FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Gözat
Yazar "Binay, Barış" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeEndüstriyel Uygulamalar İçin Yeni Biyokatalizörlerin Geliştirilmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-02-22) Binay, Barış ; Karagüler, Nevin Gül ; 0 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsKüresel ısınma odaklı tartışmalar ve bu konuda oluşan kaygılar son yıllarda bilim insanları ve toplum içinde giderek artmaktadır. Bu durum, petrol kaynaklı üretimler yerine yenilenebilir biyolojik kaynaklara yönelimi teşvik etmektedir. “Yeşil proses” olarak adlandırılabilecek biyokatalizörlerin farklı endüstriyel alanlarda kullanımının önemi yakın zamanda idrak edilmiştir. Kimyasal katalizörler yerine hayvansal, bitkisel ve bakteriyel kaynaklardan elde edilen enzimlerin kullanımı endüstriyel proseslerde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Kiral merkezli moleküllerin sentezi kimyasal yöntemlerle gerçekleştirildiğinde rasemik karışımlar elde edilmektedir. Enzimatik reaksiyonlar ise enantiomerik saflıkta ürün üretimine imkan verdiklerinden, biyokatalizörlerin kiral bileşik üretiminde kullanılması çok uygundur. Biyokatalizör kullanımının diğer avantajları enzimlerin biyobozunur olmaları, katalizledikleri reaksiyonda stereo-seçici, bölgesel-seçici ve kimyasal-seçici davranmaları, görece düşük sıcaklıkta, ılıman pH ve basınç koşullarında fonksiyon göstermeleri ve çevre dostu olmaları şeklinde sıralanabilir. Bu avantajlarından dolayı biyokatalizörlerin tıp, kimya, gıda üretimi ve tarım endüstrilerinde kullanım alanları giderek artmaktadır. Fakat doğal çevreden izole edilen enzimlerin doğrudan endüstriyel proseslerde kullanılabilmeleri herzaman mümkün olmamaktadır. Enzim karakteristik özelliklerinin (aktivite, stabilite, çözünürlük, substrat ve koenzim seçiciliği ve optimum pH aralığı) sıklıkla ilgili endüstriyel üretime göre optimize edilmesi gerekmektedir. Protein mühendisliği yöntemleri, ilgili proses koşullarına uygun enzimlerin dizayn edilmesine olanak tanımaktadır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji tekniklerinin kullanılması yolu ile enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının moleküler düzeyde anlaşılıp, genetik yapılarının değiştirilerek, istenilen yapı ve fonksiyona sahip yeni enzimlerin üretilmesini mümkün kılmaktadır. Burada, endüstriyel öneme sahip olan Bacillus stearothermophillus laktat dehidrogenaz (bsLDH) ve Rhodotorula graminis fenilalanin liyaz (rgPAL) olarak adlandırılan enzimlerin substrat özgüllüklerinin iyileştirilmesini hedefledik. Bu iki enzimin özelliklerinin iyileştirilmesi için protein mühendisliğinin üç yöntemi uygulanmıştır; DNA shuffling (DNA karıştırma), bölgeye özel mutasyon yaklaşımları ile kombinatoryal saturasyon aktif bölge testi (CASTing). bsLDH’ın substrat spesifikliği, DNA karıştırma ve bölgeye özel mutasyon yaklaşımları ile başarıyla değiştirilmiştir. rgPAL’ın aktivitesi ise seçilen farklı substratlara karsı CASTing yöntemi kullanılarak arttırılmıştır. Bu tez kapsamında yeni bsLDH ve rgPAL proteinlerinin üretilmesine yönelik farklı stratejiler detaylı bir şekilde incelenmiştir. Üç deneysel bölümden oluşan tezin ilk iki bölümü bsLDH’ın düzenlenmesini tanımlarken, son bölüm rgPAL için CASTing metodunun uygulanmasını açıklamaktadır. bsLDH, okzo-asitlerin (pirüvat) hidroksi asitlere (laktat) karşılıklı dönüşüm reaksiyonunu NADH/NAD+ çiftini redoks kofaktörü olarak kullanarak katalizler. Enzim, eczacılık ve tarım alanında anahtar role sahip kiral moleküllerin sentezinde kullanılan ara ürünlerin üretiminde kullanıldığından ticari öneme sahiptir. İlgili okzo-asitlerin kiral hidroksi asitlerinin yüksek stereokimyasal seçicilikle üretilmesine imkan vermesine rağmen; bsLDH