Multiscale computational investigation of the kynurenine 3-monooxygenase catalyzed hydroxylation reaction

Abstract

Kynurenine pathway is the biological pathway responsible for the catabolism of tryptophan to the final product nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Flavin adenine dinucleotide (FAD) dependent kynurenine 3-monooxygenase (KMO) is a class A type monooxygenase and its main function is to convert the substrate L-kynurenine (L-Kyn) into 3-hydroxykynurenine (3-HK) by a hydroxylation reaction in the kynurenine pathway. The product 3-HK and its derivatives were shown to be neurotoxic agents. On the other hand, L- Kyn is also a substrate to kynurenine aminotransferase which converts L-Kyn into the neuroprotective agent kynurenic acid (KynA). However, high levels of this substance correlates with the bipolar disorder and schizophrenia. As a result, KMO regulates the levels of important bioactive substances in this pathway. Extensive experimental research has been carried out to understand the mechanism of KMO catalyzed L-Kyn hydroxylation. Although these experiments contributed a lot to unravel many questions, some others related to the short-lived intermediate states involving L-Kyn derivatives and the dynamical responses of the enzyme, when an effector is within the active site, have remained unanswered. Another branch of experimental research has been maintained on the discovery of novel KMO inhibitors. Although early inhibitors bearing on the scaffold of L-Kyn were very successful in preventing the hydroxylation of L-Kyn, they also caused the generation of free hydrogen peroxide as a by-product. Therefore, structurally different inhibitors were sought and indeed, some were shown to prevent the hydrogen peroxide production. However, most of the diseases related to KMO activity being of neurodegenerative kind imposes another restraint on the KMO inhibitors: The inhibitors are required to be blood brain barrier (BBB) permeable which altogether proved to be a difficult task. The purpose of this thesis is to enlighten the second phase of the oxidative half reaction mechanism of KMO catalyzed L-Kyn hydroxylation and the discovery of new KMO inhibitors by means of computational methods. In the first chapter of this thesis, the reaction between L-Kyn and model FAD-hydroperoxide was studied via density functional theory (DFT). Initially, the reaction mechanism was studied by performing calculations on L-Kyn and the FAD-hydroperoxide model. The calculations were then carried out in the presence of the model KMO. The model KMO was built from an X-ray structure of the protein complex (pdb code: 5NAK) with quantum cluster approach, which proved to be a very efficient method in modelling the enzyme reactions. In the cluster-model based calculations, the substrate, the FAD-hydroperoxide model and the residues within the active site were represented with 348 atoms. These calculations allowed us to deduce a mechanistic pathway for the second phase of the oxidative half reaction. According to these results, KMO-catalyzed hydroxylation reaction involves four transformations in which Asn54, Pro318, and a water molecule, originating from the X-ray structure, also take part. In the first step, the hydroxyl of the hydroperoxy moiety is delivered to L-Kyn ring, where an sp3-hybridized carbon center is formed while the hydrogen of the transferred unit is immediately captured by the proximal oxygen that situated on FAD. These consequent transformations are in line with the somersault rearrangement previously described for similar enzymatic systems. In the second step, a hydride shift results in the formation of the keto form of 3-HK via the transfer of the hydrogen that was bound to the sp3-carbon center of the substrate ring. In the next step, a water assisted tautomerization transforms the keto form into the enol, yielding 3-HK. Reoxidation of FAD is achieved through a water and 3-HK assisted dehydration, marking the final step of the oxidative half reaction. The optimizations of the cluster models were carried out at the B3LYP/6-31G(d,p) level of theory. The single point energies were obtained from the B3LYP/6-311+G(2d,2p) level of theory calculations with solvation (polarizable continuum model) and dispersion (DFT-D3(BJ)) corrections. In the second chapter of this thesis, BBB permeable KMO inhibitors were sought via in silico methods. According to the experimental findings, Cl- anion stabilizes the enzyme and significantly decreases the limiting rate of the reduction. The rate of hydroxylation is also reduced when the experiments were carried out in NaCl solutions. The inhibitor candidates are