG1, FLO11 ve ENA6 ekspresyonları artmıştır. Bu iki yolizi tarafında T8'in NaCl stresine direnci kontrol edilmesi muhtemeldir. Mikroarray sonucunda T8 indüklenmiş ENA6 ekspresyonuna sahipken, NHA1 indüklenmemiştir. Real-Time PCR sonuçlarında ise ENA6 ve NHA1 genleri indüklenmiştir. Bu sonuçların mikroarray ve real-time PCR arasındaki hassasiyet farklılıklarından kaynaklanması muhtemeldir, zira real-time PCR sonraki daha hassastır. Mikroarray sonuçları T8'in pek çok geninin ortamda NaCl stresi yokken bile ekspresyonunun artmış olduğunu göstermektedir. Ekspresyonu artmış ve azalmış bu genler, T8'i yüksek sodyum ve lityum stresine adapte etmektedir. Nha1 proteini daha fazla üretilmek için klonlanmış ve komplementasyon analizi ile kontrol edilmiştir. Nha1p'nin overekspresyonu göstermiştir ki protein en iyi pH 3.5'te komplement etmektedir. Nha1'e spesifik tek bölge mutasyonları [G372S, D266H, D267A, D266H/D267A, D266N/D267N, N176, D177N], bu mutasyonların pH üzerine olan etkisini anlamak için uygulanmıştır. Bu çalışmada, gliserol üretimi artmış ve etanol üretimi azalmış S.cerevisiae suşlarının, tuz stresine direnç kazandırmaya yönelik evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edilebileceği gösterilmiştir. Bu çalışma, EMS ve artan NaCl stres düzeyleri kullanılarak S.cerevisiae seleksiyonu için evrimsel mühendisliğin uygulandığı ilk çalışmadır. Ayrıca bu tez çalışmasının sonuçları, FLO11'in S.cerevisiae'nin yüksek tuz direncinde önemli bir rolü olabileceğine işaret etmektedir.
Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2020) Sürmeli, Yusuf ; Çakar, Zeynep Petek ; 625499 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı

Caffeine, a natural purine alkaloid, is highly consumed worldwide as an ingredient of some beverages like coffee, tea and soft drinks. Although there are many reports on caffeine effects in many organisms like yeast, pleiotropic effects of caffeine, and molecular mechanisms of caffeine resistance and response are largely unknown.In this study, highly caffeine-resistant Saccharomyces cerevisiae mutants were obtained for the first time by evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering strategy, based on batch selection under gradually increasing caffeine stress, with and without applying any mutagen to the initial population before selection. The selection process was initiated at 7.5 mM caffeine concentration, and continued until 50 mM, for 48 populations. Genetically stable, caffeine-resistant mutant strains were isolated from the final populations of the selection, where they resisted as high as 50 mM caffeine, a concentration that has not been documented for S. cerevisiae so far. Among those mutants, three strains Caf905-2, Caf906-11, and Caf906-12) had the highest caffeine resistance, and they were also cross-resistant to a variety of stress conditions like coniferyl aldehyde, antimycin A, and rapamycin. One of the caffeine-hyperresistant strains (Caf905-2) was characterized at physiological, transcriptomic and genomic levels. Caf905-2 did not have a reduction of growth under 10 mM caffeine stress, where its maximum specific growth rate (µmax) was nearly three-fold of that of the reference strain. Expectedly, Caf905-2 entered the stationary phase at 12 h, but the reference strain at 30 h. Biomass levels of the two strains showed an increase under 10 mM caffeine stress, compared to the absence of caffeine. Also, ethanol yield decreased in the reference strain under 10 mM caffeine stress, but not in Caf905-2. Similarly, glycerol yield decreased in Caf905-2 under caffeine stress, but not in the reference strain. The reference strain also accumulated more intracellular trehalose than Caf905-2, particularly under caffeine stress condition. The resistance of Caf905-2 against lyticase, a β-1,3-glucan-degrading enzyme, was higher than that of the reference strain, under both caffeine stress and nonstress conditions. DNA microarray analysis identified a total of 745 overexpressed and 741 repressed genes with statistically changes of gene expression levels (corrected p < 0.05) encompassing at least 2-fold alteration in Caf905-2. Functional categorization of transcriptomic analysis results of Caf905-2 suggested that the genes implicated in energy and protein fate pathways, oxygen and radical detoxification, and drug/toxin transport associated with pleiotropic drug resistance were stimulated, whereas the genes implicated in transcription, protein synthesis, cellular transport pathways, and nucleotide metabolism were repressed in the nonstress condition. Whole genome re-sequencing analysis results unearthed only three single nucleotide variations, distributed in three different genes; PDR1, PDR5, and RIM8 in Caf905-2, relative to the reference strain. The exact roles of these genes in caffeine response and resistance in yeast should be investigated in detail in future studies.
Molecular and physiological investigation of longevity in yeast

