Lipaz Enziminin Çöktürülmüş Silika Üzerine İmmobilizasyonu Ve Polikaprolakton Sentezi

dc.contributor.advisor Güvenilir, Fatoş Yüksel tr_TR
dc.contributor.author Gökalp, Nurefşan tr_TR
dc.contributor.authorID 10098606 tr_TR
dc.contributor.department Kimya Mühendisliği tr_TR
dc.contributor.department Chemical Engineering en_US
dc.date 2016 tr_TR
dc.date.accessioned 2018-05-18T12:39:34Z
dc.date.available 2018-05-18T12:39:34Z
dc.date.issued 2016-01-15 tr_TR
dc.description Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016 tr_TR
dc.description Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016 en_US
dc.description.abstract Polikaprolakton (PKL), alifatik polyersterler sınıfından olan sentetik bir polimerdir ve sentetik özellikte olmasına rağmen biyouyumluluk ve geçirgenlik gibi özellikleri sayesinde biyomedikal uygulamalar başta olmak üzere oldukça geniş bir uygulama alanına sahiptir. PKL sentezi için genel olarak kalay karboksilatlar ve alüminyum alkoksitler gibi organometalik katalizörler kullanılmaktadır; ancak sentez sonrasında bu katalizörlerin kalıntılarını ortamdan tamamen ayırmak mümkün değildir. Bu kalıntılar zehirli içerikleri nedeniyle, özellikle biyomedikal uygulamalarda tolere edilemeyecek miktardadırlar. Son yıllarda, metal katalizörler yerine lipazlar gibi birçok biyokatalizör PKL sentezi için kullanılmaya başlanmıştır. Lipaz katalizörlüğünde gerçekleştirilen enzimatik polimerizasyon reaksiyonları, yüksek enantio ve regioseçiçilik, enzimin tekrar tekrar kullanılabilir özellikte olması ve ılımlı reaksiyon koşulları gibi özellikleri sayesinde geleneksel kimyasal polimerizasyon reaksiyonlarına göre daha avantajlı bir seçenek haline gelmiştir. Candida antarctica lipaz B, hem serbest formda hem de immobilize formda en fazla kullanılan lipazlardan biridir. Yüksek seçicilik özelliği ile aminoliz, esterifikasyon ve transesterifikasyon gibi birçok reaksiyonu katalizleyebilme özelliğine sahiptir. Diper enzimler gibi lipazların da destek bir malzemeye immobilize edilmesi ile, serbest formdaki lipazın stabilite, tekrar kullanılabilirlik ve seçicilik gibi özellikleri geliştirilebilmektedir. Yapılan birçok çalışma, immobilize formdaki CALB’nin polimerizasyon reksiyonlarında daha etkin olduğunu göstermiştir. Bu çalışmanın ilk aşamasında; Candida antarctica lipaz B, çapraz bağlama ve fiziksel adsorpsiyon yöntemleri ile immobilize edilmiştir. İki farklı immobilizasyon tekniğinin kullanılmasıyla, daha etkin olan yöntemi belirlemek hedeflenmiştir. Daha önce yapılan çalışmalar incelenerek; silika bazlı malzemelerin CALB immobilizasyonu için daha uygun olduğu görülmüş ve bundan dolayı mezopor yapıya sahip olan çöktürülmüş silika, bu çalışmada taşıyıcı malzeme olarak seçilmiştir. Ayrıca bu çalışmada çöktürülmüş silika, ilk defa CALB immobilizasyonunda kullanılmıştır. Çalışmada 3-aminopropiltrietoksisilan ve glutaraldehit, sırasıyla silanlama ajanı ve çapraz bağlayıcı olarak kullanılmıştır. 3-APTES/aseton oranı % 5, % 10, % 15 ve % 20’ye; glutaraldehit/fosfat tampon çözeltisi oranı da % 0.02, % 0.2 ve % 2’ye ayarlanarak; optimum 3-APTES ve glutaraldehit oranları belirlenmiştir. Daha sonra CALB, silanlanmış ve çapraz bağlanmış taşıyıcı malzemeler üzerine, enzim/silika oranı 0.5, 1, 2 ve 3’e ayarlanarak immobilize edilmiştir. Böylelikle, optimum lipaz konsantrasyonu da belirlenmiştir. Lipaz aktivitesi ve protein tayini, alkalimetrik titrasyon ve ultraviyole spektrofotometre ile hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlara gore, fiziksel adsorpsiyon ile immobilize edilen enzimin çapraz bağlama ile immobilize edilen enzyme gore daha aktif olduğu söylenebilir. Aktivite değerleri adsorplanan ve çapraz bağlanan enzimler için sırasıyla: yaklaşık olarak 4330 ve 2830 U olarak hesaplanmıştır. Her iki immobilize enzim için de, optimum 3-APTES/aseton ve lipaz konsantrasyonu, % 15 ve 2 olarak belirlenmiştir. Kullanılan glutaraldehit miktarı arttıkça ise, enzim aktivitesinin düştüğü görülmüştür. Buna göre glutaraldehit kullanılmadan, yani fiziksel adsorpsiyon yöntemi ile yapılan immobilizasyon işlemi sonucu, daha aktif enzimler elde edilmiştir. İmmobilize edilen enzimlerin raf ömrünü belirlemek için 4 ay boyunca düzenli olarak aktivite ölçümü yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, çapraz bağlanan ve adsorplanan lipazlar sırasıyla: % 59 ve % 50.1 oranında başlangıç aktivitelerini korumuşlardır. Ek olarak, lipaz aktiviteleri 4.5, 5.5, 6.5, 7, 7.5, 8.5, 9.5 and 10.5 pH değerlerinde ve 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55 ve 60 ºC’de ölçülmüş ve optimum pH ve sıcaklık değerleri belirlenmiştir. Fiziksel adsorpsiyon ile immobilize edilen enzim için en yüksek aktivite yaklaşık 7-8 pH değerlerinde ve 37 ºC’de elde edilirken; çapraz bağlama ile immobilize edilen lipaz için 7 pH değeri ve yaklaşık 35-37 ºC optimum değerler olarak belirlenmiştir.  