LEE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji-Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

http://hdl.handle.net/11527/19402

Gözat

Yazar "Özgün, Gülşah" ile LEE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji-Doktora'a göz atma
  • Öge
    Protein engineering applications on industrially important enzymes
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2019) Özgün, Gülşah ; Karagüler, Nevin Gül ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology
    Büyüyen biyoteknoloji marketi, beraberinde biyokatalizörlerin geliştirilmesi ve yeni özellikler kazandırılmasına yönelik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Endüstriyel ortamlar genellikle doğal enzimlerin kullanımı için uygun olmayan ekstrem şartlar barındırmaktadır, yüksek sıcaklık, basınç ve çok yüksek veya düşük pH gibi koşullarda, çoğunlukla doğal enzimler istenilen performansı sağlayamamaktadır. Başta protein mühendisliği olmak üzere birçok disiplin farklı endüstriyel alanlarda enzimlerin etkili bir şekilde kullanımına yönelik stratejiler geliştirmektedirler. Protein mühendisliği, endüstriyel sektörün özelliklerine ve enzimin kullanılacağı ortama bağlı olarak istenilen özelliklerin geliştirilmesinde, örneğin aktivite ve stabilitenin arttırılması, substrat veya koenzimin spesifisitesinin değiştirilmesi veya geliştirilmesi, optimum pH nın değiştirilmesi gibi stratejilere yönelik rasyonel tasarım, yönlendirilmiş evrim ve kombinasyonel uygulamaları kullanmaktadır. Protein mühendisliği stratejilerinin belirlenmesinde aynı zamanda enzime ait (yapı-fonksiyon) bilgilerin varlığı veya yokluğu etkili olmaktadır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji temeline dayanarak proteinin yapı fonksiyon ilişkisinin anlaşılmasına olanak sağlayarak, proteinin genetik düzeyde yeniden dizayn edilmesini ve istenilen özellikte biyokatalizörlerin oluşturulmasını mümkün kılar. Bu kapsamda tez, endüstriyel öneme sahip Bacillus subtilis lipazA (bsLipA) ve Candida methylica format dehidrogenaz (cmFDH) enzimlerinin üç farklı stratejinin kullanıldığı protein mühendisliği uygulamalarına odaklanmıştır. i) Optimum pH nın ii) ve koenzim spesifitesinin değiştirilmesi iii) termal stabilitenin arttırılması hedeflenen stratejiler olmuştur. Deneysel çalışmalar üç bölümde detaylandırılmıştır. Tezin birinci kısmında, bsLipA enziminin optimum pH'sının değiştirilmesi amacıyla rasyonel tasarım uygulamalarından bölgeye özel mutasyon yöntemi uygulanmıştır. Lipazlar (EC 3.1.1.3) trigliseridlerin serbest yağ asitleri ve gliserole hidrolizini gerçekleştirirlerken, aynı zamanda transesterifikasyon, aminoliziz ve asidoliziz reaksiyonlarını da katalizlerler. Mikrobiyal lipazların susuz ve az-sulu ortamlardaki potansiyeli, enzimin çok yönlü biyoteknolojik bir araç haline gelmesini sağlamıştır. Farklı endüstriyel alanlarda uygulama imkanı bulan lipazlar, son yıllarda sıvı veya süperkritik karbon dioksit (LCO2/SCCO2) gibi hijyen sistemlerinde hidrolitik enzim katkısı olarak kullanım potansiyeline sahiptir. LCO2/SCCO2 sistemlerinin temizleme etkisinin hidrolitik enzim ilavesi ile arttırılması mümkün olmasına karşın, çözgen olarak kullanılacak olan LCO2 / SCCO2' in polar olmayan bir çözgen olması ve düşük su içeriği sebebiyle, kullanılacak enzim sisteminin az sulu ve düşük pH' ya sahip çözgen sistemlerinde aktif olması beklenmektedir. Bacillus subtilis lipaz (bsLipA), geniş bir pH (4-11) aralığına sahip olmasına karşın optimum pH'sı 10'dur, bu sebeple LCO2 / SCCO2 çözgen sistemlerinde kullanımı için modifikasyonu gerekmektedir. Bacillus subtilis lipaz A (PDB ID: 1ISP) kristal yapısı ve Insight II programı kullanılarak enzimin optimum pH değişimini sağlayacak hedef mutantlar belirlenmiştir. Proteinin aktif bölgesinde katalitik