expected to be similar to the aminobenzyl group containing substrate L-Kyn, to some extent. However, to appreciably eliminate the electron donating ability of the ring, any kind of amine must be excluded and an electron withdrawing group must be included as a substituent. Using the tranche browser of Zinc15, 7561938 in-stock molecules with drug-like properties were obtained. Using Open Babel, only the molecules containing a chlorophenyl group that is not substituted by an amine were selected. This reduced the number of the molecules in the library to 501777. Using AutoDock Vina, the binding affinity ranking of this set of molecules were determined. Starting from the highest scoring molecules, the ADMET properties of these substances were checked using the web-based SwissADME program. ZINC_71915355 passed all the evaluations considered. ZINC_19827377 and ZINC_19458579 were not BBB permeable but were found to be suitable for peripheral administration. The KMO complexes with these molecules were further tested via MD simulations to see if they retain the active site conformational state, which is an important criterion to eliminate H2O2 production. Only ZINC_71915355 and ZINC_19827377 were found to retain the conformational state of the enzyme in the active site. If experimentally confirmed, these two molecules can inhibit KMO without hydrogen peroxide production. After the publication of our results of the first mechanistic investigation, a new X-ray structure of KMO–L-Kyn complex (pdb id: 6FOX) was published. The authors of the communication suggested that the transferred oxygen is not the distal, but the proximal one. This idea stemmed from the positions of the two water molecules which together seem to hold the place of the hydroperoxy moiety. The water oxygen, that seems to hold the place of the proximal oxygen, is closer to L-Kyn and in a more appropriate position to participate in the reaction, in comparison to the one that was associated with the distal oxygen. This idea was one of the two inquiries investigated in the third chapter of this thesis. To be able to correctly represent the structural differences, which include slightly different alignment of FAD's isoalloxazine ring system and L-Kyn, the active site of the new X-ray structure was used in the cluster approach calculations. In this new model, the active site was represented with 386 atoms and the proximal (P-mechanism) versus distal (D-mechanism) oxygen transfer mechanisms were compared. In addition, these transformations were analyzed via natural bonding orbital (NBO) calculations which allowed us to deepen the difference between the two possible transformations and further explain how the working mechanism consistently enables a stable environment for its intermediate states. According to these results, the transformation via P-mechanism requires significantly higher barrier energy and additionally, results in an unexpected L-Kyn derivative. The somersault intermediate of the D-mechanism guarantees the prevention of such derivatives. To further strengthen the thesis against the P-mechanism, the stability of the supposed alignment of the hydroperoxy moiety which paves the way for the P-mechanism was questioned by molecular dynamics (MD) simulations. Starting from that alignment, three 100 ns production runs were carried out. According to the results of these simulations, the alignment was not conserved and therefore the positions of the water molecules were found not to be related to that of the hydroperoxy moiety. In another recent experimental paper, the authors have proposed that L-Kyn participates in its base form in the reaction. The investigation of this interpretation is the last part of the third chapter of this thesis. Although DFT calculations confirmed a much more facile reaction with the base form of L-Kyn, a mechanism that would allow the deprotonation of the L-Kyn before the oxygen transfer could not be determined with the X-ray based positions. A concerted mechanism with both the oxygen transfer and the deprotonation required a high barrier energy. A stepwise mechanism involving the deprotonation of L-Kyn was found, starting from an MD frame. The overall barrier of the oxygen transfer step of this model was found to be in the range of that of with neutral L-Kyn. MD simulations supported the idea of ineffectiveness of the nearby shell surrounding the utilized active site core on the deprotonation of L-Kyn. With this thesis, we hope to help the researchers, who seek novel therapeutic strategies, by elucidating the details of the enzymatic reaction and proposing a potentially BBB permeable noneffector inhibitor candidate.