Bunun yanında immobilize edilen enzimlerin aktiviteleri, CALB’nin serbest ve ticari immobilize formu (Novozym® 435)’nun aktiviteleri ile de karşılaştırılmıştır.  Sonuçlara gore, her iki immobilize enzimin de aktivitesi serbest CALB’den yüksek iken; sadece adsorpsiyon ile immobilize edilen enzim aktivitesi Novozym® 435’in aktivitesine yaklaşabilmiştir.  Son olarak, çötürülmüş silika ve immobilize enzimler fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi, termogravimetrik analiz ve taramalı elektron mikroskobu ile karakterize edilmiştir.  Çalışmanın ikinci aşamasında, immobilize edilen enzimler ɛ-kaprolaktonun (ɛ-KL) halka açılma polimerizasyonu yöntemi ile polimerize edilmesi için katalizör olarak kullanılmıştır. Reaksiyonlar  40, 60, 80 ºC sıcaklık değerleri ve 6, 24, 48, 120, 150 and 170 saatlik zaman periyotlarında gerçekleştirilmiştir. Enzim/ɛ-KL oranı % 2.5, % 5, % 10 ve % 20 olarak ayarlanarak; PKL’nin immobilize edilen enzimlerle sentezi için, optimum enzim konsantrasyonları belirlenmiştir.  Sentezlenen PKL’lerin molekül ağırlıkları, jel geçirgenlik kromatografisi ve proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile belirlenmiştir. Sonuçlara göre, fiziksel adsorpsiyon ile immobilize edilen lipazın katalizörlüğünde sentezlenen PKL’ler için en yüksek molekül ağırlığı ve monomer dönüşüm oranı 14300 g/mol ve % 90 olarak hesaplanmıştır.  Çapraz bağlı immobilize enzim kullanılarak sentezlenen PKL’ler için ise; en yüksek molekül ağırlığı 9000 g/mol ve % 90 olarak belirlenmiştir. Ayrıca, en yüksek molekül ağırlıkları her iki immobilize enzim için de % 20’lik enzim/ɛ-KL oranında elde edilmiştir. İmmobilize enzimlerin tekrar kullanılabilirliklerinin tayini için, her iki immobilize lipaz da seri halinde 5 defa PKL sentezi için kullanılmış ve 5. reaksiyon sonunda adsorplanan enzim yaklaşık % 32, çapraz bağlanan enzim ise yaklaşık % 42 oranında başlangıç aktivitesini korumuştur. Ek olarak, immobilize enzimlerin kullanıldığı sentez sonuçları, serbest CALB ve Novozym® 435 kullanılarak sentezlenen PKL’lerin molekül ağırlıkları ile kıyaslanmıştır. Buna göre, her iki immobilize enzim ile elde edilen sonuçlar, serbest CALB ile elde edilene oranla daha yüksek olmuştur. Ayrıca, adsorplanan CALB ile elde edilen sonuç Novozym® 435 ile elde edilene göre daha yüksek olurken; çapraz bağlı enzim bu değere % 70 oranında yaklaşabilmiştir. Son olarak, sentezlenen PKL’lerin yüzey morfolojileri taramalı elektron miksroskobu ile analiz edilmiştir. Bunun yanında, fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi, termogravimetrik analiz ve diferansiyel tarama kalorimetrisi ile katarizasyon yapılmıştır. PKL’nin karakteristik pikleri bu analizler sonucunda elde edilen diyagramlarda gösterilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma; immobilizasyon ile, lipazın aktivite, stabilite ve tekrar kullanılabilirlik gibi birçok özelliğinin geliştiğini göstermiştir. Lipaz aktivitesi immobilizasyon sonunda beklenmedik şekilde artmış ve her iki immobilize enzim de çok ciddi bir aktivite kaybı olmadan defalarca kullanılabilmiştir. Böylelikle, lipazın endüstriyel uygulamalarda kullanımı daha ekonomik hale gelmiş ve çalışma bu yönüyle, enzimlerin kullanıldığı “çevredostu proses”lere katkı sağlamıştır.  Son olarak, çalışmada enzimatik polimerizasyon yöntemi uygulanarak; polikaprolakton sentezlenmiş ve diğer polimerizasyon yöntemleriyle elde edilen sonuçlara paralel olarak yüksek molekül ağırlığı ve monomer dönüşüm oranlarına ulaşılmıştır. Bu sayede mevcut kirlilik sorunlarını ortadan kaldırmayı hedefleyen “yeşil polimer kimyası”na da  katkı sağlanmıştır. tr_TR
