Protein engineering applications on industrially important enzymes

Abstract

Büyüyen biyoteknoloji marketi, beraberinde biyokatalizörlerin geliştirilmesi ve yeni özellikler kazandırılmasına yönelik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Endüstriyel ortamlar genellikle doğal enzimlerin kullanımı için uygun olmayan ekstrem şartlar barındırmaktadır, yüksek sıcaklık, basınç ve çok yüksek veya düşük pH gibi koşullarda, çoğunlukla doğal enzimler istenilen performansı sağlayamamaktadır. Başta protein mühendisliği olmak üzere birçok disiplin farklı endüstriyel alanlarda enzimlerin etkili bir şekilde kullanımına yönelik stratejiler geliştirmektedirler. Protein mühendisliği, endüstriyel sektörün özelliklerine ve enzimin kullanılacağı ortama bağlı olarak istenilen özelliklerin geliştirilmesinde, örneğin aktivite ve stabilitenin arttırılması, substrat veya koenzimin spesifisitesinin değiştirilmesi veya geliştirilmesi, optimum pH nın değiştirilmesi gibi stratejilere yönelik rasyonel tasarım, yönlendirilmiş evrim ve kombinasyonel uygulamaları kullanmaktadır. Protein mühendisliği stratejilerinin belirlenmesinde aynı zamanda enzime ait (yapı-fonksiyon) bilgilerin varlığı veya yokluğu etkili olmaktadır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji temeline dayanarak proteinin yapı fonksiyon ilişkisinin anlaşılmasına olanak sağlayarak, proteinin genetik düzeyde yeniden dizayn edilmesini ve istenilen özellikte biyokatalizörlerin oluşturulmasını mümkün kılar. Bu kapsamda tez, endüstriyel öneme sahip Bacillus subtilis lipazA (bsLipA) ve Candida methylica format dehidrogenaz (cmFDH) enzimlerinin üç farklı stratejinin kullanıldığı protein mühendisliği uygulamalarına odaklanmıştır. i) Optimum pH nın ii) ve koenzim spesifitesinin değiştirilmesi iii) termal stabilitenin arttırılması hedeflenen stratejiler olmuştur. Deneysel çalışmalar üç bölümde detaylandırılmıştır. Tezin birinci kısmında, bsLipA enziminin optimum pH'sının değiştirilmesi amacıyla rasyonel tasarım uygulamalarından bölgeye özel mutasyon yöntemi uygulanmıştır. Lipazlar (EC 3.1.1.3) trigliseridlerin serbest yağ asitleri ve gliserole hidrolizini gerçekleştirirlerken, aynı zamanda transesterifikasyon, aminoliziz ve asidoliziz reaksiyonlarını da katalizlerler. Mikrobiyal lipazların susuz ve az-sulu ortamlardaki potansiyeli, enzimin çok yönlü biyoteknolojik bir araç haline gelmesini sağlamıştır. Farklı endüstriyel alanlarda uygulama imkanı bulan lipazlar, son yıllarda sıvı veya süperkritik karbon dioksit (LCO2/SCCO2) gibi hijyen sistemlerinde hidrolitik enzim katkısı olarak kullanım potansiyeline sahiptir. LCO2/SCCO2 sistemlerinin temizleme etkisinin hidrolitik enzim ilavesi ile arttırılması mümkün olmasına karşın, çözgen olarak kullanılacak olan LCO2 / SCCO2' in polar olmayan bir çözgen olması ve düşük su içeriği sebebiyle, kullanılacak enzim sisteminin az sulu ve düşük pH' ya sahip çözgen sistemlerinde aktif olması beklenmektedir. Bacillus subtilis lipaz (bsLipA), geniş bir pH (4-11) aralığına sahip olmasına karşın optimum pH'sı 10'dur, bu sebeple LCO2 / SCCO2 çözgen sistemlerinde kullanımı için modifikasyonu gerekmektedir. Bacillus subtilis lipaz A (PDB ID: 1ISP) kristal yapısı ve Insight II programı kullanılarak enzimin optimum pH değişimini sağlayacak hedef mutantlar belirlenmiştir. Proteinin aktif bölgesinde katalitik özellikteki amino asitlerin pKa değerlerini etkileyebileceği düşünülen, yaklaşık 9 Å'luk mesafe içerisinde olan ve katalitik amino asitler ile doğrudan ilişkili olan amino asitlerin, bölgeye özel mutasyon tekniği