Dokosahekzaenoik Asit Ve Araşidonik Asit İle Zenginleştirilmiş Anne Sütü Yağı Benzerlerinin Üretimi

Abstract

Anne sütü yağı , dokosahekzaenoik asit (DHA) ve araşidonik asit (AA) gibi çoklu doymamış yağ asitleri (ÇDYA) de dahil olmak üzere bebek için gerekli tüm bileşenleri içermesi bakımından “altın standart” olarak kabul edilmektedir. Diğer canlıların sütleri, hayvansal ve bitkisel kaynaklı yağların aksine, anne sütü yağı yaklaşık %25 oranında palmitik asit içermektedir. Bu oranın yaklaşık %70’i triaçilglierolün (TAG) sn-2 pozisyonunda yer almaktadır. Anne sütü yağının bu benzersiz özelliği yağ asitlerinin ve kalsiyum emiliminin yüksek olmasını sağlamaktadır. Anne sütü yağının kazandırdığı bu avantajlar nedeniyle, araştırmacılar anne sütünün avantajlarını sağlayan ve anne sütüne benzer özellikler gösteren yapılandırılmış yağ (YY) üretme çalışmalarına başlamışlardır. Bu çalışmada, iki aşamada DHA ve AA ile zenginleştirilmiş anne sütü yağı benzerlerinin üretimi amaçlanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, sn-2 pozisyonunda %1’den daha az palmitik asit içeren fındık yağı palmitik asit ve etil palmitat ile spesifik olmayan Novozym® 435 enzimi (C. Antarctica’dan elde edilen) kullanılarak zenginleştirilmiştir. Reaksiyon koşulları Tepki Yüzey Yöntemi (TYY) ile optimize edilmiştir, Merkezil Bileşik Deney Tasarımı ile en uygun model elde edilmeye çalışılmıştır. Modelin bağımsız değişkenleri substrat mol oranı (S: 4-6 mol/mol) ve zaman (t: 6-18 sa) olarak belirlenmiş, reaksiyon sıcaklığı 65ºC’de sabit tutulmuştur. Toplam palmitik asit ve sn-2 pozisyonundaki palmitik asit miktarları (%mol) tepki olarak ölçülmüştür. Modde 5.0 yazılımı ile oluşturulan tepki yüzey izdüşüm grafiklerine göre reaksiyon için gerekli optimum koşullar 17 sa ve 6 substrat mol oranı olarak belirlenmiştir. Model doğrulaması bu değerler kullanılarak gerçekleştirilmiş, zenginleştirilmiş fındık yağındaki palmitik asit miktarı %63,48 olarak, sn-2 pozisyonundaki palmitik asit miktarı ise %71,13 olarak tespit edilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, zenginleştirilmiş fındık yağına, sn-1,3 spesifik lipaz enzim olan ve Rhizomucor miehei’den elde edilen Lipozyme® RM IM yardımıyla DHA ve AA inkorpore edilmeye çalışılmıştır. Çalışmanın bu kısmında reaksiyon koşulları şu şekilde seçilmiştir: reaksiyon sıcaklığı olarak 50 ve 60ºC, AA/DHA oranı olarak 2:1 ve 3:2, substrat mol oranı olarak 1:0,1 ve 1:0,05. Reaksiyon için gerekli zaman 3 saatte sabit tutulmuştur. Düşük substrat mol oranında, DHA ve AA inkorporasyonu düşük gözlenmiştir ve 50ºC’de elde edilen sonuçlar 60ºC’de elde edilen sonuçlara göre daha düşük tespit edilmiştir. AA ve DHA inkorporasyonu sonuçlarına göre, bu aşamanın gram ölçekte üretimi 60ºC’de, 1:0,1 substrat mol oranında ve 3:2 AA/DHA oranında gerçekleştirilmiştir. Bu reaksiyon sonucunda elde edilen YY’nin %57,26 oranında palmitik asit, %2,71 oranında AA ve %2,38 oranında DHA içerdiği tespit edilmiştir. YY’nin sn-2 pozisyonundaki palmitik asit miktarı ise %66,05 olarak belirlenmiştir. Bu çalışma kapsamında ürünlerin karakterizasyonu çalışması da gerçekleştirilmiştir. Substratların, zenginleştirilmiş fındık yağının ve YY’nin tokoferol içeriği, erime ve donma profili ve oksidatif stabilitesi incelenmiştir. YY’nin tokoferol içeriği zenginleştirilmiş fındık yağından daha fazla, fındık yağından ise daha az bulunmuştur. En yüksek oksidatif stabilite fındık yağında, en düşük oksidatif stabilite ise YY’de tespit edilmiştir. Bu çalışma sonunda sn-2 pozisyonu palmitik asit ile, sn-1,3 pozisyonları da DHA ve AA ile zenginleştirilmiş anne sütü yağına benzer YY üretilmiştir. Elde edilen bu ürünün, anne sütü yağının avantajlarını da sağlayabilmesi açısından bebek mamalarında kullanılabileceği düşünülmektedir.