dc.description.abstract Well-defined aliphatic polyesters with end-functionalities, such as poly(e-caprolactone) (PCL) has been known as an important material in a range of biomedical applications because of its fascinating characteristics, like biodegradability and permeability. In the PCL synthesis, organometallic catalysts with stress on tin carboxylates and aluminium alkoxides were generally used as catalysts. However, residues of organometallic catalysts cannot tolerate in biomedical applications by reason of their toxicity. Lately, non-metal catalysts from natural sources like lipases were progressively more employed as biocatalysts for PCL synthesis. Furthermore, mild reaction conditions, high enantio- and regioselectivity, and reusability of enzyme provided it an superiority over conventional chemical polymerization.  Among lipases, the lipase obtained from Candida antarctica fraction B (CALB) is one of the most commonly utilized lipases. It is commercially available in both free and immobilized form, and has high degree of selectivity in a wide range of synthetic applications of industry importance, comprising kinetic resolutions, aminolysis, esterification and transesterification. By enzyme immobilization, catalysts can be advanced with important advantages compared to the free enzyme. Many literature reports define the high benefit of immobilized CALB for chemical transformations of low-molar-mass compounds and polymerization reactions. In the first part of this master thesis, an inorganic support material precipitated silica was used as a carrier to immobilize lipase B from Candida antarctica by both crosslinking and physical adsorption methods. Precipitated silica with mesoporous structure was chosen because of its suitability for CALB immobilization over other inorganic and organic carriers, and it did not use before to immobilize CALB. Accordingly, it is aimed to determine the performance of precipitated silica on CALB immobilization process. By performing two different immobilization techniques, the more effective method was also determined for the immobilization reactions. The aminosilane (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and the crosslinker glutaraldehyde were used to modify CALB. The ratios of 3-APTES/acetone solution were adjusted to 5 %, 10 %, 15 %, 20 % (w/v), whereas the ratios of glutaraldehyde/phosphate buffer solution were regulated as 0.02 %, 0.2 % and 2 % (v/v), respectively. After that, these modified support materials were used for immobilization reactions by adjusting the ratios of enzyme/silica as 0.5 (w/w), 1 (w/w), 2 (w/w), 3 (w/w).  In this way, the effect of 3-APTES, glutaraldehyde and lipase concentrations on immobilization processes were researched to define the most effective amounts of these materials for immobilization reactions. The activity and protein content of immobilized lipases were calculated by alkalimetric final titration method and ultraviolet spectrophotometer (UV). The results showed that adsorbed lipase possessed higher activity than crosslinked lipase, which were about 4330 and 2830 U, respectively. The highest activity for both immobilized enzymes were obtained at the 3-APTES/acetone solution ratio of 15 % (w/v), without glutaraldehyde solotion (by physical adsorption) and enzyme/silica ratio of 2 (w/w). Both crosslinked and adsorbed immobilized lipases were very stable, protecting 59 and 50.1 % of their initial activity after 4 months storage at 4 ºC. In addition, the activities of immobilized lipases were calculated at pH values of 4.5, 5.5, 6.5, 7, 7.5, 8.5, 9.5 and 10.5 and temperature values of 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55 and 60 ºC to determine the optimum pH and optimum temperature. The highest activity for adsorbed lipase was obtained at 37 ºC and a pH value between 7-8, while the optimum results was determined as around 35-37 ºC and a pH value of 7 for crosslinked lipase. Besides, the activities of immobilized enzymes were compared to the activities of free and commercial immobilized CALB (Novozym® 435). According to the results, it is shown that the activities of both immobilized lipases were higher than the free CALB, whereas only the activity of adsorbed lipase could approach the activity of Novozym® 435. Finally, precipitated silica and immobilized enzymes were successfully characterized by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), thermal gravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy (SEM) analyses.  