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017) Arslan, Mevlüt ; Çakar, Zeynep Petek ; 10177821 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology

Dünya popülasyonu, hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde, doğum ve ölüm oranlarındaki azalmadan dolayı, görece olarak yaşlanmaktadır. Bu durum büyük bir sorun oluşturmaktadır. Zamanla hücrelerin fizyolojik fonksiyonlarında gerçekleşen kayıplar nedeniyle yaşlanma; Alzheimer, Parkinson, diyabet, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar gibi bazı ciddi hastalıklar için bir risk faktörüdür. Son yıllarda araştırmacılar, artan sosyoekonomik kaygılardan dolayı bu sorun üzerine odaklanmaktadırlar. Bu çalışmalardaki amaç, hücresel yaşlanma sürecinin anlaşılması ve sağlıklı bir yaşam sağlanmasıdır. Yaşlanma araştırmalarında Saccharomyces cerevisiae mayası, Drosophila melanogaster sineği, Caenorhabditis elegans kurdu, kemirgenler ve primatlar model organizma olarak kullanılmaktadır. S. cerevisiae mayası tek hücreli ökaryotik bir mikroorganizmadır ve eski zamanlardan beri; ekmek, şarap ve bira yapımı gibi endüstriyel alanlarda kullanılmaktadır. S. cerevisiae, genetik ve moleküler biyolojik araştırmalarda pahalı ve özel besiyerlerine ve de kültür koşullarına gerek duymadığı için bir ökaryotik model organizma olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. S. cerevisiae mayası yaşlanma çalışmalarında; yaşam süresinin kısalığı, genom dizi verileri, memeli hücrelerine benzerliği ve mevcut olan kapsamlı moleküler araç ve tekniklerinden dolayı yaygın olarak tercih edilen bir model organizmadır. Yaşlanma çalışmaları, S. cerevisiae'da kronolojik yaşam süresi ve replikatif yaşam süresinin incelenmesiyle iki yönden yürütülebilir. Replikatif yaşam süresi, S. cerevisiae hücrelerinin asimetrik bölünme geçirmesinden dolayı geliştirilmiştir. Bu yöntemde, yavru hücre mitoz bölünme sonrasında bir mikromanipülatör kullanılarak anne hücreden ayrılır ve bu işlem, anne hücre bölünmesini durduruncaya kadar sürdürülür. Mitozun sonunda bir anne hücrenin meydana getirdiği tomurcukların (bud) sayısı tespit edilir ve bu yavru hücrelerin (tomurcuk) sayısı, S. cerevisiae'nın replikatif yaşam süresidir. Kronolojik yaşam süresi ise, hücre üremesinin durağan evresindeki bölünmeyen hücrelerin hayatta kaldığı zamanın uzunluğudur. Bu yöntemde hücre canlılığı, üremenin durağan evresinin başlangıcında katı besiyerinde canlı hücre sayımı ile belirlenir. Bundan sonra, durağan evredeki bölünmesini durdurmuş (G0) hücrelerin canlılığı izlenir. Kronolojik yaşam süresi yöntemi; (i) durağan evredeki maya hücrelerindeki hasarın zamanla artması, (ii) durağan evredeki hücrelerin hücre döngüsünden çıkmaları (G0) ve (iii) bu hücrelerin enerjilerini mitokondriden sağlamaları nedeniyle, yüksek ökaryotik organizmaların bölünmeyen hücrelerinin (örn. nöronlar) yaşlanmasını çalışmak için de uygun bir model olarak kabul edilir. Uzun yaşayan S. cerevisiae, C. elegans ve Drosophila mutantları hücresel yaşlanmanın mekanizmalarının anlaşılmasında büyük bir role sahiptir. Burada ilk olarak uzun ömürlü mutant suşlar elde edildiğinden ve sonrasında; bunun moleküler temellerinin anlaşılması için detaylı incelemeler yapıldığından bu çalışmalar benzer yaklaşımlar sergilerler. Bu stratejiler, tersine metabolik mühendislik yaklaşımına da benzerlikler göstermektedir. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımında ilk olarak istenilen fenotip elde edilir, sonra da bu fenotipin genetik mekanizmaları tespit edilir. Bu yaklaşım karmaşık bir genetiğe sahip, istenilen mikrobiyal fenotipleri elde etmek için çok güçlü bir yaklaşımdır. Bu yaklaşımdan, kronolojik olarak uzun ömürlü maya eldesi için henüz yararlanılmamıştır. Bu çalışmada, tersine metabolik mühendislik yaklaşımı, kronolojik açıdan uzun ömürlü S. cerevisiae eldesi için kullanıldı. Ayrıca, model organizmalar kullanılarak yapılan literatürdeki yaşlanma çalışmaları, strese direnç ve uzun yaşam arasında yakın bir ilişki olduğunu gösterdiğinden, bu çalışmada; daha önce elde edilmiş olan strese dirençli S. cerevisiae mutantlarının kronolojik yaşam süreleri de ayrıca araştırıldı. