LEE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji-Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

http://hdl.handle.net/11527/19402

Gözat

Şimdi gösteriliyor 1 - 2 / 2

Investigation of the effect of ATP13A2 (PARK9) frameshift mutation on the protein function

(Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, 2021) Kırımtay, Koray ; Karabay Korkmaz, Arzu ; 692806 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji

Neurodegenerative diseases occur due to deformations in the nervous system as a result of structural and functional disorders in nerve cells. In practice, neurodegenerative diseases are classified according to clinical and pathological findings. Genetic and epigenetic factors play essential roles on the basis of the disease pathology. Mutations that occur in different genes or at various points in the same gene act at the onset of the disease by acting on different molecular mechanisms. In many neurodegenerative diseases, overlapping clinical findings at the beginning and progression of the disease are the most critical limiting factors in making the correct diagnosis in these diseases. Rare neurodegenerative disorders, such as complex Hereditary Spastic Paraplegia (HSP), Spino-cerebellar Ataxia (SCA), and Kufor-Rakeb syndrome (KRS), have many common symptoms. Spastic Paraplegia-78, a subtype of HSP, and KRS have been associated with mutations in the ATP13A2 gene. In these two diseases that are inherited in autosomal recessive manner, different mutations in the ATP13A2 gene cause many common symptoms, making clinical diagnosis difficult. Genetic and functional molecular studies are important for the accurate diagnosis of the disease. Within the scope of this thesis, two cases in a consanguineous Turkish family were examined genetically and cellularly. Clinically, patients were diagnosed with "autosomal recessive spastic paraparesis" and/or "autosomal recessive ataxia" due to the observation of spasticity, cerebral and cerebellar atrophy. In this thesis, gene mutations associated with the disease were screened by whole-exome sequencing in the family. Three variants of the ATP13A2 gene ("c.1422_1423del: p.P474fs", "c.G1426T: p.A476S" and "c.1429_1430insAAA: p.M477delinsKM") were detected as a result of whole-exome sequencing. The bioinformatics analysis determined that the "c.1422_1423del: p.P474fs" variant caused a frameshift and a premature termination codon. It was determined that the premature termination codon formed by the effect of frameshift causes the loss of N and P regions necessary for phosphorylation, which is important in the function of the ATP13A2 protein, resulting in the formation of a truncated protein of 519 amino acids. Following these data, ATP13A2 expression in primary fibroblast cells obtained from patients, their parents, and a healthy control was examined by qRT-PCR and Western blot method. According to the qRT-PCR result, it was determined that ATP13A2 mRNA was reduced by 60-70% in patients' fibroblasts compared to control fibroblasts. ATP13A2 mRNA was observed to decrease by 5-20% in the fibroblasts of the parents. When protein expression was examined by Western blot method, wild-type ATP13A2 protein with a molecular weight of 150 kDa was detected in the fibroblasts of control and parents. In comparison, the expected truncated protein around 50 kDa was not detected in the patient fibroblasts. The reason for not observing the truncated protein could possibly be to the fact that the produced truncated protein might have been degraded by proteasome machinery due to misfolding. In this context, truncated protein expression was investigated by inhibiting the proteasome mechanism with MG132. According to the Western blot result, mutant protein expression was not observed after MG132 application. Besides, BiP and PDI, which are endoplasmic chaperone proteins involved in protein folding, expressions were also examined, and no difference was observed in the expression of these two proteins. These results highlighted the possibility that the mutant ATP13A2 mRNA was targeted and degraded by NMD. To examine whether NMD degraded the mutant ATP13A2 mRNA, 5-azacytidine, which was shown to cause NMD inhibition by c-myc, was applied to fibroblasts. After 5-azacytidine administration, it was observed that the mutant ATP13A2 protein was expressed in patients' fibroblasts. However, the increase in both mRNA and protein levels in control fibroblast cells that do not carry mutations suggested that 5-azacytidine acts by a different mechanism independent of NMD. It is known in the literature that 5-azacytidine increases c-myc expression. Accordingly, after the 5-azacytidine treatment, c-myc expression was examined by Western blot, and an increase in c-myc expression was observed. In addition, the mutant ATP13A2 expression was detected in fibroblast cells differentiated from the patient's induced pluripotent stem cells in which c-myc had been expressing due to the presence of c-myc expressing Sendai virus. The reason for the increased ATP13A2 expression in both patient fibroblasts and control fibroblasts after 5-azacytidine suggested that the gene expression by c-myc may be transcriptionally regulated. When the ATP13A2 gene's promoter region was examined, the putative c-myc transcription factor binding sites were determined. These findings strengthen the possibility that the ATP13A2 gene can be regulated by c-myc. After 5-azacytidine treatment, NMD-independent increase in ATP13A2 expression was observed, fibroblasts were treated with NMDI-14, a specific NMD inhibitor, and a 2-fold increase in ATP13A2 mRNA level was observed in patient fibroblasts. In addition, mutant protein expression was detected in patients' fibroblasts. After determining that ATP13A2 protein was not expressed as a result of the mutation in the patients, based on the hypointense basal ganglion images on MRI, iron accumulation was examined by Prussian blue staining in the patient fibroblasts. Iron accumulation was found in the patient fibroblasts after staining. Later, the effect of iron deposition on cell viability was investigated by the MTT assay. It was found that patient fibroblasts were more sensitive to iron overload. It is known that increased intracellular iron increases reactive oxygen species and triggers oxidative stress. In the presence of oxidative stress, the Nrf2 transcription factor is localized to the nucleus and provides the expression of several genes involved in oxidative stress defense. For this reason, the intracellular localization of Nrf2 was examined by immunocytochemistry. It was observed that Nrf2 was localized in the nucleus in the patient's fibroblasts, while it was mostly cytoplasmic in the parents' fibroblasts. These data show that patients have iron overload and oxidative stress due to accumulation.
Protein engineering applications on industrially important enzymes