özellikteki amino asitlerin pKa değerlerini etkileyebileceği düşünülen, yaklaşık 9 Å'luk mesafe içerisinde olan ve katalitik amino asitler ile doğrudan ilişkili olan amino asitlerin, bölgeye özel mutasyon tekniği ile tekli G11E, N18R, L102R, G103R, G104R, I157R mutantları oluşturulmuştur. N18R ve G103R mutantlarının template olarak kullanılması ile ikili (G11E-N18R, G103R- N18R, G103R- G11E, and G103R- G104R) mutantların da, bölgeye özel mutasyon tekniği ile oluşturulması planlanmıştır. Tezin ikinci kısmı cmFDH enziminin koenzim spesifitesinin değiştirilmesine yönelik yarı-rasyonel tasarım uygulamalarından bölge saturasyon mutagenez yöntemini kapsamaktadır. Tezin üçüncü kısmında ise cmFDH enziminin termal stabilitesinin arttırılmasına yönelik, , rasyonel tasarım uygulaması olan bölgeye özel mutasyon yöntemi uygulanmıştır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi (EC 1.2.1.2, FDH), format iyonunun karbondiokside dönüşümünü katalizlerken, NAD+ molekülünün NADH'e indirgenmesini sağlamaktadır. Gerçekleşen reaksiyonun basitliği, kullanılabilirliği, düşük maliyeti, termodinamik özellikleri ve son ürün olan CO2' in reaksiyondan kolaylıkla uzaklaştırılabilmesi gibi avantajlarından dolayı FDH, kimya endüstrisindeki kiral bileşiklerin sentezi için çok önemli olan NAD(P)H rejenerasyonunda potansiyel bir sistemdir. Fakat, doğada bulunan FDH'lerin çoğunluğunun NAD+ koenzimine spesifik olması ve düşük termal stabiliteye sahip olması, FDH'in kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sınırlandırmaların aşılması amacıyla, tezin ikinci kısmında, cmFDH enziminin koenzim spesifitesinin değiştirilmesi için koenzim bağlama bölgesinde, koenzim spesifitesinden sorumlu amino asitler, Pseodomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapıları baz alınarak, Insight II (Accelrys) programı ile oluşturulan cmFDH homoloji modeli yardımıyla belirlenmiştir. Belirlenen D195, Y196 ve Q197 bölgelerine ait dejenere primerler ile uygulanan bölge saturasyon mutagenez çalışması sonucunda her bölge için mutant kütüphaneleri oluşturulmuştur. NADP+ koenzimi ile aktivite gösteren aday mutantlar kolorimetrik tarama metoduyla belirlenmiştir. İki nesil oluşturulan adayların protein üretimi ve saflaştırılması neticesinde NADP+ koenzimine karşı olan ilgisi test edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda ikili mutantlardan D195S / Q197T ve D195S / Y196L mutant cmFDH enzimlerinin NADP+` ye karşı katalitik etkinlikleri yabanıl tip cmFDH enzimine kıyasla, sırasıyla 56000 ve 50000 kat artmıştır. Çalışmanın son kısmında, cmFDH enziminin termal stabilitesinin geliştirilmesi amacıyla, protein yüzeyindeki esnekliği yüksek olan oyuklar ve bu oyuklarda bulunan esnek amino asit kalıntıları hedef alınmıştır. Pseodomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapıları baz alınarak, ExPASy programı ile cmFDH homoloji modeli elde edilmiştir. Oluşturulan model üzerinde FIRST algoritması kullanılarak, proteinin esnek oyukları ve hedef amino asit kalıntıları belirlenmiştir. Yapılan bilgisayar çalışmaları neticesinde belirlenen 12 aday; M131A, V133I, V139W, P140R, D158N, I162V, F186L, V219M, F247A, E272W, R277N ve K301R bölgeye özel mutasyon yöntemi ile oluşturulmuştur. Mutant adayların protein üretimi ve saflaştırılması neticesinde gerçekleştirilen kinetik ve sıcaklık çalışmaları sonucunda, birinci oyukta yer alan M131A mutant enziminin, rekombinant yabani tip cmFDH enzimine kıyasla yarı ömründe 4 °C'lik bir artışla diğer mutantlar arasında en iyi termal stabilite profili gösterdiği belirlenmiştir. Bu tez kapsamında yapmış olduğumuz tüm çalışmalar, endüstriyel kullanım için enzimlerin modifikasyonunda, doğru stratejiler kullanıldığında protein mühendisliği uygulamalarının, başarı sağladığını göstermektedir.