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımıyla kronolojik olarak uzun ömürlü bir maya mutantı elde etmek için ilk olarak; etil metan sülfonat ile mutajenez yapılarak, başlangıç popülasyonunun genetik çeşitliliği artırıldı. Kalori kısıtlamasının yaşam süresini uzattığı bilindiği için, başlangıç mutant popülasyonunun ardışık olarak kesikli kültürleri, gittikçe düzeyi arttırılan kalori kısıtlamasıyla yapıldı. Bu ardışık kesikli kültürler süresince, besiyerinin glikoz konsantrasyonu, % 0.5'ten % 0.02'ye düşürüldü. Son kesikli kültürde, mutant popülasyonun büyüme oranları %10'a düştüğü için; seleksiyon işlemi sonlandırıldı. Bundan sonra mutant bireyler rastgele bir şekilde bu son popülasyondan seçildi. Yarı-kantitatif ve kantitatif kronolojik yaşam süresini tespit etme yöntemleri bu seçilen mutant bireylere uygulandı. Daha sonraki moleküler ve fizyolojik çalışmalar için, mutant bireyler içinde kronolojik olarak hayatta kalımı en yüksek olan mutant (SRM11 olarak adlandırılan) seçildi. Katı besiyerinde canlı hücreleri sayma üzerine dayalı kantitatif kronolojik yaşam süresi tespit yöntemi; çok sayıda suşun ya da çok fazla koşulun test edildiği geniş ölçekli çalışmalar için, inkübasyon sırasında çok fazla sayıda pleyt ve kültür kabına gerek duyulması sebebiyle oldukça yorucu ve zahmetli bir yöntemdir. Bu nedenle bu çalışmada, mutant suşlarda kronolojik yaşam sürelerinin ön tespiti için yarı-kantitatif yöntem kullanıldı. Bu yönteme, yoğunlukları önemli derecede farklı olan kültürlerin kronolojik yaşam sürelerinin daha gerçekçi bir şekilde tespiti için kültür yoğunluklarını eşitleme adımı eklendi. Bu yarı-kantitatif yöntemin devamında, öne çıkan mutantların kronolojik yaşam sürelerinin analizi kantitatif yöntem ile de yapıldı. Bu süreç, başarılı bir şekilde uygulandı ve bir çok suş ve koşulda, kronolojik yönden uzun yaşayan fenotipler doğru bir şekilde belirlendi. Mutant SRM11'in üreme özellikleri, biyokütle ve fizyolojik üreme analizleriyle araştırıldı. Bu deneylerdeki amaç, üreme fizyolojisi yönünden bir kayıp (trade-off) meydana gelip gelmediğinin tespitini yapmaktı. Analiz sonuçları, mutant SRM11'in hem kalorisi kısıtlanan besiyerinde (% 0.5 glikoz) hem de standart besiyerinde (% 2 glikoz) üreme özelliği yönünden bir kaybının olmadığını gösterdi. Bu çalışmada, besiyeri glikoz konsantrasyonunun %75 oranında düşürülmesi (%2'den %0.5'e) maya suşlarında, besiyerinde glikoz kullanılıyor olduğu zamanki büyüme oranlarını etkilemedi. Yüksek basınçlı likit kromatografi (HPLC) analizi, uzun ömürlü mutant SRM11 ve referans suşun metabolik profillerini incelemek için kullanıldı. Bu amaçla kültür örneklerinin glikoz, etanol, gliserol ve asetat konsantrasyonları, HPLC analizleri ile izlendi. Referans suş ve mutant SRM11 arasında glikoz tüketimi açısından önemli bir fark gözlenmemesine rağmen, fermentatif metabolitlerin üretiminde önemli bir fark gözlendi. Mutant SRM11 standart glikozlu besiyerinde (% 2) düşük miktarda etanol, gliserol ve asetat üretti. Bu bulgu, mutant SRM11'in metabolizmasında solunuma yönelişini ve de solunuma dayalı metabolizmanın, kronolojik yönden uzun yaşamla ilişikili olduğunu göstermektedir. % 0.5 glikoz besiyerinde, referans suş ve mutant SRM11' in kültürlerinde az miktarda etanol ve gliserol üretimi gözlendi. Bu durum; %0.5 glikoz konsantrasyonunda fermentasyonun sınırlı olduğunu göstermektedir. Model