(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2019) Özgün, Gülşah ; Karagüler, Nevin Gül ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology

Büyüyen biyoteknoloji marketi, beraberinde biyokatalizörlerin geliştirilmesi ve yeni özellikler kazandırılmasına yönelik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Endüstriyel ortamlar genellikle doğal enzimlerin kullanımı için uygun olmayan ekstrem şartlar barındırmaktadır, yüksek sıcaklık, basınç ve çok yüksek veya düşük pH gibi koşullarda, çoğunlukla doğal enzimler istenilen performansı sağlayamamaktadır. Başta protein mühendisliği olmak üzere birçok disiplin farklı endüstriyel alanlarda enzimlerin etkili bir şekilde kullanımına yönelik stratejiler geliştirmektedirler. Protein mühendisliği, endüstriyel sektörün özelliklerine ve enzimin kullanılacağı ortama bağlı olarak istenilen özelliklerin geliştirilmesinde, örneğin aktivite ve stabilitenin arttırılması, substrat veya koenzimin spesifisitesinin değiştirilmesi veya geliştirilmesi, optimum pH nın değiştirilmesi gibi stratejilere yönelik rasyonel tasarım, yönlendirilmiş evrim ve kombinasyonel uygulamaları kullanmaktadır. Protein mühendisliği stratejilerinin belirlenmesinde aynı zamanda enzime ait (yapı-fonksiyon) bilgilerin varlığı veya yokluğu etkili olmaktadır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji temeline dayanarak proteinin yapı fonksiyon ilişkisinin anlaşılmasına olanak sağlayarak, proteinin genetik düzeyde yeniden dizayn edilmesini ve istenilen özellikte biyokatalizörlerin oluşturulmasını mümkün kılar. Bu kapsamda tez, endüstriyel öneme sahip Bacillus subtilis lipazA (bsLipA) ve Candida methylica format dehidrogenaz (cmFDH) enzimlerinin üç farklı stratejinin kullanıldığı protein mühendisliği uygulamalarına odaklanmıştır. i) Optimum pH nın ii) ve koenzim spesifitesinin değiştirilmesi iii) termal stabilitenin arttırılması hedeflenen stratejiler olmuştur. Deneysel çalışmalar üç bölümde detaylandırılmıştır. Tezin birinci kısmında, bsLipA enziminin optimum pH'sının değiştirilmesi amacıyla rasyonel tasarım uygulamalarından bölgeye özel mutasyon yöntemi uygulanmıştır. Lipazlar (EC 3.1.1.3) trigliseridlerin serbest yağ asitleri ve gliserole hidrolizini gerçekleştirirlerken, aynı zamanda transesterifikasyon, aminoliziz ve asidoliziz reaksiyonlarını da katalizlerler. Mikrobiyal lipazların susuz ve az-sulu ortamlardaki potansiyeli, enzimin çok yönlü biyoteknolojik bir araç haline gelmesini sağlamıştır. Farklı endüstriyel alanlarda uygulama imkanı bulan lipazlar, son yıllarda sıvı veya süperkritik karbon dioksit (LCO2/SCCO2) gibi hijyen sistemlerinde hidrolitik enzim katkısı olarak kullanım potansiyeline sahiptir. LCO2/SCCO2 sistemlerinin temizleme etkisinin hidrolitik enzim ilavesi ile arttırılması mümkün olmasına karşın, çözgen olarak kullanılacak olan LCO2 / SCCO2' in polar olmayan bir çözgen olması ve düşük su içeriği sebebiyle, kullanılacak enzim sisteminin az sulu ve düşük pH' ya sahip çözgen sistemlerinde aktif olması beklenmektedir. Bacillus subtilis lipaz (bsLipA), geniş bir pH (4-11) aralığına sahip olmasına karşın optimum pH'sı 10'dur, bu sebeple LCO2 / SCCO2 çözgen sistemlerinde kullanımı için modifikasyonu gerekmektedir. Bacillus subtilis lipaz A (PDB ID: 1ISP) kristal yapısı ve Insight II programı kullanılarak enzimin optimum pH değişimini sağlayacak hedef mutantlar belirlenmiştir. Proteinin aktif bölgesinde katalitik özellikteki amino asitlerin pKa değerlerini etkileyebileceği düşünülen, yaklaşık 9 Å'luk mesafe içerisinde olan ve katalitik amino asitler ile doğrudan ilişkili olan amino asitlerin, bölgeye