Human milk fat (HMF) has been accepted as a “gold standard” to feed infants as it includes all the necessary nutrients in significant amounts including long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) like docosahexaenoic acid (DHA) and arachidonic acid (ARA). Unlike other animal milk fat or animal and plant based fats and oils; it includes approximately 25% palmitic acid of which 70% is located at sn-2 position of triacylglycerols (TAG). This unique structure of HMF provides improved absorption of fatty acids and calcium. Because of these advantages of HMF, scientists have been trying to synthesize structured lipids (SL) resembling and providing the advantages of HMF. In this study, our aim was to produce human milk fat substitutes (HMFS) enriched with DHA and ARA in two steps. In the first part of the study, hazelnut oil which had less than 1% of palmitic acid at the sn-2 position was enriched with palmitic acid and ethyl palmitate as the acyl donor in the presence of a nonspecific enzyme, Novozym® 435 (lipase B from C. antarctica). The reaction conditions were optimized with Response Surface Methodology (RSM). “Central composite face-centered design” (CCF) was applied to obtain the best fitting model. The independent variabels of the model were substrate molar ratio (Sr: 4-6 mol/mol) and reaction time (t: 6-18 h). The reaction temperature was fixed at 65ºC. Total palmitic acid amount in the TAG structure and at the sn-2 position (mol%) were the responses. According to contour plots generated by Modde 5.0 software, optimal conditions for the reactions were determined as 17 h with substrate molar ratio of 6. Model verification was performed in gram-scale using these parameters and palmitic acid content of enriched hazelnut oil was measured as 63.48% as total palmitic acid and as 71.13% palmitic acid at the sn-2 position. In the second part of the study, DHA and ARA were incorporated into enriched hazelnut oil in the presence of an sn-1,3 specific lipase, Lipozyme® RM IM obtained from Rhizomucor miehei. Reaction conditions for this part were selected as follows: 50 and 60ºC as reaction temperature, 2:1 and 3:2 as ARA/DHA ratio, 1:0.1 and 1:0.05 as substrate molar ratio. Reaction time was held constant as 3 h. Considering both ARA and DHA incorporations, gram-scale production for this part was performed at 60ºC with substrate molar ratio of 1:0.1 and ARA/DHA ratio of 3:2. SL, obtained as a result of this reaction included 57.26% total palmitic acid, 2.73% ARA and 2.38%DHA contents. Palmitic acid amount of SL at the sn-2 position was determined as 66%. Characterization of the products was also performed in scope of this study. Tocopherol content, melting profile and oxidative stability of substrates, enriched hazelnut oil, and SL were investigated. Tocopherol content of SL was found to be lower than hazelnut oil but higher than enriched hazelnut oil. Enriched hazelnut oil and SL showed wider melting and crystallization range when compared to hazelnut oil. Oxidative stability of structured lipid was found to have the lowest value whereas oxidative stability of hazelnut oil had the highest value. As a result of this study, HMFS, containing high amount of palmitic acid at the sn-2 position and also DHA and ARA at sn-1,3 positions was obtained. It is believed that this kind of product can be used in infant formulas providing similar advantages as HMF.