organizmalardaki yaşlanma çalışmaları, stres direnci ile uzun yaşam arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, uzun ömürlü mutant SRM11'de, strese direnç analizi, yarı-kantitatif damlatma yöntemi (spot assay) kullanılarak uygulandı. Sonuçlar mutant SRM11'in bakır stresine yüksek düzeyde dirençli olduğunu gösterdi. SRM11, ayrıca gümüş, feniletanol, etanol ve borik asit streslerine de direnç gösterdi. Bu sonuçlar, bu stres türlerinin kronolojik yönden uzun yaşamla ilişkili olabileceğini göstermektedir. Mayada kronolojik yönden uzun yaşamın moleküler mekanizmalarını anlamak için DNA mikrodizi teknolojisi kullanılarak, uzun ömürlü mutant SRM11'in tüm genom transkriptomu analiz edildi. DNA mikrodizi analiz sonuçları, referans suşla karşılaştırıldığında, uzun yaşayan mutant SRM11'de iki-kat ve üstü 769 açık okuma bölgesi (ORF)'nin ifadesinin arttığını ve 838 açık okuma bölgesinin ifadesinin de azaldığını gösterdi. Gen ifadelerindeki bu değişimi yorumlamak için, Gen Ontoloji (GO) analizi kullanıldı. İfadesi artmış olan genlerin GO analizi, oligosakkarit-karbonhidrat metabolik biyolojik prosesleri ve oksidatif strese yanıt işlevlerinin SRM11'de aktive edildiğini gösterdi. Ayrıca, SRM11'de ifadesi azalan genlerin GO analizi, ribozomal altünite biyogenezi ve ribozomun bileşenlerinin bir araya gelmesi (assembly) ve RNA işleme süreçlerinin baskılandığını gösterdi. Bu sonuçlar, oligosakkarit-karbonhidrat metabolik prosesi ve oksidatif strese yanıt işlevinin artması ve protein sentezinin baskılanmasının, S. cerevisiae mayasında kronolojik yönden uzun yaşamın artırılması ile ilişkili olabileceğini önermektedir. Çeşitli streslere dirençli S. cerevisiae mutantlarının kronolojik yönden yaşam süreleri de yarı-kantitatif ve kantitatif yöntemlerle araştırıldı. Test edilen strese dirençli mutantlar arasında, gümüşe-dirençli, etanole-dirençli, feniletanole-dirençli, oksidatif strese-dirençli mutantlar, uzun ömürlü mutantlar olarak tespit edildi. Oksidatif stres direncinin mayada kronolojik olarak hayatta kalma ile ilişkili olduğu gösterilmişti, fakat; gümüş, etanol, feniletanol streslerine dirence dair bir veri, literatürde mevcut değildi. Bu çalışma, S. cerevisiae mayasında gümüş, etanol ve feniletanole direncin, kronolojik yönden uzun yaşamla ilişkili olabileceğini ilk defa gösterdi. Bu çalışmada ayrıca, stres direnci ve kronolojik yönden uzun yaşam arasındaki ilişkiyi belirlemek amacıyla, uzun ömürlü ve strese dirençli mutantların (gümüşe-dirençli, feniletanole-dirençli, etanole-dirençli mutantlar ve uzun ömürlü mutant SRM11) karşılaştırmalı transkriptomik analizleri yapıldı. Karşılaştırmalı transkriptomik analizler, uzun ömürlü ve strese dirençli mutantlarda ortak olarak 17 tane ifadesi azalan ve 48 tane ifadesi artan genin bulunduğunu gösterdi. İfadesi ortak olarak artmış genlerin GO analizi, bunların oligosakkarit-karbonhidrat metabolik prosesleri, enerji ve öncül metabolitlerin oluşumu ile ilgili biyolojik işlevlerde gruplandıklarını gösterdi. İfadesi ortak olarak azalmış genlerin GO analizi ise, ribozomal altbirimlerin oluşumu ve aminoasit taşınımı gibi biyolojik işlevlerin baskılandığını gösterdi. Sonuç olarak bu çalışma; artan solunum metabolizmasının, bakır, gümüş, etanol ve feniletanol streslerine direncin, protein sentezinin baskılanmasının, oligosakkarit ve karbonhidrat metabolik proseslerinin aktive edilmesinin, S. cerevisiae mayasında kronolojik yönden uzun yaşamla ilişkili olabileceğini göstermektedir. Genomik ve proteomik düzeyde yapılacak detaylı analizler, S. cerevisiae'de uzun yaşamın karmaşık moleküler temellerinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Strese Dirençli Saccharomyces Cerevısıae Mutantlarının Evrimsel Mühendisliği Ve Moleküler Karakterizasyonu

