Model Sistemlerde Farklı Fenolik Bileşiklerinin Antioksidan Potansiyali Ve Biyoyararlılığının Değerlendirilmesi

Abstract

Fenolik bileşikler bitkilerin büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bugüne kadar 6000’den fazla fenolik bileşik tanımlanmış fakat bunun çok küçük bir kısmı diyet açısından önemli bulunmuştur. Bu bileşiklere ilgi gerçek anlamda 1990’lı yıllarda başlamış ve giderek artmıştır. Son yıllarda polifenoller araştırmacılar ve tüketiciler arasında önem kazanmıştır. Fenolik bileşikler antioksidan özelliklerinden dolayı sağlığa yararlı etkileri, kanser,kardiyovasküler hastalıklar, iltihap ve nörodejenaratif hastalıklar üzerindeki olumlu etkileri nedeniyle dikkat çekmektedir. Literatürde saf halde bulunan fenolik bileşiklerin in vitro biyoyararlılığı ile ilgili az sayıda çalışmaya rastlanmaktadır. In vivo metodlar karmaşık, pahalı, uzun zaman alan çalışmalardır ve çalışma boyunca etik sorunlar ile karşılaşılmaktadır. In vitro metodlar ise ucuz, hızlı ve basittir. Bu çalışmada amaç; antosiyanin, izoflavon, fenolik asit ve bazı flavanoid standartlarının mevcut antioksidan aktiviteleri ve toplam fenolik madde miktarına etkilerinin değerlendirilmesinin ardından in vitro olarak sindirimleri sonrasında biyoyararlılıklarının model sistemlerde karşılaştırılmasıdır. Önceki çalışmalarda belli ürünlerde bulunan antosiyanin ve diğer fenolik bileşenlerin biyoyararlılıkları ve antioksidan aktivitelerine ilişkin incelemeler yapılmışken, bu çalışmada standart haldeki antosiyanin, izoflavon, fenolik asit ve flavanoidler üzerinde analizler yapılacaktır. Bu sayede antosiyanin, izoflavon, fenolik asit ve flavanoid fenolik madde sınıflarının antioksidan kapasiteleri ve biyoyararlılıkları hem sınıfların kendileri içlerinde hem de sınıflar arasında kıyaslama yapılarak bu konuda önemli bulgular elde edileceği düşünülmektedir. Analizlenen standartlar izoflavonlar, fenolik asitler, flavonoller, flavanonlar, kateşinler ve antosiyaninlerdir. In vitro sindirim öncesi ve sonrasında tüm bu standartlar Folin Ciocalteau metodu ile toplam fenolik madde içeriği ve 2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonik asit (ABTS), 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) and CUPRAC metodu ile antioksidan kapasitesi açısından kıyaslanmıştır. Saf haldeki fenolik bileşikler quercetin hariç suda çözülmüş ve bu örneklere in vitro sindirim metodu uygulanmıştır. Bu yöntem McDougall ve diğ. (2005) gerçekleştirdiği çalışmadan uyarlanmıştır. Metod iki basamaktan oluşmaktadır. Mide sindirimini taklit etmek amacıyla pepsin/HCl sindirimi 2 saat 37&#730;C olarak gerçekleştirilmiş ardından ince bağırsak sindirimini taklit etmek için ise pankreatin enzimi ve safra tuzları eklenerek 37&#730;C de 2 saat gerçekleştirilmiştir. Örnekler PG, IN ve OUT kısımlarından alınmıştır. PG örnekleri mide sonrası, IN kana geçen kısmı, OUT ise mide bağırsak sindirimi sonrasında kalan maddeyi temsil etmektedir. Tüm fraksiyonlarda antosiyanin ve fenolik madde miktarları ve toplam antioksidan aktivite belirlenmiştir. Analiz sonuçlarının tümü Sosyal Bilimler için İstatistik Paketi (SPSS) 21.0 versiyonu yazılım yardımı ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulaması ile Duncan Yeni Çoklu Aralık Testi seçilerek 0.05 önem derecesinde değerlendirilmiştir. Sonuçlar, mg eş değerleri/g kuru madde olarak belirtilmiştir. Her bir analiz her örnek için iki kez tekrarlanmış ve sonuçlar ortalama değer ± standard sapma olarak verilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda; toplam fenolik içerik bakımından en yüksek değeri Syanidin-3-O-glukozit (1901.22±51.47 mg GAE/g), en düşük değeri ise glisitin (178.23±2.36 mg GAE/g) göstermiştir. Fenolik içerik sırasına göre sonuçlar yaklaşık olarak flavanoller > antosiyaninler > kateşinler > naringenin > fenolik asitler > isoflavonlar şeklindedir. Tüm antioksidan aktivite analizlerinde gallik asit en yüksek antioksidan kapasiteye sahip olup DPPH için 4022,43±186,06; CUPRAC için 4397.81±53.59 ve ABTS için 5646.67±40.35 mg TEAC/g aktivite göstermiştir. Fenolik gruplar içerisinde toplam antioksidan aktivite DPPH metoduna göre değerlendirildiğinde kateşinler > flavonoller > fenolik asitler > antosiyaninler > isoflavonlar > naringenin şeklinde bir sıralama elde edilir. Fenolik bileşikler arasında cyanidin 3-glukozit 995,47±23,09 mg TEAC/g olarak en düşük, gallik asit ise 4022,43±186,06 mg TEAC/g olarak en yüksek antioksidan aktiviteyi göstermiştir. Sonuç olarak DPPH yöntemi diğer yöntemlere kıyasla hidrofilik antioksidanlar için daha düşük hassasiyet göstermiştir. Tüm antioksidan analizlerinde genellikle quercetin en yüksek aktivite göstermiştir. Epikateşin gallat, epigallokateşin gallat, quercetin, epigallokateşin, kateşin hidrat, kafeik asit, epikateşin ve gallik asit CUPRAC yönteminde yüksek antioksidan aktiviteye sahiptir. ABTS yöntemiyle elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde malvidin klorit dışında antosiyaninlerin aglikon yapıları glikozit yapılarına göre daha düşük antioksidan aktiviteye sahiptir. Sindirim sonrasında yapılan toplam fenolik içerik analizlerine göre genellikle bağırsak öncesi (PG) fraksiyonları IN ve OUT fraksiyonlarından daha yüksek olduğu görülmüştür. Fenolik asitlerin IN ve OUT değerleri diğer standartlara kıyasla daha yüksek fenolik madde içeriğine sahiptir. CUPRAC yöntemine göre isoflavonlar içerisinde OUT fraksiyonların % gerikazanım değerleri daha yüksektir. Fenolik asitler arasında pHBA yüksek % gerikazanım değerine sahiptir. Ayrıca fenolik asitlerin ve kateşinlerin PG % gerikazanım değerleri daha yüksektir. Diğer taraftan flavonoller ve benzer şekilde naringenin bileşiklerinin OUT fraksiyonları daha yüksek % gerikazanım değerlerine sahiptir. Bu çalışmada antosiyaninlerin PG fraksiyonları IN ve OUT kısımlarında daha yüksek % gerikazanım değerlerine sahiptir. ABTS analizleri açısından antosiyaninler içerisinde glikozit yapıları aglikon yapıları ile kıyaslandığında PG fraksiyonların aglikon formları glikozit formlarından daha yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca fenolik bileşikler aralarında kıyaslandığında sindirim sırasında en düşük biyoyararlılığı antosiyaninler göstermiştir. HPLC-PDA sonuçlarına göre glisitin için INve OUT fraksiyonlarında sırasıyla 96.3±3.2 ; 158.1±14.1 µg/ml oranında yüksek değerler elde edilmiştir.PG fraksiyonları açısından (+)-kateşin hidrat 109.3±17.7 µg/ml oranında yüksek sonuçlar göstermiştir. Genel olarak PG değerleri IN ve OUT değerlerine göre daha yüksek elde edilmiştir.IN ve OUT fraksiyonlarında sırasıyla 0.3±0.1; 0.2±0.0 µg/ml oranında epigallokateşin düşük sonuçlar vermiştir. PG fraksiyonlarında ise myricetin0.8±0.2 µg/ml oranında düşük değerler elde edilmiştir. Ayrıca delfinidin,siyanidin,siyanidin-3-O-glukozit, pelargonidin ve malvidin IN, OUT ve PG fraksiyonlarında tespit edilememiştir. Bunun dışında kuersetin, kafeik asit, myricetin, kateşin hidrat, EGC, C3R, P3G, M3Ga ve M3G bileşikleri yalnızca PG fraksiyonlarında belirlenebilmiştir. Ayrıca toplam fenolik madde analizleri ve tüm antioksidan aktivite yöntemleri arasındaki ilişki p<0.01 düzeyinde önemli bulunmuş olup CUPRAC için r=0.606, DPPH için r=0.590 ve ABTS için r=0.447 şeklindedir. CUPRAC ve DPPH ile CUPRAC ve ABTS arasındaki ilişki istatiksel olarak önemli bulumuştur (p<0.01). bunun dışında ABTS ve DPPH arasındaki ilişkide (0.392) istatiksel değerlendirmeye göre önemli olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, antosiyanin, isoflavon, fenolik asit, flavanon ve flavonol sınıfları hem sınıflar arasında hem de sınıflar içerisinde antioksidan kapasite ve biyoyararlılık açısından kıyaslanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre antioksidan aktivite ve biyoyararlılık polifenoller arasında kimyasal yapı, etkileşim ve çözünürlük gibi faktörlere bağlı olarak önemli oranda değişiklik göstermiştir. Bu açıdan yapılan çalışma fenolik bileşiklerin metotlara verdiği yanıtları değerlendirebilme imkanı sağlayarak belirli fenolikler için uygun metot seçimine olanak sağlamaktadır. Biyoyararlılık sonuçları polifenoller arasında geniş ölçüde farklılık göstermiştir.

