Lipazın İnorganik Taşıyıcıda İmmobilizasyonu Ve Polikaprolakton Sentezi

Abstract

Son yıllarda, enzimatik halka açılması polimerizasyonu ile alifatik poliester sentezi oldukça ilgi gören çalışma alanlarından biri olmuştur. Bunun sebebi olarak da enzimatik olarak sentezlenen poliesterlerin biyomedikal uygulamalarda rahatlıkla kullanılabilmesidir. Biyobozunur, biyouyumlu ve üstün mekanik özelliklere sahip olan bu polimerler enzimatik olarak sentezlendiğinden toksik kimyasal katalizör kalıntısı içermemektedir. Bu da ilaç taşınım sistemleri, doku mühendisliği ve medikal araçlar (implant, protez, ameliyat ipliği, vb.) gibi biyomedikal uygulamalarda kullanımına imkan sağlamaktadır. Alifatik poliesterlerden biri olan polikaprolakton (PKL), ɛ-kaprolakton (ɛ-KL) monomerinin halka açılması polimerizasyonu ile sentezlenebilmektedir. Diğer alifatik poliesterlere kıyasla PKL oldukça düşük erime (59-64 ̊ C) ve camsı geçiş sıcaklığına (-60-10 ̊ C ) sahiptir. Bu sayede polimer düşük sıcaklıklarda şekillendirilebilmektedir. Öte yandan, bozunma sıcaklığı ise oldukça yüksek olup 350 ̊ C civarındadır. Bu yüksek bozunma sıcaklığı sayesinde PKL’nin termal stabilitesi oldukça yüksektir. Üstün termal, viskoelastik ve reolojik özellikleri PKL’nin uygulamaları sırasındaki üretim proseslerini kolaylaştırmaktadır. Bunlara ek olarak, PKL birçok çözücüde (tetrahidrofuran, toluene, kloroform, benzen, diklorometan gibi) yüksek çözünürlüğe sahiptir. Ayrıca, diğer polimerlerle uyum gösterebilmesi kompozit eldesini mümkün kılmaktadır. Biyouyumlu ve biyobozunur yapıya sahip olan PKL biyomedikal amaçla kullanıma uygundur. Diğer biyobozunur polimerlere kıyasla vücut içinde polikaprolaktonun bozunma prosesi daha yavaştır. Bu uzun sürede bozunma davranışı PKL’nin ilaç taşınım sistemlerindeki kullanımı için avantaj sağlamaktadır. Tüm bu özellikleri sayesinde PKL polimer bilimi için önemli bir konu olmuş ve biyoteknolojik uygulamalar için enzimatik PKL sentezine olan ilgi artmıştır. ɛ-KL’nin halka açılması polimerizasyonu hem biyokatalizörler (enzimler) ile hem de organometalik başlatıcılarla (Zn, AL, Sn, Ge gibi) katalizlenebilmektedir. Fakat organometalik başlatıcılar polimerizasyonun sonunda polimer matrisinden tamamen ayrılamamaktadır. Bu durum toksik etki oluşturacağından dolayı polimerin biyomalzeme olarak kullanımını sınırlandırmaktadır. Öte yandan, biyokatalizörler kullanıldığında reaksiyonun sonunda ortamdan kolaylıkla ayrılabilmekte, ayrılamayan kısım olursa da toksik etki yaratmamaktadır. Biyokatalizörlerin diğer bir avantajı da polimerizasyon reaksiyonunu ılımlı koşullarda (düşük sıcaklık ve basınç) katalizlemeleridir. Fakat biyokatalizörler uzun reaksiyon periyodları sonunda aktivite ve stabilitelerini kaybedebilmektedirler. Bu sorunu çözmek amacıyla enzimlerin immobilize halde kullanımı yaygınlaşmaya başlamıştır. Enzimlerin immobilizasyonu ile enzim aktivite ve stabilitesi arttırılmakta, enzimin tekrar tekrar kullanılması mümkün olmaktadır. En verimli ve seçici lipazlardan biri olan Candida antarctica lipase B (CALB), esterifikasyon ve transesterifikasyon reaksiyonlarını katalizleyebilmektedir. Bu enzimin immobilize formu olan Novozyme 435®, özellikle ɛ-KL’nin halka açılması polimerizasyonundaki etkinliği ile tanınmaktadır. Fakat Novozyme 435® mekanik ve termal açıdan dayanıksız bir taşıyıcı olan akrilik reçine üzerine immobilize haldedir. Bu sebeple, Novozyme 435® gibi özellikle polimerizasyon reaksiyonlarında etkili olabilecek bir lipaz eldesi için yeni taşıyıcıların geliştirilmesi son zamanlarda ilgi gören çalışma konularından olmuştur. Bu çalışmada, serbest CALB (CALB L, Lipozyme®) literatürde daha önce hiç örneği olmayan bir inorganik taşıyıcıya, pirinç kabuğu külüne, immobilize edilmiştir. Pirinç kabuğu pirinç üretim prosesinin yan ürünü olarak açığa çıkan, oldukça bol ve diğer taşıyıcılara göre ucuz bir madde olduğundan lipaz immobilizasyonu için tercih edilmiştir. Silika enzim immobilizasyonunda yaygın olarak kullanıldığından ve pirinç kabuğu külünün de SiO2 içeriği (% 95 ‘e kadar) oldukça yüksek olduğundan pirinç kabuğu külü lipaz immobilizasyonu için umut verici bir taşıyıcı olduğu sonucuna varılmıştır. Bu sebeple bu çalışmada pirinç kabuğu külüne immobilize lipazın verimliliği bir uygulama üzerinden gösterilmek istenmiştir. Bu amaçla, ilk olarak taşıyıcı