FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

http://hdl.handle.net/11527/182

Gözat

Yazar "Arslan, Mevlüt" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma
  • Öge
    Molecular and physiological investigation of longevity in yeast
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017) Arslan, Mevlüt ; Çakar, Zeynep Petek ; 10177821 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology
    Dünya popülasyonu, hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde, doğum ve ölüm oranlarındaki azalmadan dolayı, görece olarak yaşlanmaktadır. Bu durum büyük bir sorun oluşturmaktadır. Zamanla hücrelerin fizyolojik fonksiyonlarında gerçekleşen kayıplar nedeniyle yaşlanma; Alzheimer, Parkinson, diyabet, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar gibi bazı ciddi hastalıklar için bir risk faktörüdür. Son yıllarda araştırmacılar, artan sosyoekonomik kaygılardan dolayı bu sorun üzerine odaklanmaktadırlar. Bu çalışmalardaki amaç, hücresel yaşlanma sürecinin anlaşılması ve sağlıklı bir yaşam sağlanmasıdır. Yaşlanma araştırmalarında Saccharomyces cerevisiae mayası, Drosophila melanogaster sineği, Caenorhabditis elegans kurdu, kemirgenler ve primatlar model organizma olarak kullanılmaktadır. S. cerevisiae mayası tek hücreli ökaryotik bir mikroorganizmadır ve eski zamanlardan beri; ekmek, şarap ve bira yapımı gibi endüstriyel alanlarda kullanılmaktadır. S. cerevisiae, genetik ve moleküler biyolojik araştırmalarda pahalı ve özel besiyerlerine ve de kültür koşullarına gerek duymadığı için bir ökaryotik model organizma olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. S. cerevisiae mayası yaşlanma çalışmalarında; yaşam süresinin kısalığı, genom dizi verileri, memeli hücrelerine benzerliği ve mevcut olan kapsamlı moleküler araç ve tekniklerinden dolayı yaygın olarak tercih edilen bir model organizmadır. Yaşlanma çalışmaları, S. cerevisiae'da kronolojik yaşam süresi ve replikatif yaşam süresinin incelenmesiyle iki yönden yürütülebilir. Replikatif yaşam süresi, S. cerevisiae hücrelerinin asimetrik bölünme geçirmesinden dolayı geliştirilmiştir. Bu yöntemde, yavru hücre mitoz bölünme sonrasında bir mikromanipülatör kullanılarak anne hücreden ayrılır ve bu işlem, anne hücre bölünmesini durduruncaya kadar sürdürülür. Mitozun sonunda bir anne hücrenin meydana getirdiği tomurcukların (bud) sayısı tespit edilir ve bu yavru hücrelerin (tomurcuk) sayısı, S. cerevisiae'nın replikatif yaşam süresidir. Kronolojik yaşam süresi ise, hücre üremesinin durağan evresindeki bölünmeyen hücrelerin hayatta kaldığı zamanın uzunluğudur. Bu yöntemde hücre canlılığı, üremenin durağan evresinin başlangıcında katı besiyerinde canlı hücre sayımı ile belirlenir. Bundan sonra, durağan evredeki bölünmesini durdurmuş (G0) hücrelerin canlılığı izlenir. Kronolojik yaşam süresi yöntemi; (i) durağan evredeki maya hücrelerindeki hasarın zamanla artması, (ii) durağan evredeki hücrelerin hücre döngüsünden çıkmaları (G0) ve (iii) bu hücrelerin enerjilerini mitokondriden sağlamaları nedeniyle, yüksek ökaryotik organizmaların bölünmeyen hücrelerinin (örn. nöronlar) yaşlanmasını çalışmak için de uygun bir model olarak kabul edilir. Uzun yaşayan S. cerevisiae, C. elegans ve Drosophila mutantları hücresel yaşlanmanın mekanizmalarının anlaşılmasında büyük bir role sahiptir. Burada ilk olarak uzun ömürlü mutant suşlar elde edildiğinden ve sonrasında; bunun moleküler temellerinin anlaşılması için detaylı incelemeler yapıldığından bu çalışmalar benzer yaklaşımlar sergilerler. Bu stratejiler, tersine metabolik mühendislik yaklaşımına da benzerlikler göstermektedir. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımında ilk olarak istenilen fenotip elde edilir, sonra da bu fenotipin genetik mekanizmaları tespit edilir. Bu yaklaşım karmaşık bir genetiğe sahip, istenilen mikrobiyal fenotipleri elde etmek için çok güçlü bir yaklaşımdır. Bu yaklaşımdan, kronolojik olarak uzun ömürlü maya eldesi için henüz yararlanılmamıştır. Bu çalışmada, tersine metabolik mühendislik yaklaşımı, kronolojik açıdan uzun ömürlü S. cerevisiae eldesi için kullanıldı. Ayrıca, model organizmalar kullanılarak yapılan literatürdeki yaşlanma çalışmaları, strese direnç ve uzun yaşam arasında yakın bir ilişki olduğunu gösterdiğinden, bu çalışmada; daha önce elde edilmiş olan strese dirençli S. cerevisiae mutantlarının kronolojik yaşam süreleri de ayrıca araştırıldı. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımıyla kronolojik olarak uzun ömürlü bir maya mutantı elde etmek için ilk olarak; etil metan sülfonat ile mutajenez yapılarak, başlangıç popülasyonunun genetik çeşitliliği artırıldı. Kalori kısıtlamasının yaşam süresini uzattığı bilindiği için, başlangıç mutant popülasyonunun ardışık olarak kesikli kültürleri, gittikçe düzeyi arttırılan kalori kısıtlamasıyla yapıldı. Bu ardışık kesikli kültürler süresince, besiyerinin glikoz konsantrasyonu, % 0.5'ten % 0.02'ye düşürüldü. Son kesikli kültürde, mutant popülasyonun büyüme oranları %10'a düştüğü için; seleksiyon işlemi sonlandırıldı. Bundan sonra mutant bireyler rastgele bir şekilde bu son popülasyondan seçildi. Yarı-kantitatif ve kantitatif kronolojik yaşam süresini tespit etme yöntemleri bu seçilen mutant bireylere uygulandı. Daha sonraki moleküler ve fizyolojik çalışmalar için, mutant bireyler içinde kronolojik olarak hayatta kalımı en yüksek olan mutant (SRM11 olarak adlandırılan) seçildi. Katı besiyerinde canlı hücreleri sayma üzerine dayalı kantitatif kronolojik yaşam süresi tespit yöntemi; çok sayıda suşun ya da çok fazla koşulun test edildiği geniş ölçekli çalışmalar için, inkübasyon sırasında çok fazla sayıda pleyt ve kültür kabına gerek duyulması sebebiyle oldukça yorucu ve zahmetli bir yöntemdir. Bu nedenle bu çalışmada, mutant suşlarda kronolojik yaşam sürelerinin ön tespiti için yarı-kantitatif yöntem kullanıldı. Bu yönteme, yoğunlukları önemli derecede farklı olan kültürlerin kronolojik yaşam sürelerinin daha gerçekçi bir şekilde tespiti için kültür yoğunluklarını eşitleme adımı eklendi. Bu yarı-kantitatif yöntemin devamında, öne çıkan mutantların kronolojik yaşam sürelerinin analizi kantitatif yöntem ile de yapıldı. Bu süreç, başarılı bir şekilde uygulandı ve bir çok suş ve koşulda, kronolojik yönden uzun yaşayan fenotipler doğru bir şekilde belirlendi. Mutant SRM11'in üreme özellikleri, biyokütle ve fizyolojik üreme analizleriyle araştırıldı. Bu deneylerdeki amaç, üreme fizyolojisi yönünden bir kayıp (trade-off) meydana gelip gelmediğinin tespitini yapmaktı. Analiz sonuçları, mutant SRM11'in hem kalorisi kısıtlanan besiyerinde (% 0.5 glikoz) hem de standart besiyerinde (% 2 glikoz) üreme özelliği yönünden bir kaybının olmadığını gösterdi. Bu çalışmada, besiyeri glikoz konsantrasyonunun %75 oranında düşürülmesi (%2'den %0.5'e) maya suşlarında, besiyerinde glikoz kullanılıyor olduğu zamanki büyüme oranlarını etkilemedi. Yüksek basınçlı likit kromatografi (HPLC) analizi, uzun ömürlü mutant SRM11 ve referans suşun metabolik profillerini incelemek için kullanıldı. Bu amaçla kültür örneklerinin glikoz, etanol, gliserol ve asetat konsantrasyonları, HPLC analizleri ile izlendi. Referans suş ve mutant SRM11 arasında glikoz tüketimi açısından önemli bir fark gözlenmemesine rağmen, fermentatif metabolitlerin üretiminde önemli bir fark gözlendi. Mutant SRM11 standart glikozlu besiyerinde (% 2) düşük miktarda etanol, gliserol ve asetat üretti. Bu bulgu, mutant SRM11'in metabolizmasında solunuma yönelişini ve de solunuma dayalı metabolizmanın, kronolojik yönden uzun yaşamla ilişikili olduğunu göstermektedir. % 0.5 glikoz besiyerinde, referans suş ve mutant SRM11' in