Phenolic compounds are a large group of plant constituents. To date, more than 6000 flavonoids have been identified, although a smaller number is important in respect to diet. In the 1990s, interest in these compounds truly commenced and has been growing ever since. Polyphenols have been the center of huge research interest over the past decade. They have been attributed to a wide range of beneficial properties regarding human health, including protective effects on cancer, cardiovascular diseases, inflammation, and the neurodegenerative disorders because of being potent antioxidants. The main objective of this study is to compare the bioavailability and antioxidant (AO) capacity of different phenolic compunds in model systems. Previous studies have only investigated the bioavailability and AO activity of phenolic compounds that are found in certain food products together with the food matrix effect. In this research, analysis is carried out on single standards of phenolic compounds. In literature, there is limited research on pure phenolic compounds and their in vitro bioavailability. Totally 32 standards in concern are: isoflavones, phenolic acids, flavonols, flavanone, catechins and anthocyanins. All the standards are compared with each other with respect to their total phenolic contents using Folin Ciocalteau method and total AO capacities using commonly applied methods such as 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS), 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) and copper reducing antioxidant capacity (CUPRAC) both before and after in vitro gastrointestinal digestion to determine their bioavailability besides the change in their phenolic profiles. To form the models pure phenolic compounds were dissolved in water to simulate the conditions in the body. In vitro digestion method which consist of two stages was adapted from McDougall et al. (2005) was applied to evaluate potential bioavailability of phenolic compounds. First stage gastric digestion was performed at 37&#730;C for 2 hours with pepsin enzyme and second stage pancreatic digestion was applied at 37&#730;C for 2 hours with bile salts and pancreatin enzyme. Samples were collected as PG, IN and OUT fractions. PG is the fraction after gastric digestion, IN sample is representing the materials entering into serum and OUT sample is showing the material remaining in the gastrointestinal tract. All fractions were analyzed for phenolic profiles, besides their total phenolic content and AO activity. All the data obtained were evaluated statistically by Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Programme version 21.0. Significant differences between the samples were analyzed by one way Analysis of Variance (ANOVA) at 0.05 significant level followed by Duncan’s New Multiple Range Test as post hoc tests. The results were reported as mg equivalents/ g standard. Each analyses were repeated in duplicate for each sample and the results were reported as mean value ± standard deviation. As a result of this study; before digestion Cyanidin 3-O-glucoside showed the highest total phenolic content value (1901.22±51.47 mg GAE/g) and glycitin the lowest (178.23±2.36 mg GAE/g). Gallic acid had the highest AO capacity for all the AO