madde hazırlanmış ve lipaz immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Daha sonra ise, bu yeni immobilize lipazlar ile PKL sentezlenmiştir. Taşıyıcının hazırlanması ve lipaz immobilizasyonu kısmında, ilk olarak pirinç kabukları 600-650 ֩ C’de 6 saat yakılarak pirinç kabuğu külleri elde edilmiştir. Daha sonra, bir silanlama ajanı olan (3-aminopropil)trietoksisilan (3-APTES) kullanılarak pirinç kabuğu külünün yüzeyi modifiye edilmiştir. Bu modifikasyon sonunda yüzeyde fonksiyonel amin (-NH2) grupları elde edilmiştir. Lipazın immobilizasyonu fiziksel adsorpsiyon ve glutaraldehit ile çapraz bağlama olmak üzere iki yöntem ile gerçekleştirilmiştir. Yeni immobilize lipazların optimizasyonu için; farklı 3-APTES ve glutaraldehit konsantrasyonları ve protein yükleme oranları denenmiştir. Bunlara ek olarai raf ömrü, tekrarlı kullanım stabilitesi, optimum sıcaklık ve pH değerleri araştırılmıştır. Ayrıca, pirinç kabuğu külünün, yüzeyi modifiye edilmiş pirinç kabuğu külünün ve immobilize lipazların karakterizasyonu için fourier transform kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), termal gravimetrik analiz (TGA) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılmıştır. Bu çalışmanın ikinci kısmında yeni immobilize enzimler ile PKL sentezlenmiştir. Polimerizasyon reaksiyonları daha önceden ε-KL’nin halka açılması polimerizasyonu için verimli olduğu gösterilmiş olan toluen ortamında gerçekleştirilmiştir. Enzimlerin optimum polimerizasyon koşullarının belirlenmesi amacıyla, polimerizasyon reaksiyonları farklı reaksiyon süreleri boyunca (6, 24, 48, 72 ve 120 saat) farklı polimerizasyon sıcaklıklarında (30, 40, 60, and 80 ֩ C) gerçekleştirilmiştir. Her iki enzim için de en iyi polimerizasyon koşullarının belirlenmesinden sonra, farklı enzim konsantrasyonlarının etkisi ve enzimlerin tekrar kullanılabilirliği üzerine çalışmalar yapılmıştır. Ayrıca, yeni immobilize edilmiş olan lipazları ticari lipazlar ile karşılaştırmak amacı ile Lipozyme® ve Novozyme 435® ile de belirlenmiş olan en iyi reaksiyon koşullarında PKL sentezi gerçekleştirilmiştir. Polimer örneklerinin molekül ağırlığı dağılımları jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile, zincir yapıları proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H-NMR) ve FT-IR ile, termal özellikleri TGA ve diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) analizi ile, yüzey yapıları ise SEM ile karakterize edilmiştir. Ayrıca polimer örneklerinin kristal yapısının belirlenmesi amacı ile X-ışını kırınımı (XRD) analizi uygulanmıştır. Sonuç olarak, pirinç kabuğu küllerinin yüzey modifikasyonunun başarı ile sağlandığı ve yüzeyde –NH2 gruplarının elde edildiği FT-IR ve TGA analizleri ile gösterilmiştir. Hem fiziksel adsorpsiyon hem de çapraz bağlama yöntemleri ile yaklaşık % 90’lık bir immobilizasyon verimi elde edilmiştir. Buna ek olarak, fiziksel adsorpsiyon ile immobilizasyon sonucunda serbest lipazın % 92.3’lük, çapraz bağlama ile immobilizasyon sonucunda ise % 78.8’lik aktivitesi korunmuştur. Öte yandan, çapraz bağlama ile immobilizasyon sonucunda serbest lipazın spesifik aktivitesinin 1.8 katı, fiziksel adsorpsiyon ile immobilizasyon sonucunda ise 2 katı spesifik aktivite elde edilmiştir. Yeni immobilize edilmiş olan bu lipazların spesifik aktivitelerinin Novozyme 435®’in spesifik aktivitesine (serbest lipazın 2.2 katı) yakın olduğu sonucuna varılmıştır. Fiziksel adsorpsiyon yöntemi ile immobilize edilmiş olan lipaz kullanılarak sentezlenen PKL’nin (Polimer örneğinin PKL olduğu FT-IR ve 1H-NMR ile gösterilmiştir.) molekül ağırlığı 60 ֩ C’de gerçekleştirilen 48 saatlik reaksiyon sonunda 14000 g/mol olarak elde edilmiştir. Aynı şekilde çapraz bağlama yöntemi ile elde edilen immobilize lipaz kullanıldığında ise 40 ֩ C’de gerçekleştirilen 24 saatlik reaksiyon sonunda 11580 g/mol molekül ağırlığına sahip PKL sentezlenmiştir. Son olarak, aynı enzimler arka arkaya altı kez PKL sentezinde kullanılmıştır. altıncı reaksiyon sonunda fiziksel adsorpsiyon yöntemi ile immobilize lipazın aktivitesinin % 34.1’i, çapraz bağlama yöntemi ile immobilize lipazın aktivitesinin ise %35.7’si korunmuştur. Elde edilen bu sonuçlar, her iki yöntem ile immobilize edilmiş olan lipazların kayda değer bir stabiliteye sahip olduğunu ve serbest lipaza göre uygulamalara adaptasyonunun daha iyi olduğunu göstermiştir. Öte yandan, daha ileri bir çalışma olarak, inorganik bir taşıyıcı olan pirinç kabuğu külüne immobilize edilmiş olan lipaz enzimleri sentez sonrasında ortamdan ayrılmayarak PKL matrisi içerisine gömülerek nanohibritler elde edilebilir. Literatürde lipaz taşıyıcısı olarak montmorillonit ve sepiyolitin kullanılmış olduğu bir nanohibrit sistem başarıyla gerçekleştirilmiştir.

