FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

http://hdl.handle.net/11527/182

Gözat

Yazar "Çetinel, Sibel" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora'a göz atma
  • Öge
    Nano-Biotechbological application of inorganic binding proteins
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012) Çetinel, Sibel ; Tamerler, Candan ; 332967 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology-Genetics and Biotechnology
    Bir çok organizma protein anorganik etkileşimlerinden meydana gelen organik-anorganik hibrid sistemler içerir. Bu hibrid sistemlerin koruyucu tabakalar vedestekleyici dokular oluşturmak, yük ve iyon transferi yapmak, bazı optik vemekanik özellikler geliştirmek gibi mükemmel fonksiyonları mevcuttur.Çeşitlendirilmiş fonksiyonlara sahip bu sistemler, biyoteknoloji ve nano-biyoteknoloji alanında kullanılabilecek yeni sistemlerin tasarımında örnek teşkil eder(biyobenzetim). Anorganik yüzeyleri tanıma ve kuvvvetli bir şekilde tutunmaözelliğine sahip olan peptitlerin (GEPI) kullanılmasını esas alan bir yaklaşım ilenanoparçacık ve biyomoleküllerin istenen anorganik yüzeye immobilize edilmesi yada yeni özellikte nanoyapıların sentezlenmesi mümkündür.Biyomoleküllerin anorganik yüzeylere immobilizasyonları aktivite ve stabilite artışısağlaması amacıyla önemlidir. Kimyasal immobilizasyon yöntemleri ile elde edilensistemler biyomolekülün aktivitesinde azalmaya ya da kayba neden olabilmektedir.Bu nedenle GEPI'ler aracılığı ile immobilizasyon denenmiş ve başarılı örnekler eldeedilmiştir. GEPI aracalıklı immobilzasyonda peptidler, biyolojik molekülle birlikteüretilerek çift foksiyonlu bir molekül elde edilir. Molekül peptidden gelen yüzeytanıma özelliği ile matrikse tutunurken, biyomolekülü oluşturan bölge istenenbiyolojik fonksiyonu göstermeye devam eder. Bu tür bir tutuklanma sistemindeprotein yapısının kimyasal reaksiyonlarla bozunması ya da yüzeye kontrolsüz olarakbağlanması engellenmiş olur. Bu çalışmada altın yüzeye özgün bağlanan iki farklıpeptid sırasıyla Huntingtin proteinini ve Lactate dehidrogenaz enziminin altınyüzeylere tutuklamak amacıyla kullanılmıştır.Çalışmanın ilk kısmında altın yüzeye özgün bağlanan GBP1 peptidi, Huntingtinproteininin N-terminal ucuna eklenerek proteinin altın sensör yüzeyine bağlanmasınaaracılık etmek amacıyla kullanılmıştır. Huntingtin proteini mutant formundaHuntington hastalığına neden olan ökaryotik bir proteindir. Proteinin mutant formuN-terminal bölgesindeki glutamin tekrarlarının sayısında artış meydana gelmişhalidir. Normal protein 35 ve daha az glutamin tekrarı içerirken, mutant proteinde busayı 110 a kadar ulaşabilmektedir. Glutamin tekrarlarındaki artış miktarı hastalığınseyri ile doğru orantılı bulunmuştur. Hastalığın en belirgin hücre patalojisisitoplazma ve nukleusda inklüzyon cisimciklerinin gözlenmesidir. ?nklüzyoncisimcikleri mutant proteinin agregatlar oluşturması sonucu meydana gelir. Bir gruparaştırmacı hastalık patalojisinde etkin mekanizmanın protein agregasyonu sonucuolaşan fibril yapıların varlığı olduğunu düşünmektedir. Ancak fibril yapılarınsayısında azalma olmaksızın hastalık patalojisinin engellenebildiği durumlarınvarlığı, bazı araştırmacıların fibrilasyonun aslında hücrenin korunma mekanizmasıolduğunu