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014-02-21) Alkım, Ceren ; Çakar, Zeynep Petek ; 460340 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics

Kobalt canlılar için gerekli bir metaldir ancak organizmaların ihtiyacından fazla alınması durumunda hücresel faaliyetlere zarar vermesi nedeniyle toksik etki yaratmaktadır. Kobaltın hücreye alımı, hücre içerisinde kullanılması ve hücrenin bu metale karşı gösterdiği direnç mekanizmaları diğer bir çok elzem metala oranla daha az bilinmektedir. Saccharomyces cerevisiae, moleküler biyoloji çalışmalarında ileri ökaryotlarla çok yakın ve benzer genetik yapısı nedeniyle tercih edilen bir mayadır. Bu tez çalışmasında kobalt direncine sahip S. cerevisiae mutant mayalarının eldesi, bu elementin biyolojik sistemlerde ve metabolizmada etkilerinin moleküler düzeyde çalışılabilmesi için gerçekleştirilmiş. Bu amaçla da, tersine metabolizma mühendisliğinin bir dalı olan evrimsel mühendislik yöntemi kullanılmıştır. Yapılan genetik ve transkriptomik analizler ardından kobalt direncinin başka metallerle de çok ilgili olabileceği gösterilmiş, özellikle demir homeostazisi ile kobalt direnci arasındaki yakın ilişki belirtilmiştir. Evrimsel mühendislik ile kobalta dirençli olan mutantların, metal ve diğer yolizlerinin hücre içerisinde birbirleri ile etkileşimlerini ortaya çıkarması açısından önemli bir çalışma olmuştur.
Yönlendirilmiş Evrim Yöntemiyle Saccharomyces Cerevısıae’nın Endüstriyel Açıdan Önemli Özelliklerinin Geliştirilmesı