Kinürenin yolağı, triptofanın katabolizmasıyla nihai ürün nikotinamid adenin dinükleotite (NAD) dönüştürüldüğü biyolojik yoldur. Kinürenin yolağı üzerinde bulunan ve flavin adenin dinükleotite (FAD) bağımlı olarak işlev gören kinürenin 3-monooksijenaz (KMO), A sınıfı bir monooksijenaz türüdür. Bu enzimin ana işlevi, substratı L-kinürenini (L-Kyn), hidroksilasyon reaksiyonu ile 3-hidroksikinürenine (3-HK) dönüştürmektir. Literatürde, 3-HK ve türevlerinin nörotoksik ajanlar olduğu gösterilmiştir. Öte yandan, L-Kyn ayrıca kinürenin aminotransferazın da substratıdır. Bu enzim, L-Kyn'yi nöron koruyucu ajan olarak işlev gören kinürenik aside (KynA) dönüştürmektedir. Bununla birlikte, bu maddenin yüksek seviyeleri bipolar bozukluk ve şizofreni ile ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, KMO bu yoldaki önemli biyoaktif maddelerin seviyelerini düzenlemektedir. KMO katalizli L-Kyn hidroksilasyonunun mekanizmasını anlamak için kapsamlı deneysel araştırmalar yapılmıştır. Bu deneylerden oldukça yararlı bilgiler elde edilmesine rağmen, sadece kısa bir süre boyunca var olabilen L-Kyn türevleri ve bir efektör aktif bölge içine girdiğinde enzimin gösterdiği tepkiye karşılık gelen dinamik haller henüz aydınlatılamamıştır. KMO'ya ait bir başka deneysel araştırma kolu da, KMO'yu inhibe edecek yeni moleküllerin keşfidir. L-Kyn iskeletine dayalı olarak tasarlanan erken dönem inhibitörleri, L-Kyn'nin hidroksilasyonunu önlemede çok başarılı olmalarına rağmen, bir yan ürün olarak serbest hidrojen peroksit oluşumunu tetiklerler. Bu nedenle, literatürde yapısal olarak farklı inhibitörler araştırılmış ve gerçekten de bazılarının hidrojen peroksit üretimini önlediği gösterilmiştir. Bununla birlikte, KMO aktivitesine bağlı hastalıkların çoğunun nörodejeneratif türden olması, KMO inhibitörü tasarımında başka bir kısıtlama olarak ortaya çıkmaktadır: Sözkonusu molekül kan-beyin bariyerini geçmek zorundadır. Bütün bu koşulların biraraya gelmesi işe yarar KMO inhibitörlerinin keşfini zorlaştırmaktadır. Bu tez kapsamında, hesaplamalı yöntemlerden yararlanarak, KMO katalizli L-Kyn hidroksilasyonunun yükseltgeyici yarı reaksiyonuna ait ikinci fazın mekanizmasının aydınlatılması ve yeni KMO inhibitörlerinin keşfi amaçlanmıştır. Bu tezin ilk bölümünde L-Kyn ve model FAD-hidroperoksit arasındaki reaksiyon, yoğunluk fonksiyonel teorisi (DFT) ile incelenmiştir. Başlangıçta, hesaplamalar sadece L-Kyn ve FAD-hidroperoksit modelini içerecek şekilde yapılmıştır. Daha sonra, reaksiyona ait hesaplamalar KMO modelinin varlığında gerçekleştirilmiştir. KMO modeli, protein kompleksinin bir X-ışını yapısından (pdb kodu: 5NAK), enzim reaksiyonlarını modellemede etkili bir yöntem olduğu kanıtlanan, küme yaklaşımı ile elde edilmiştir. Küme modeline dayalı hesaplamalarda substrat, FAD-hidroperoksit modeli ve enzimin aktif bölgesindeki rezidüler toplam 348 atom ile temsil edilmiştir. Bu hesaplamalardan elde edilen sonuçlarla, yükseltgeyici yarı reaksiyonun ikinci fazı için bir mekanizma ortaya konmuştur. Bu sonuçlara göre, KMO katalizli hidroksilasyon reaksiyonu, Asn54, Pro318 ve X-ışını yapısından gelen bir su molekülünün de aktif olarak katıldığı dört transformasyonu içermektedir. İlk aşamada, hidroperoksit kısmının hidroksili L-Kyn halkasına transfer edilir ve