ile tekli G11E, N18R, L102R, G103R, G104R, I157R mutantları oluşturulmuştur. N18R ve G103R mutantlarının template olarak kullanılması ile ikili (G11E-N18R, G103R- N18R, G103R- G11E, and G103R- G104R) mutantların da, bölgeye özel mutasyon tekniği ile oluşturulması planlanmıştır. Tezin ikinci kısmı cmFDH enziminin koenzim spesifitesinin değiştirilmesine yönelik yarı-rasyonel tasarım uygulamalarından bölge saturasyon mutagenez yöntemini kapsamaktadır. Tezin üçüncü kısmında ise cmFDH enziminin termal stabilitesinin arttırılmasına yönelik, , rasyonel tasarım uygulaması olan bölgeye özel mutasyon yöntemi uygulanmıştır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi (EC 1.2.1.2, FDH), format iyonunun karbondiokside dönüşümünü katalizlerken, NAD+ molekülünün NADH'e indirgenmesini sağlamaktadır. Gerçekleşen reaksiyonun basitliği, kullanılabilirliği, düşük maliyeti, termodinamik özellikleri ve son ürün olan CO2' in reaksiyondan kolaylıkla uzaklaştırılabilmesi gibi avantajlarından dolayı FDH, kimya endüstrisindeki kiral bileşiklerin sentezi için çok önemli olan NAD(P)H rejenerasyonunda potansiyel bir sistemdir. Fakat, doğada bulunan FDH'lerin çoğunluğunun NAD+ koenzimine spesifik olması ve düşük termal stabiliteye sahip olması, FDH'in kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sınırlandırmaların aşılması amacıyla, tezin ikinci kısmında, cmFDH enziminin koenzim spesifitesinin değiştirilmesi için koenzim bağlama bölgesinde, koenzim spesifitesinden sorumlu amino asitler, Pseodomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapıları baz alınarak, Insight II (Accelrys) programı ile oluşturulan cmFDH homoloji modeli yardımıyla belirlenmiştir. Belirlenen D195, Y196 ve Q197 bölgelerine ait dejenere primerler ile uygulanan bölge saturasyon mutagenez çalışması sonucunda her bölge için mutant kütüphaneleri oluşturulmuştur. NADP+ koenzimi ile aktivite gösteren aday mutantlar kolorimetrik tarama metoduyla belirlenmiştir. İki nesil oluşturulan adayların protein üretimi ve saflaştırılması neticesinde NADP+ koenzimine karşı olan ilgisi test edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda ikili mutantlardan D195S / Q197T ve D195S / Y196L mutant cmFDH enzimlerinin NADP+` ye karşı katalitik etkinlikleri yabanıl tip cmFDH enzimine kıyasla, sırasıyla 56000 ve 50000 kat artmıştır. Çalışmanın son kısmında, cmFDH enziminin termal stabilitesinin geliştirilmesi amacıyla, protein yüzeyindeki esnekliği yüksek olan oyuklar ve bu oyuklarda bulunan esnek amino asit kalıntıları hedef alınmıştır. Pseodomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapıları baz alınarak, ExPASy programı ile cmFDH homoloji modeli elde edilmiştir. Oluşturulan model üzerinde FIRST algoritması kullanılarak, proteinin esnek oyukları ve hedef amino asit kalıntıları belirlenmiştir. Yapılan bilgisayar çalışmaları neticesinde belirlenen 12 aday; M131A, V133I, V139W, P140R, D158N, I162V, F186L, V219M, F247A, E272W, R277N ve K301R bölgeye özel mutasyon yöntemi ile oluşturulmuştur. Mutant adayların protein üretimi ve saflaştırılması neticesinde gerçekleştirilen kinetik ve sıcaklık çalışmaları sonucunda, birinci oyukta yer alan M131A mutant enziminin, rekombinant yabani tip cmFDH enzimine kıyasla yarı ömründe 4 °C'lik bir artışla diğer mutantlar arasında en iyi termal stabilite profili gösterdiği belirlenmiştir. Bu tez kapsamında yapmış olduğumuz tüm çalışmalar, endüstriyel kullanım için enzimlerin modifikasyonunda, doğru stratejiler kullanıldığında protein mühendisliği uygulamalarının, başarı sağladığını göstermektedir.