In the second part of this study, the immobilized lipases were used as catalysts to polymerize ɛ-caprolactone (ɛ-CL), 7-membered lactone, via ring opening polymerization. Reactions were carried out at 40, 60, 80 ºC and 6, 24, 48, 120, 150 and 170 hour to investigate the optimum temperature and time period for PCL synthesis. Moreover, the ratio of enzyme to ɛ-caprolactone was adjusted to 2.5 %, 5 %, 10 % and 20 % (w/w), and the optimum enzyme concentration was determined for polymerization reactions catalyzed by both adsorbed and crosslinked enzymes. Molecular weights of PCLs were determined by using gel permeation chromatography (GPC) and hydrogen nuclear magnetic resonance (1H-NMR) analysis. The results showed that high molecular weights and monomer conversions of PCL catalyzed by immobilized enzyme by physical adsorption were achieved about 14300 g/mol, and 90 %, respectively. On the other hand, high molecular weights and monomer conversions of PCL catalysed by using immobilized enzyme by crosslinking were obtained about 9000 g/mol and 90 %, respectively. Furthermore, the highest molecular weights were obtained in a reaction conducted at 20 % (w/w) enzyme concentration. Reusability of both immobilized lipases were determined also by reaction cycles of polycaprolactone synthesis, and after 5 cycles uses, about 32 and 42 % of the initial activity could be retained for immobilized enzyme by physical adsorption and crosslinking methods, respectively. Additionally, the results obtained by using both immobilized lipases were compared to the molecular weights noted by using free CALB and Novozym® 435. According to this comparison study, both immobilized lipases provided higher molecular weights than the values acquired by using free CALB. Adsorbed lipase exceeded the performance of Novozym® 435, while crosslinked lipase approached about 70 % to the molecular weight obtained by using Novozym® 435. Finally, the surface morphologies of PCLs were analyzed by scanning electron microscopy. Besides, PCLs were successfully characterized by fourier transform infrared spectroscopy, thermal gravimetric analysis and differential scanning calorimetry (DSC) analysis. The characteristic peaks of PCL were shown on the graphs of these analyses. All in all, this study demonstrated immobilization of lipase improves many properties like reusability, activity and stability of free lipase. The activity of lipases increased dramatically after immobilization for both immobilized lipases compared to the activity of free CALB. Further, both immobilized enzymes was used repeatedly without a significant amount loss of their initial activity. Thus, usage of lipases in industrial applications can become more economical, and this work can contribute to “eco-friendly processes” used enzymes. Lastly, this study showed also that polycaprolactone can be synthesized via green friendly methods with high molecular weights and monomer conversion rates, and it can be definitely said that this master thesis will be contributed green polymer chemistry. en_US
dc.description.degree Yüksek Lisans tr_TR
dc.description.degree M.Sc. en_US
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11527/15378
dc.publisher Fen Bilimleri Enstitüsü tr_TR
dc.publisher Institute of Science and Technology en_US
dc.rights Kurumsal arşive yüklenen tüm eserler telif hakkı ile korunmaktadır. Bunlar, bu kaynak üzerinden herhangi bir amaçla görüntülenebilir, ancak yazılı izin alınmadan herhangi bir biçimde yeniden oluşturulması veya dağıtılması yasaklanmıştır. tr_TR
dc.rights All works uploaded to the institutional repository are protected by copyright. They may be viewed from this source for any purpose, but reproduction or distribution in any format is prohibited without written permission. en_US
dc.subject Enzimatik Polimerizasyon tr_TR
dc.subject İmmobilizasyon tr_TR
dc.subject Lipaz tr_TR
dc.subject Polikaprolakton tr_TR
dc.subject Enzymatic Polymerization en_US
dc.subject İmmobilization en_US
dc.subject Lipase en_US
dc.subject Polycaprolactone en_US
dc.title Lipaz Enziminin Çöktürülmüş Silika Üzerine İmmobilizasyonu Ve Polikaprolakton Sentezi tr_TR
dc.title.alternative Immobilization Of Lipase Enzyme Onto  Precipitated Silica And Synthesis Of Polycaprolactone en_US
dc.type Master Thesis en_US
Dosyalar
Orijinal seri
Şimdi gösteriliyor 1 - 1 / 1
thumbnail.default.alt
Ad:
10098606.pdf
Boyut:
3.89 MB
Format:
Adobe Portable Document Format
Açıklama
Lisanslı seri
Şimdi gösteriliyor 1 - 1 / 1
thumbnail.default.placeholder
Ad:
license.txt
Boyut:
3.16 KB
Format:
Plain Text
Açıklama