bunun sonucunda bir sp3-hibridize karbon merkezi meydana gelir. Bu aşamanın hemen ardından, aktarılan birimin hidrojeni FAD üzerinde bulunan proksimal oksijen tarafından yakalanır. Bu iki ardışık değişim, daha önce benzer enzim komplekslerinin mekanizmalarında da görülen ve de somersault takla düzenlenmesi olarak bilinen dönüşüm ile aynı doğrultudadır. İkinci aşamada, substrat halkasının sp3-karbon merkezine bağlı olan hidrojeninin aktarılmasıyla bir hidrojen kayması meydana gelerek 3-HK'nin keto formu oluşur. Bir sonraki adımda, su destekli bir tautomerizasyon ile, keto formu enol formuna dönüşerek 3-HK ürünü oluşur. FAD'ın yeniden yükseltgenmesi, bir su ve 3-HK destekli bir dehidrasyon yoluyla meydana gelerek yükseltgeyici yarı reaksiyonun son aşaması tamamlanır. Küme modellerinin optimizasyonları B3LYP/6-31G(d,p) teori düzeyinde gerçekleştirilirken nokta enerji hesaplamaları B3LYP/6-311+G(2d,2p) teori düzeyinde, çözünme (polarize edilebilen kontinuum modeli) ve dispersiyon (DFT-D3 (BJ)) düzeltmeleri ile elde edilmiştir. Bu tezin ikinci bölümünde in siliko yöntemleri kullanılarak kan-beyin bariyerinden geçebilen KMO inhibitörleri araştırılmıştır. Deneysel bulgulara göre Cl- anyonu, enzimi stabilize eder ve FAD'ın indirgenme hızını önemli ölçüde azaltır. Deneyler NaCl çözeltileri içinde gerçekleştirildiğinde hidroksilasyon hızı da azalır. İnhibitör adaylarının bir aminobenzil grubuna sahip olan substrata belirli ölçüde benzemesi gerektiği varsayılmaktadır. Bununla birlikte, inhibitör adayı moleküllerin halkalarının elektron verme yeteneğini kayda değer ölçüde ortadan kaldırmak için halkalarda herhangi bir amin grubunun bulunmaması ve halkaya bir elektron çekici grubun bağlanması gerekmektedir. Zinc15'in tranche tarayıcısı kullanılarak, halihazırda mevcut ilaç benzeri özelliklere sahip 7561938 adet molekül yapısından oluşan bir kütüphane oluşturuldu. Open Babel programı kullanılarak, bu kütüphaneden herhangi bir amin türevi sübstitüe olmamış klorofenil grubu içeren moleküller seçildi. Bu şekilde kütüphanedeki molekül sayısı 501777'ye düşürüldü. AutoDock Vina kullanılarak, bu moleküllerin KMO'ya bağlanma enerjisi sıralaması belirlendi. En yüksek skorlu moleküllerden başlayarak, bu moleküllerin ADMET özellikleri web tabanlı SwissADME programı kullanılarak kontrol edildi. ZINC_71915355 kod adlı molekül, dikkate alınan tüm koşulları sağladı. ZINC_19827377 ve ZINC_19458579'un ise kan-beyin bariyerinden geçemeyeceği, ancak periferal uygulama için uygun olabilceği belirlendi. Aktif bölgenin başlangıç konformasyon halinin korunması H2O2 oluşumunu ortadan kaldırmak için önemli bir koşuldur. Bu üç KMO kompleksinin aktif bölgelerinin başlangıç konformasyon halinin muhafaza edilip edilmediği MD simülasyonlarıyla kontrol edildi. Sadece ZINC_71915355 ve ZINC_19827377'nin aktif bölgelerinin konformasyon halinin korunduğu bulundu. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalar gösterdi ki, deneysel olarak doğrulanması koşuluyla, bu iki molekül hidrojen peroksit oluşturmadan KMO'yu inhibe edebilme potansiyeline sahiptir. Mekanizma çalışmalarına ait ilk sonuçların yayınlanmasından sonra, KMO'nun yeni bir X-ışını yapısı (pdb id: 6FOX) yayınlandı ve hidroksilasyon sırasında transfer edilen oksijenin, distal oksijen yerine proksimal oksijen olduğu öne sürüldü. Bu fikir, kristal yapıdaki iki su molekülünün bulunduğu konumlardan dolayı ortaya çıkmıştır ki bu iki su molekülü birlikte, hidroperoksit parçasının yerini tutuyormuş gibi gözükmektedir. Proksimal oksijenin yerini koruduğu düşünülen su oksijeni, distal oksijenle ilişkilendirilen diğer su oksijenine kıyasla L-Kyn'ye daha yakın olup reaksiyona katılmak için daha uygun bir konumdadır. Bu fikrin değerlendirilmesi, tezin üçüncü bölümünde incelenen iki çalışmadan birincisini oluşturmaktadır. Bu bölümdeki kuantum küme hesaplamalarında, FAD'ın izoalloksazin halka sisteminin ve L-Kyn'nin biraz farklı hizalanmasını içeren yapısal farklılıkları doğru bir şekilde temsil edebilmek için, yeni X-ışını yapısının aktif bölgesi kullanıldı. Bu yeni modelde, aktif bölge 386 atom ile temsil edilerek reaksiyonun oksijen transferi aşaması için proksimal (P-mekanizması) ve distal (D-mekanizması) mekanizmaları kıyaslandı. Buna ek olarak, sözkonusu transformasyonlar, iki olası mekanizma arasındaki farkı derinleştirmemize ve sonuçta daha geçerli olduğu ortaya çıkarılan mekanizmanın ara haller için nasıl kararlı bir ortam sağladığını açıklamamıza olanak sağlayan doğal bağlanma orbitalleri (NBO) hesaplamalarıyla analiz edildi. Bu sonuçlara göre P-mekanizması yoluyla meydana gelen transformasyon önemli ölçüde daha yüksek bariyer enerjisi gerektirir ve buna ek olarak beklenmedik bir L-Kyn türevi ile sonuçlanır. D-mekanizmasındaki somersault düzenlenmesiyle, P-mekanizmasında görülen türdeki istenmeyen türevlerin oluşumunun engellendiği ortaya konuldu. P-mekanizmasına karşı ortaya konulan bu tezin daha da güçlendirilmesi adına, P-mekanizmasına olanak sağlayan hidroperoksit kısmının varsayılan hizalanmasının kararlılığı moleküler dinamik (MD) simülasyonları ile sorgulandı. Söz konusu hizalanmadan başlayarak 3 adet 100 ns'lik MD çalışması gerçekleştirildi. Bu simülasyonların sonuçlarına göre, başlangıç dihedral açısı korunmamaktadır. Bu nedenle de su moleküllerinin konumları hidroperoksit parçasının konumuyla doğrudan ilişkili değildir. Yakın tarihli bir başka deneysel makalede, L-Kyn'nin reaksiyonda baz formuyla yer aldığı öne sürülmüştür. Bu değerlendirmenin incelenmesi, tezin üçüncü bölümünün son kısmını oluşturmaktadır. Bu kapsamda gerçekleştirilen DFT hesaplamaları reaksiyonun L-Kyn'nin baz formu ile çok daha kolay gerçekleştiğini teyit etmiştir. Ancak, X-ışını temelli pozisyonlarla gerçekleştirilen hesaplamalarla L-Kyn'ye oksijen transferinden önce deprotonasyonunu sağlayacak bir mekanizma belirlenemedi. Hem oksijen transferi hem de deprotonasyonu içeren bileşik bir mekanizmanın, yüksek bir bariyer enerjisi gerektirdiği bulundu. Bir MD anından alınan pozisyonlardan başlayarak, L-Kyn'nin deprotonasyonunu içeren aşamalı bir mekanizma bulundu. Bu modelin oksijen transfer adımının genel bariyerinin, nötr L-Kyn ile olanınkiyle aynı aralıkta olduğu bulundu. MD simülasyonları, kullanılan aktif bölge merkezini çevreleyen en yakındaki kabuğun L-Kyn'nin deprotonasyonunda etkisiz olduğu fikrini destekledi. Bu tezle, sözkonusu enzimatik reaksiyonun ayrıntılarını aydınlatarak ve kan-beyin bariyerinden geçme potansiyeli olup efektör olmayan bir inhibitör adayı önererek yeni tedavi stratejileri arayan araştırmacılara yardımcı olmayı umuyoruz.