activity analysis, 4022.43±186.06 for DPPH, 4397.81±53.59 for CUPRAC, 5646.67±40.35 mg TEAC/g for ABTS, respectively. When the total antioxidant activity within the phenolic groups was evaluated by DPPH method the order of AO capacity is catechins > flavanols > phenolic Acids > anthocyanins > isoflavones > naringenin. Overall, the DPPH method is less sensitive than the other methods for hydrophilic antioxidants. In respect to flavanols for TAC results, generally quercetin showed the highest AO capacity in all TAC analysis. The highest AO capacities in the CUPRAC method were observed for epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, quercetin, epigallocatechin, catechin, caffeic acid, epicatechin and gallic acid. According to the ABTS results, aglycones of anthocyanins had lower AO activity than corresponding glycoside forms except for Malvidin chloride. According to total phenolic content analysis after digestion, generally postgastric (PG) fractions were higher than the IN and OUT fractions . Both IN and OUT values of phenolic acids had highest levels in comparison to the other standards. Percent recovery values for OUT fractions in isoflavones were high for CUPRAC. Besides, phenolic acids and catechins had higher PG % recovery values. On the other hand, Flavonols had high recovery% values for OUT similar to Naringenin which was Flavanone. Anthocyanins had high recovery % values for PG than recovery % values for IN and OUT in this study. In respect to ABTS analysis, within the anthocyanins, when glycoside forms and aglycone forms compared with each other, it was obtained that the values of aglycones were higher than the values of glycosides in PG fractions. Besides, anthocyanins were found to have lower bioavailability during digestion when compared to other phenolic compounds. According to the HPLC-PDA results, glycitin had the highest values for IN and OUT fractions (96.3±3.2; 158.1±14.1 µg/ml, respectively). In respect to PG fractions; (+)-catechin hydrate had the highest value as 109.3±17.7 µg/ml. Generally PG values were found to be higher than IN and OUT fractions. On the other hand, epigallocatechin had very low value as 0.3±0.1; 0.2±0.0 µg/ml, for the IN and OUT fractions, respectively. When PG results were examined value of myricetin was found to be lower than other compounds as 0.8±0.2 µg/ml. Moreover, compounds such as delphinidin, cyanidin, cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-galactoside, pelargonidin and malvidin could not be determined in IN, OUT and PG fractions. Besides, for quercetin, cafeic acid, myricetin, catechin hydrate, EGC, C3R, P3G, M3Ga and M3G compounds, the peaks could only be detected in PG fraction. Besides, there was an important relation between total phenolic content and all of total antioxidant activity methods, CUPRAC (r=0.606), DPPH (r=0.590) and ABTS (r=0.447), (p<0.01). The relation between CUPRAC and DPPH, CUPRAC and ABTS were also statistically significant (p<0.01). There was weak relation (0.392) between ABTS and DPPH, but according to statistical evaluation it was significant again. Overall, the antioxidant capacity and bioavailability of anthocyanin, isoflavone, phenolic acid, flavanone and flavanols were compared both between classes and within the classes. It was seen that antioxidant activity and bioavailability differs greatly from one polyphenol to another due to their structure, interactions and solubility according to method performed. In this regard, the study may be helpful in understanding the method responses and efficiencies against the targeted phenolic compounds so that proper method selection for the specific phenolics will be possible as well. The results clearly show wide variability in the bioavailability of different polyphenols.