The growing biotechnology market has led to increased efforts to evolve biocatalysts (enzymes and whole cells) and to acquire new features. Industrial environments often have extreme conditions which are not suitable for the use of natural enzymes, and in conditions such as high temperature, pressure and very high or low pH, most of them can not provide the desired performance. Many disciplines especially protein engineering, are improving strategies for the efficient use of enzymes in different industrial fields. Depending on the characteristics of the industrial sector and the availability of the enzymes, protein engineering uses rational design, directed evolution and combinational practices in the development of desired properties, such as increased activity and stability, altering or improving the substrate or coenzyme specificity, and shifting the optimum pH. Also, the presence or absence of enzymatic information (structure-function) is influential in determining protein engineering strategies to be implemented. According to protein engineering applications, here, we have focused on three different strategies; shifting optimum pH, changing coenzyme specificity and increasing thermostability. These strategies were applied to two industrially important enzymes namely; Bacillus subtilis lipase A (bsLipA) and Candida methylica formate dehydrogenase (cmFDH). This thesis details two of the protein engineering approaches; site-directed mutagenesis and site-saturation mutagenesis to produce novel bsLipA and cmFDH. The experimental work was described in three sections. In the first section, sitedirected mutagenesis was applied to change the optimum pH of bsLipA enzyme. In the second and third sections, site-saturation mutagenesis and site-directed mutagenesis were applied to change coenzyme specificity and increase the thermostability of cmFDH enzyme, respectively. In the first part of the study, we aim to change the optimum pH of the bsLipA to develop active and stable, novel lipase enzyme in supercritical carbon dioxide systems (SCCO2 ) which are the most applicable for novel hygiene technologies. Lipases (glycerol ester hydrolyzes EC 3.1.1.3); belong to the family of hydrolases which act on carboxylic ester bonds and they catalyze the hydrolysis of triglycerides into diglycerides, monoglycerides, fatty acids, glycerol. The lipases have significant application potentials in different industrial fields, and one of them is as hydrolytic enzyme additives in the SCCO2 hygiene systems. SCCO2 are highly desirable as alternative solvents for hygiene systems and the combination of SCCO2 technology with the modified hydrolytic enzymes will improve the utility of the system. Among the advantages of the system, SCCO2 solvent creates an extreme environment (low pH and low water content), although Lipase A has a wide pH range (4-11), it shows optimum activity at pH 10.0 that means need to be modified. In order to modify the optimum pH of bsLipA enzyme, charge reversal mutations were created at about 9Ǻ from the catalytic site of the enzyme. Computational studies were carried based on Bacillus subtilis Lipase A (PDB ID:1ISP) and by using Insight II program. According to the calculation of  pKa of H156 and S77, target residues are determined. Single mutants (G11E, N18R, L102R, G103R, G104R, and I157R) were constructed by site-directed mutagenesis. Double mutants (G11E-N18R, G103R- N18R, G103R- G11E, and G103R- G104R) would be constructed by site-directed mutagenesis using mutant N18R and and G103R as a template DNA. In the second and the last parts of the study, we aimed to modify Candida methylica formate dehydrogenase to change the coenzyme specificity and to increase the thermostability of the enzyme. The NAD+-dependent formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2, FDH ) catalyzes the oxidation of formate anion into carbon dioxide, coupled with the reduction of NAD+ to NADH. Because of the advantages of the reaction, FDH becomes a potential NAD(P)H regeneration system which is crucial for the synthesis of chiral compounds in the chemical industry. Besides the advantages, being highly specific to NAD+ coenzyme and having low thermal stability limits the FDH. In the second part of the study, to overcome the limited coenzyme specificity of cmFDH, site saturation mutagenesis was applied to the residues; D195, Y196, and Q197,which were determined by using Insight II (Accelrys) program on a homology model of cmFDH based on psFDH (sp.101) and cbFDH crystal structure at the NAD+ binding domain. These residues are critical for the NAD+ binding domain. The efficient mutants have been selected by colorimetric screening assay. After construction of two-generation libraries, two double mutants D195S / Q197T and D195S / Y196L increased the overall catalytic efficiency towards NADP+ to 56000 and 50000-fold, respectively. In the last part of the study, to increase the thermal stability of cmFDH, site-directed mutagenesis was applied to 12 amino acid residues ( M131A, V133I, V139W, P140R, D158N, I162V, F186L, V219M, F247A, E272W, R277N, and K301R) which were predicted by analyzing protein cavities and their flexibility through the computational studies. Among them, the mutant M131A, which includes amino acid changes in Cavity 1 shows the best thermostable profile among the other mutants with a 4 ºC increase in the half-life of the cmFDH enzyme. All the studies have shown that, along with the right strategies, the right protein engineering practices ensure success in the modification of enzymes for industrial usage.