kültürlerinde az miktarda etanol ve gliserol üretimi gözlendi. Bu durum; %0.5 glikoz konsantrasyonunda fermentasyonun sınırlı olduğunu göstermektedir. Model organizmalardaki yaşlanma çalışmaları, stres direnci ile uzun yaşam arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, uzun ömürlü mutant SRM11'de, strese direnç analizi, yarı-kantitatif damlatma yöntemi (spot assay) kullanılarak uygulandı. Sonuçlar mutant SRM11'in bakır stresine yüksek düzeyde dirençli olduğunu gösterdi. SRM11, ayrıca gümüş, feniletanol, etanol ve borik asit streslerine de direnç gösterdi. Bu sonuçlar, bu stres türlerinin kronolojik yönden uzun yaşamla ilişkili olabileceğini göstermektedir. Mayada kronolojik yönden uzun yaşamın moleküler mekanizmalarını anlamak için DNA mikrodizi teknolojisi kullanılarak, uzun ömürlü mutant SRM11'in tüm genom transkriptomu analiz edildi. DNA mikrodizi analiz sonuçları, referans suşla karşılaştırıldığında, uzun yaşayan mutant SRM11'de iki-kat ve üstü 769 açık okuma bölgesi (ORF)'nin ifadesinin arttığını ve 838 açık okuma bölgesinin ifadesinin de azaldığını gösterdi. Gen ifadelerindeki bu değişimi yorumlamak için, Gen Ontoloji (GO) analizi kullanıldı. İfadesi artmış olan genlerin GO analizi, oligosakkarit-karbonhidrat metabolik biyolojik prosesleri ve oksidatif strese yanıt işlevlerinin SRM11'de aktive edildiğini gösterdi. Ayrıca, SRM11'de ifadesi azalan genlerin GO analizi, ribozomal altünite biyogenezi ve ribozomun bileşenlerinin bir araya gelmesi (assembly) ve RNA işleme süreçlerinin baskılandığını gösterdi. Bu sonuçlar, oligosakkarit-karbonhidrat metabolik prosesi ve oksidatif strese yanıt işlevinin artması ve protein sentezinin baskılanmasının, S. cerevisiae mayasında kronolojik yönden uzun yaşamın artırılması ile ilişkili olabileceğini önermektedir. Çeşitli streslere dirençli S. cerevisiae mutantlarının kronolojik yönden yaşam süreleri de yarı-kantitatif ve kantitatif yöntemlerle araştırıldı. Test edilen strese dirençli mutantlar arasında, gümüşe-dirençli, etanole-dirençli, feniletanole-dirençli, oksidatif strese-dirençli mutantlar, uzun ömürlü mutantlar olarak tespit edildi. Oksidatif stres direncinin mayada kronolojik olarak hayatta kalma ile ilişkili olduğu gösterilmişti, fakat; gümüş, etanol, feniletanol streslerine dirence dair bir veri, literatürde mevcut değildi. Bu çalışma, S. cerevisiae mayasında gümüş, etanol ve feniletanole direncin, kronolojik yönden uzun yaşamla ilişkili olabileceğini ilk defa gösterdi. Bu çalışmada ayrıca, stres direnci ve kronolojik yönden uzun yaşam arasındaki ilişkiyi belirlemek amacıyla, uzun ömürlü ve strese dirençli mutantların (gümüşe-dirençli, feniletanole-dirençli, etanole-dirençli mutantlar ve uzun ömürlü mutant SRM11) karşılaştırmalı transkriptomik analizleri yapıldı. Karşılaştırmalı transkriptomik analizler, uzun ömürlü ve strese dirençli mutantlarda ortak olarak 17 tane ifadesi azalan ve 48 tane ifadesi artan genin bulunduğunu gösterdi. İfadesi ortak olarak artmış genlerin GO analizi, bunların oligosakkarit-karbonhidrat metabolik prosesleri, enerji ve öncül metabolitlerin oluşumu ile ilgili biyolojik işlevlerde gruplandıklarını gösterdi. İfadesi ortak olarak azalmış genlerin GO analizi ise, ribozomal altbirimlerin oluşumu ve aminoasit taşınımı gibi biyolojik işlevlerin baskılandığını gösterdi. Sonuç olarak bu çalışma; artan solunum metabolizmasının, bakır, gümüş, etanol ve feniletanol streslerine direncin, protein sentezinin baskılanmasının, oligosakkarit ve karbonhidrat metabolik proseslerinin aktive edilmesinin, S. cerevisiae mayasında kronolojik yönden uzun yaşamla ilişkili olabileceğini göstermektedir. Genomik ve proteomik düzeyde yapılacak detaylı analizler, S. cerevisiae'de uzun yaşamın karmaşık moleküler temellerinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.