düşünmelerine yol açmıştır. Hastalık oluşumunun daha iyi anlaşılabilmesive etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için Huntingtin fibrillasyon mekanizması çalışılmaktadır. Ancak şu ana kadar farklı fibrillasyon basamaklarında meydanagelen agregasyon kinetiği nicel olarak araştırılmamıştır. Biz yüzey plazmon resonanspektroskopisini kullanarak (SPR) Htt fibrilasyon kinetiğini incelemeyi hedefledik.Yüzey plasmon rezonans spektroskopisi çalışmalarında proteinlerin altın sensoryüzeyine immobıilize edilmeleri gerekmektedir. Altın yüzeyine proteinimmobilizasyonunu gerçekleştirmek için GBP1 kullanılmıştır. GBP1-Htt füzyonproteinleri hem fibril hem de proto-fibril formlarda SPR yüzeyine tutuklanmışlardır.Ardından monomer haldeki Htt proteinleri yüzeye tutuklanmış fibril yapılarınüzerine gönderilerek bağlanma kinetikleri incelenmiştir. Kontrol olarak Htt fibril veproto-fibril yapıları altın yüzeyine kovalent immobilizasyonla tutuklanarak dadeneyler tekrar edilmiştir. Kontrol çalışmaları GBP1 aracılıklı immobilziasyon ile enaz kovalent tutuklanma kadar etkin bir immobilizasyon gerçekleştirildiğinigöstermiştir. Ayrıca fibril ve proto-fibril uzamasının kinetiğinin incelenmesineolanak sağlamıştır.Elde edilen veriler, fibril uzaması için iki basamaklı bir fibrillasyon modeliönerilmesine sebep olmuştur. Model, ilk basamakta monomerin fibril ucunaeklenmesini, ikinci basamakta ise konformasyonel değişimini içermektedir. Bukonformasyonel değişim sonucu monomer artık fibrilin bir parçası haline gelmiş veyeni eklenecek olan monomer proteinlerle etkileşmeye hazır hale gelmiştir. Proto-fibril uzamasında ise tek basamaklı bir fibrilasyon kinetiği modeliönerilebilmektedir. Bu modele göre monomer proto-fibril ucuna eklenmiş veuzamaya neden olmuştur. Fibril ve proto-fibril uzamaları için elde edilen dengesabitleri, fibrilasyonun başlangıç aşamalarında daha yavaş olduğunu göstermiştir. Buveri nükleasyona dayalı polimerizasyon olarak değerlendirilen Huntingtin fibriluzamasını destekler niteliktedir. Bu modelde fibrilasyonun başlaması için önceliklebir nukleus oluşumu gerekliliği ve bu basamağın da hız kısıtlayıcı basamak olduğudüşünülmektedir. Proto-firbil uzamasının da bu nedenle fibril uzamasından dahayavaş olması anlamlı bulunmuştur. Çünkü proto-fibriller aslında nukleus dan dahabüyük ancak henüz fibril büyüklüğüne ulaşmamış ara yapılardır. Elde edilenfibrilasyon kinetiği verileri ile hastalık tedavisi için geliştirlen olası ilaçprokürsörlerinin agregasyona etkileri araştırılabilir. Ayrıca GBP1 aracıklıimmobilizasyon diğer agregasyon profili gösteren proteinlerin kinetiklerininincelenmesinde de kullanılabilir bir yöntem olarak sunulabilir. Bu sayede Huntingtonbenzeri nörodejeneratif hastalıkların da araştırılması mümkün görülmektedir.