özel mutasyon tekniği ile tekli G11E, N18R, L102R, G103R, G104R, I157R mutantları oluşturulmuştur. N18R ve G103R mutantlarının template olarak kullanılması ile ikili (G11E-N18R, G103R- N18R, G103R- G11E, and G103R- G104R) mutantların da, bölgeye özel mutasyon tekniği ile oluşturulması planlanmıştır. Tezin ikinci kısmı cmFDH enziminin koenzim spesifitesinin değiştirilmesine yönelik yarı-rasyonel tasarım uygulamalarından bölge saturasyon mutagenez yöntemini kapsamaktadır. Tezin üçüncü kısmında ise cmFDH enziminin termal stabilitesinin arttırılmasına yönelik, , rasyonel tasarım uygulaması olan bölgeye özel mutasyon yöntemi uygulanmıştır. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimi (EC 1.2.1.2, FDH), format iyonunun karbondiokside dönüşümünü katalizlerken, NAD+ molekülünün NADH'e indirgenmesini sağlamaktadır. Gerçekleşen reaksiyonun basitliği, kullanılabilirliği, düşük maliyeti, termodinamik özellikleri ve son ürün olan CO2' in reaksiyondan kolaylıkla uzaklaştırılabilmesi gibi avantajlarından dolayı FDH, kimya endüstrisindeki kiral bileşiklerin sentezi için çok önemli olan NAD(P)H rejenerasyonunda potansiyel bir sistemdir. Fakat, doğada bulunan FDH'lerin çoğunluğunun NAD+ koenzimine spesifik olması ve düşük termal stabiliteye sahip olması, FDH'in kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sınırlandırmaların aşılması amacıyla, tezin ikinci kısmında, cmFDH enziminin koenzim spesifitesinin değiştirilmesi için koenzim bağlama bölgesinde, koenzim spesifitesinden sorumlu amino asitler, Pseodomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapıları baz alınarak, Insight II (Accelrys) programı ile oluşturulan cmFDH homoloji modeli yardımıyla belirlenmiştir. Belirlenen D195, Y196 ve Q197 bölgelerine ait dejenere primerler ile uygulanan bölge saturasyon mutagenez çalışması sonucunda her bölge için mutant kütüphaneleri oluşturulmuştur. NADP+ koenzimi ile aktivite gösteren aday mutantlar kolorimetrik tarama metoduyla belirlenmiştir. İki nesil oluşturulan adayların protein üretimi ve saflaştırılması neticesinde NADP+ koenzimine karşı olan ilgisi test edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda ikili mutantlardan D195S / Q197T ve D195S / Y196L mutant cmFDH enzimlerinin NADP+` ye karşı katalitik etkinlikleri yabanıl tip cmFDH enzimine kıyasla, sırasıyla 56000 ve 50000 kat artmıştır. Çalışmanın son kısmında, cmFDH enziminin termal stabilitesinin geliştirilmesi amacıyla, protein yüzeyindeki esnekliği yüksek olan oyuklar ve bu oyuklarda bulunan esnek amino asit kalıntıları hedef alınmıştır. Pseodomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapıları baz alınarak, ExPASy programı ile cmFDH homoloji modeli elde edilmiştir. Oluşturulan model üzerinde FIRST algoritması kullanılarak, proteinin esnek oyukları ve hedef amino asit kalıntıları belirlenmiştir. Yapılan bilgisayar çalışmaları neticesinde belirlenen 12 aday; M131A, V133I, V139W, P140R, D158N, I162V, F186L, V219M, F247A, E272W, R277N ve K301R bölgeye özel mutasyon yöntemi ile oluşturulmuştur. Mutant adayların protein üretimi ve saflaştırılması neticesinde gerçekleştirilen kinetik ve sıcaklık çalışmaları sonucunda, birinci oyukta yer alan M131A mutant enziminin, rekombinant yabani tip cmFDH enzimine kıyasla yarı ömründe 4 °C'lik bir artışla diğer mutantlar arasında en iyi termal stabilite profili gösterdiği belirlenmiştir. Bu tez kapsamında yapmış olduğumuz tüm çalışmalar, endüstriyel kullanım için enzimlerin modifikasyonunda, doğru stratejiler kullanıldığında protein mühendisliği uygulamalarının, başarı sağladığını göstermektedir.

Gözat

Son Başvurular