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011-04-07) Sezgin, Tuğba ; Çakar, Zeynep Petek ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics

Genel olarak ekmek üretimi, bira üretimi ve fermentasyon gibi pek çok biyoteknolojik süreçte, maya hücreleri çok çeşitli stres koşullarına maruz kalmaktadır. Binlerce yıllık biyoteknolojik kullanım Saccharomyces cerevisiae mayasını evcilleştirerek çok çeşitli uygulamalar için farklı suşlarının gelişmesine yol açmıştır. Bununla birlikte çeşitli stres koşullarına dayanıklı maya suşlarının elde edilmesi halen endüstriyel uygulamaların en önemli gereksinimlerinden biridir. Stres adaptasyon mekanizmalarının ökaryotlar arasında genellikle benzer olması sebebiyle, bir model organizma olan Saccharomyces cerevisiae’nın stres tepki mekanizmaları önemli ölçüde ilgi çekmektedir. Diğer yandan, çeşitli streslere dayanıklı fenotipler klasik metabolik mühendislik stratejileri ile elde edilmesi kolay olmayan çok faktörlü genetik farklılaşmalara sahiptir. Bu nedenle, rastgele mutasyon ve seleksiyona dayalı deneysel prosedürler, stres koşullarına dayanıklılığın optimize edilmesi açısından yararlı yaklaşımlardır. Bu çalışmada ozmotik, tuz ve asit streslerine dayanıklı maya hücreleri elde etmek amacıyla, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik stratejisi uygulanmıştır. Bu amaçla, S. cerevisiae başlangıç populasyonunun genetik çeşitliliği, etil metan sülfonata maruz bırakılarak arttırılmıştır. Bu mutant popülasyona, stres düzeyi sürekli ve kademeli olarak arttırılarak kesikli seleksiyon stratejisi olarak uygulanmıştır. Ozmotik, tuz ve asit stres seleksiyonlarının, uygulanan en yüksek stres koşulunda hayatta kalabilen son populasyonlarından rastgele bireyler seçilmiştir. En muhtemel sayı (MPN) ve seri seyreltme yöntemleriyle tuza ve sorbitole dirençli bireylerin, hem seçildikleri stres koşuluna hem de olası çapraz dirençleri belirlemek için endüstriyel açıdan önemli diğer stres türlerine dirençleri incelenmiştir. Bu streslere, oksidatif, etanol, donma-erime,ısı ve bazı ağır metal stresleri dahildir. Ayrıca oksidatif stres ve kontrol koşullarında mutantların katalaz aktiviteleri incelenmiştir. Tuz stresine en dirençli bireylerden biri olarak seçilen ‘T8’ mutantının tetrat analizi sonucu strese direncini sağlayan mutasyonun tek bir resesif gen mutasyonundan kaynaklandığı belirlenmiştir. Son olarak T8 mutantının, stres koşullarında belirli genlerinin ekspresyon düzeyleri kantitatif olarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile incelenerek yaban türün ekspresyon düzeyleri ile karşılaştırılmıştır. İlginç olarak, stres direnci ile ilgili olduğu beklenen belirli genlerin ekspresyon düzeylerinin, mutantta stressiz koşullarda bile yaban türe kıyasla yüksek olduğu gözlenmiştir. Transkriptomik analizleri içerecek yeni deneysel çalışmalar, karmaşık direnç mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olabilecektir.

Gözat

Yazar "Çakar, Zeynep Petek" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma

Sayfa başına sonuç

Sıralama Seçenekleri