Çalışmanın ikinci kısmında diğer bir altına özgün bağlanan peptid olan AuBP2(WALRRSIRRQSY), LDH enziminin N-terminaline eklenmiş ve enzimin altınyüzeyine immobilizasyonunda kullanılmıştır. Laktat dehidrogenaz enzimi birçokorganizma tarafından üretilmektedir. Ancak bu çalışmada aktitesi ve üç boyutluyapısı aydınlatılmış olanı termostabil organizmalardan Bacillus stearothermophilustarafından üretilen enzim (bsLDH) kullanılmıştır. bsLDH NADH/NAD+ kofaktörçiftini kullanarak pürivat (oxo asid) ve laktat (hydroksi asid)'ın dönüşümünükatalizlemektedirler. Reaksiyon ürünleri yarı-sentetik penisilin ve antihipertensiflergibi farmasötiklerin yapımı ve fenilketonürinin tıbbi tanısında kullanılmaktadırlar.Ayrıca diyagnostik alanında lactat miktarının tayininde yararlanılan bir enzimdir.Son zamanlarda ise nano boyutlu bio-enerji sistemlerinin geliştirilmesinde bir redoksenzimi olan LDH'in direk elektron transferini sağlama özelliğinden yararlanılmasıüzerine çalışılmaktadır. Hem biyosensör hem de biyo-enerji sistemlerinde LDH'denyararlanabilmek için uygun bir matrikse immobilize edilmesine ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kimyasal tutuklama yöntemlerine alternatif olarak LDHimmobilizasyonunu AuBP2 peptidi aracılığı ile gerçekleştirilmiştir. AuBP2 peptiddizisi, rekombinant DNA teknoloji kullanılarak LDH proteinin N-terminal ucunaeklenmiştir. Oluşturulan füzyon proteinin LDH aktivesi göstermeye devam edipetmediği enzim aktivite tahlilleri ile test edilmiştir. Sonuçlar AuBP2 eklenmesininLDH aktivitesinde ciddi bir azalmaya sebep olmadığını göstermiştir. Ardından yüzeyplazmon resonans spektorskopisi kullanılarak füzyon proteinin altın yüzeyebağlanma ilgisi araştırılmıştır. SPR sonuçları AuBP2 varlığında enzimin altın yüzeyeilgisinin on kat kadar arttırıldığını ve yüzeye tutuklandıktan sonrauzaklaştırılmadığını göstermiştir. Bu çalışmalar ile AuBP2-LDH füzyon proteininhem altın yüzeye bağlanabildiği hem de LDH aktivitesi göstermeye devam ettiğibulunmuştur.Füzyon proteinin immobilize halde iken ne kadar aktif olduğu da enzimler altın nanoparçacıklara tutuklanarak incelenmiştir. Enzimlerin immobilizasyon sonrası serbestenzime kıyasla %80 civarında aktivite gösterdikleri bulunmuştur. Enzimimmobilizasyonlarında %50 üzerinde immobilize aktivite elde etmenin iyi bir veriolduğu düşünüldüğünde AuBP2 ile immobilizasyonun etkinliği görülmektedir.Ayrıca immobilize enzimlerin 30 güne kadar aktivitelerini korudukları da izlenmiştir.Serbest enzimler ise 30 gün sonunda immobilize enzime kıyasla daha fazla aktivitekaybına uğradıkları gözlenmiştir.Son olarak, LDH enziminin redoks raksiyonunu incelemek amacıyla siklikvoltametri çalışması yapılmıştır. Bu çalışmada AuBP2-LDH altın elektrod yüzeyineimmobilize edilmiştir. Sisteme substrate olarak laktat ve kofaktor olarak NADbeslenmiştir. Elektrod yüzeyine potansiyel farkı uygularak, redüklenme veoksitlenme reaksiyonları izlenmiştir. Siklik voltametre analizlerinde enzimin NADredüksiyonu gözlenmiştir. Bu gözlem, hem biyosensör hem de biyo-enerjisistemlerinde elde edilen redüklenme miktarından daha yüksek bulunmuştur. Busonuç, AuBP2 gibi çok küçük bir molekül ile yüzeye tutturulan enzimin, elektrodayakınlığı sonucunda elektrod ile enzim arasındaki elektron transferine olanaksağlandığını düşündürmüştür.Tez çalışması genel olarak incelendiğinde altına özgün bağlanan peptidlerin hemprotein hem de enzim immobilzasyonunda etkin olarak kullanılabileceğigörülmüştür. GEPI aracılıklı immobilizasyon ile huntington hastalığı gibi proteinagregasyonuna dayalı diğer nörodejeneratif hastalıkların da çalışılması mümkündür.Ayrıca sensör yüzeyine yaklaştırılmak istenen enzimlerin GEPI aracılıklıimmobilizasyon ile yüzeye tutuklanmaları olanağı vardır.