enziminin en önemli dezavantajı son derece sınırlı substrat özgüllüğüne sahip olmasıdır. Tezin ilk kısmında; bsLDH’ın substrat seçiciliğini değiştirmek için DNA karışım yöntemi kullanılmıştır. DNA karışım yöntemi ile elde edilen rekombinant mutant bsLDH kolonilerinden, malatın oksidasyonunu katalizleyebilenler uygun tarama ve seçme test yöntemi kullanılarakdiğerlerinden ayırt edilmişlerdir. Yönlendirilmiş evrim sonucunda sekiz (8) tane amino asit değişimine - Asn4Gln, Ser19Thr, Gln86Arg, Thr91Ser, Ala173Val, Glu183Asp,Gln221Asn ve Val267Thr- sahip olan mutant bsLDH proteininin substrat seçiciliğini pirüvat/laktatdan okzaloasetat/malata değiştirmiştir. Bahsedilen sekiz mutasyonun bsLDH’de malat dehidrogenaz aktivitesi oluşumuna neden olduğu ve malatın oksidasyonunu, pirüvata kıyasla 1009 kat daha hızlı olacak şekilde gerçekleştirdiği görülmüştür. Bu sonuç, yapı bilgisi kullanılarak yüksek verimli tekli mutasyonlarla hedeflenenin gerçekleştirildiği tasarımlara göre, yönlendirilmiş evrimin de özgüllüklerde yüksek değişikliklere yol açabileceğini göstermiştir. Tezin ikinci kısmında; X-ışını kristal yapısı ve biriken literatür bilgisi kullanılarak bsLDH rasyonel olarakmandelik asitle reaksiyona girecek şekilde dizayn edilmiştir. Mandelat dehidrogenaz aktivitesi, InsightII moleküler modelleme programı kullanılarak; bsLDH enziminde oluşturulmuştur. Modelleme programı enerji minimizasyonu sonucunda; Thr246Gly ve Ile240Ala mutasyonları ile bsLDH enziminin L-mandelik asidi substrat olarak kullanabileceği gösterilmiştir. Mutanlar oluşturulmuş ve mutant gen E.coli‘ye aktarılarak sentezi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca mutant ve doğal bsLDH‘i saflaştırmak için TAGZyme saflaştırma sistemi oluşturulmuştur. Rasyonel olarak tasarlanan bsLDH’ın aktivitesi mandelat varlığında ölçülmüştür. Enzim kinetiği sonuçları, bu iki mutasyonun, yüksek saflıkta elde edilen mutant bsLDH’ın substrat özgüllüğünü laktatdan L-mandelik asite dönüştürdüğünü göstermiştir. Tezin son kısmında; E.coli’ye ekspresyon vektörüyle klonlanmış Rhodotorula graminis kaynaklı fenilalanin amonyum liyaz (rgPAL) enziminin doğal olmayan amino asitlere karşı aktivite kazandırılmasını amaçladık. PAL, oksijensiz ortamda L-fenilalaninin trans-sinamik aside dönüşümünü katalizlemektedir. Bu reaksiyonun geri dönüşüm reaksiyonu, farmakoper olarak birçok peptidomimetrik ilaç molekülünün üretiminde L-fenilalanin analoglarının sentezinde kullanıldığından, enzim kimya endüstrisinde özel bir öneme sahiptir. Yarı rasyonel dizayn olarak değerlendirilen CASTing metodu çerçevesinde, her bir kütüphane için en az iki tane amino asit içeren beş kütüphane oluşturulmuştur. NRT yıkıcı kodon olarak bütün kütüphaneler için kullanılmıştır. 2000 koloni, geliştirilen protokol 1 ile taranmıştır. Birçok tarama adımından sonra seçilen substrata karşı yüksek aktivite gösteren dört rgPAL varyantı belirlenmiştir. PAL varyantlarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için iki tane test yöntemi geliştirilmiştir. Birinci test yöntemi, elde edilen kütüphaneleri taramak ve oluşan trans sinamik asit (t-CA) miktarını ölçmek için uygulanmıştır. İkinci test yönteminde ise, belirleyici enzim olarak kullanılan oksidaz enzimi, PAL enzimleri tarafından üretilen fenilalaninin miktarının niceleyici olarak ölçülmesine olanak tanıyacak şekilde eşleştirilmiştir. Uygun saflaştırma prosesleri sonrasında, mutant bsLDH ve rgPAL enzimleri kinetik olarak karakterize edilmişlerdir. Enzim kinetiği çalışmaları, bsLDH ve rgPAL enzimlerinin substrat özgüllüklerinin başarılı bir şekilde değiştirildiğini göstermiştir. Elde edilen bu sonuçlar, uygun strateji uygulandığında protein mühendisliğinin, enzimlerin yeniden tasarlanmasında çok güçlü bir teknoloji olduğunu göstermiştir.