In recent years, aliphatic polyester synthesis via enzymatic ring opening polymerization (ROP) of lactones has become an attractive research area. There is a considerable interest on utilization of enzymatically synthesized aliphatic polyesters for biomedical applications due to their biodegradability, biocompatibility, and outstanding mechanical properties. In addition, catalysis with enzymes provides achievement of non-toxic materials which is essential for biomedical implementations such as drug delivery systems, tissue engineering, and medical devices. Polycaprolactone (PCL) is an aliphatic polyester that can be synthesized via ROP of ɛ-caprolactone (ɛ-CL). Among other aliphatic polyesters, PCL has a relatively low melting temperature (Tm), between 59-64 ̊ C, and low glass transition temperature (Tg), between -60-10 ̊ C. Moreover its decomposition temperature is about 350 ̊ C which provides high thermal stability. Besides good viscoelastic and rheological features, these thermal properties make PCL to be easily manufactured. In addition, PCL is highly soluble in variety of solvents such as tetrahydrofuran (THF), toluene, chloroform, benzene and dichloromethane and it is compatible with other polymers which makes possible to obtain blends. Furthermore, PCL is a suitable biopolymer for biomedical purposes due to its biocompatibility and biodegradability. When compared with the other biodegradable polymers, PCL degradation process is slower in vivo. This long-term biodegradation behavior provides advantage for drug delivery application of PCL. As a result of these advantageous properties, PCL has become an important subject for polymer science and achievement of enzymatic PCL synthesis has received attention for biotechnological applications. ROP of ɛ-CL can be catalyzed by both biocatalysts (enzymes) and organometallic initiators. Organometallic initiators such as Zn, Al, Sn, and Ge, cannot be removed completely from polymer matrix at the end of the polymerization which may lead toxic effects when used as a biomaterial. On the other hand by using biocatalysts, this problem can be overcome since they can be removed easily at the end of the reaction and they are non-toxic and eco-friendly catalysts. Moreover, biocatalysts can catalyze polymerization at mild reaction conditions (relatively low temperatures and pressures). However, biocatalysts may lose their activities after long reaction periods and may have stability troubles. Thus, enzyme immobilization is the most widely used strategy to overcome utilization problems of enzymes such as low stability and lack of ability to be reused. By the immobilization of enzymes, enzyme activity and stability can be improved, enzyme can be recovered at the end of the reaction and reused which may provide a potential to enzyme to be used in a continuous process. Candida antarctica lipase B (CALB) is one of the most efficient and selective lipase that can catalyze esterification and transesterification reactions. Its immobilized form is widely used as a biocatalyst and commercially available as Novozyme 435®. It is known with its effectivity on ROP of ɛ-CL. However, Novozyme 435® is immobilized on acrylic resin which is mechanically and thermally weak support. Therefore, development of new carriers became an attractive research area to develop such an effective lipase that can catalyze polymerization reactions as efficiently as Novozyme 435®. In this work, free CALB (CALB L, Lipozyme®) was immobilized on an inorganic support material, rice husk ash (RHA), since it is a cheap and plentiful (by-product of rice production) material. Furthermore, silica is a widely used support material for enzyme immobilization. Since RHA is rich with SiO2 content (up to 95%), it is a promising support material. Therefore in this study it was aimed to show the efficiency of lipase immobilized on RHA with an application; catalysis of PCL synthesis. For this purpose, firstly support material was prepared and lipase was immobilized via two methods; physical adsorption and cross-linking. Then, PCL was synthesized with these new immobilized enzymes. At support preparation and immobilization part, first of all RHA was obtained from the burning of rice husks at 600-650 ֩ C for 6 hours. Then, by the use of a silanization agent 3-aminopropyl triethoxysilane (3-APTES), surface modification of RHA was achieved and functional amine (-NH2) groups were added to the surface. Immobilization of lipase was performed by physical adsorption and cross-linking with glutaraldehyde. For the optimization of new immobilized lipases; different 3-APTES and glutaraldehyde concentrations and enzyme loading ratios were also tried. In addition, storage stability, operational stability, optimum temperature and pH were investigated. Moreover, fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), thermal gravimetric analysis (TGA), and scanning electron microscopy (SEM) were used for the characterizations of RHA, surface-modified RHA, and immobilized lipases. The second part of this study, which is another novel work, is PCL synthesis via immobilized lipases on surface-modified RHA with physical adsorption (AD) and cross-linking (CR) methods. Polymerization reactions were carried out in toluene which was shown before as an efficient solvent for ROP of ε-CL. For the determination of optimum polymerization conditions of immobilized lipases, polymerizations were performed for various reaction times (6, 24, 48, 72, and 120 hours) at different temperatures (30, 40, 60, and 80 ֩ C). After obtaining the optimum polymerization conditions of immobilized lipases, effect of different enzyme concentrations were investigated and enzyme recycling studies were done. In addition, polymerizations via Lipozyme® and Novozyme 435® were also carried out at these conditions for the comparison of the performances of home-made and commercial enzymes. Molecular weight distributions and chain structures of the polymer samples were compared by gel permeation chromatography (GPC) and hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), respectively. In addition, for the characterization of chain structures, FT-IR was also used. Thermal properties of the polymer samples were obtained by TGA and differential scanning calorimetry (DSC) analysis. To record the crystal structure of polymer samples, X-Ray diffraction (XRD) analysis was carried out. Moreover, for determination of surface structures, SEM was used. At the end of this study, surface-modified RHA was successfully obtained and addition of –NH2 groups to the surface was showed by FT-IR and TGA analyses. Both AD and CR lipases were achieved with an immobilization efficiency of about 90%. In addition, the activities of AD and CR lipases were measured as 92.3% and 78.8% of the activity of free lipase, respectively. Furthermore, it was found that, specific activities became 1.8 and 2.0 folds greater than the specific activity of free lipase after immobilization via cross-linking and physical adsorption methods, respectively. Moreover, their specific activities were close to the specific activity of Novozyme 435® which has a specific activity of 2.2 folds greater than free lipase. By using AD lipase, PCL (its structure was verified by FT-IR and 1H-NMR) was synthesized with a molecular weight of 14000 g/mol at the end of 48 hours reaction period at 60 ֩ C. Similarly by the use of CR lipase, 11580 g/mol molecular weight was reached at the end of 24 hours reaction period at 40 ֩ C. Finally, immobilized lipases were recycled six times at their best reaction conditions. At the end of six reaction cycles, 34.1% and 35.7% of their initial activities were remained for AD and CR lipases, respectively. These results indicated that lipase immobilized by cross-linking and adsorption not only had good activity recovery, but also remarkable stability, better reusability and application adaptability than free lipase. Moreover, in further studies, development of nonohybrids may be possible by grafting CALB immobilized onto inorganic support RHA into PCL matrix. There exists such an successful application with montmorillonite and sepiolite as inorganic support materials in literature.