Nükleosit analoğu bazı sitotoksik antineoplastik ilaçların dsDNA ile etkileşim mekanizmaları ve elektrokimyasal analizleri

Abstract

Klinik olarak kullanılan birçok antikanser ilaç antitümör etkisini DNA ile "kovalent ya da kovalent olmayan bağlanma" yolu ile hasar oluşturarak veya DNA sentezini inhibe ederek gerçekleştirmektedir. Ayrıca, birçoğu DNA'yı hedef aldığı zaman sitotoksik etkisinin bir sonucu olarak DNA'nın aktivitesini değiştirerek hücre ölümüne de sebep olmaktadır. DNA'yı direkt ya da dolaylı olarak hedef alan moleküller, klinik kullanım için en etkili antikanser ilaçlardır. Ancak günümüzde klinikte kullanılan antikanser ilaçlarda, seçici olmama ve metastaz kontrol yeteneğinin az olması gibi sorunlar bulunmaktadır. Bu sebeple immünoterapi, hücre döngüsünün modülasyonu gibi yeni yaklaşımlar geliştirilmiştir ve geliştirilmeye de devam etmektedir. Diğer bir taraftan, DNA'ya bağlanabilen ve DNA hasarı oluşturabilen ilaçların bu yeni geliştirilen tedavi yöntemleri ile kombine olarak kullanımlarının pozitif etki gösterdiği de bilinmektedir. DNA'ya bağlanabilen, DNA hasarı oluşturabilen ve sitotoksik özellik gösteren moleküllerin, kanser tedavisindeki olumsuz bazı yan etkilerine rağmen güçlü olan tedavi edici yönleri göz önüne alındığında, daha uzun yıllar bu tür moleküllere ihtiyaç duyulacağı ön görülmektedir. Tüm bunlar düşünüldüğünde klinikte kullanılmakta olan antikanser ilaçların DNA ile olan etkileşim mekanizmalarını tam olarak anlamak, onları daha güvenilir bir şekilde kullanmak ve daha etkili, aynı zamanda seçici ilaçlar geliştirebilmek için son derece önemlidir. DNA'nın sarmal yapısı ve içerdiği baz çiftleri onun küçük moleküllere (ilaç etken maddeleri, metal iyonları, metal kompleksleri, proteinler, bazı organik ve anorganik türler) bağlanmasını veya bu türleri çift sarmal yapının içine almasını mümkün kılmaktadır. DNA ile moleküllerin etkileşimi kovalent bağlanma ve kovalent olmayan bağlanma (moleküller arası zayıf etkileşimler) şeklinde iki yol ile olabilmektedir. DNA ile küçük moleküller arasında meydana gelen kovalent bağlanma, hücre ölümüne sebep olan, geri dönüşümsüz bir süreçtir. Bu süreç, moleküllerin DNA yapısında bulunan major oluklardaki zengin elektron yoğunluğuna sahip guanin(G) ya da adenin(A) bazlarının 7 nolu azot atomuna doğrudan ya da çapraz bağlanmasını içermektedir. DNA ile küçük moleküller arasındaki kovalent olmayan bağlanma ise elektrostatik dış bağlanma, interkalasyon ve oluk(groove) bağlanma şeklinde üçe ayrılmaktadır. Bu tez kapsamında kanser tedavisinde kullanılan ve ciddi yan etkilere sahip altı farklı kanser ilaç etken maddesinin (Azasitidin, Kladribin, Klofarabin, Eltrombopag, Fludarabin ve Pemetrekset) çift sarmal DNA (dsDNA) ile etkileşim mekanizmaları incelenmiştir. Tüm araştırmalarda, spektrofotometrik teknikler (ultraviyole görünür alan ve floresans), voltametrik yöntemler (dönüşümlü, diferansiyel puls ve kare dalga), ısıl bozunma ve viskozite ölçümleri kullanılmıştır. Her bir yöntemden elde edilen sonuçlar doğrultusunda ilaç etken maddelerinin dsDNA ile etkileşim mekanizmaları belirlenmiştir. Ayrıca, her bir molekülün dsDNA'ya bağlanma gücünü gösteren bağlanma sabiti (Kb) değerleri gün içi ve günler arası tekrar edilebilirlik parametleri ile hesaplanmıştır. Farklı sıcaklıklarda yapılan ultraviyole soğurma spektrofotometresi deneylerinden yararlanarak dsDNA-ilaç etkileşimlerine ait Gibbs serbest enerji değişimi (∆G), entalpi değişimi (∆H) ve entropi değişimi (∆S) gibi termodinamik parametreler de hesaplanmıştır. Tez kapsamında gerçekleştirilen tüm dsDNA-ilaç etken maddeleri etkileşimi deneysel çalışmaları sonucunda, Azasitidin ve Eltrombopag etken maddelerinin dsDNA'ya "interkalasyon yolu" ile bağlandığı, Kladribin, Klofarabin, Fludarabin ve Pemetrekset etken maddelerinin ise dsDNA yapısındaki minor oluklara yerleşerek dsDNA ile "groove bağlanma" yaptığı kanıtlanmıştır. Ayrıca teorik çalışan farklı bir araştırma grubu tarafından bu ilaç etken maddelerinin "moleküler yerleştirme" ve "moleküler dinamik simülasyon" çalışmaları da gerçekleştirilmiştir. In silico çalışmalar da ilaçların bu bağlanma modlarını doğrulamıştır. Tez çalışmasının ikinci bölümünde ise dsDNA-ilaç etken maddeleri etkileşimine dayalı miktar tayin yöntemleri geliştirilmeye çalışılmıştır. Sadece, Azasitidin ve Kladribin ilaç etken maddeleri ile dsDNA'nın etkileşimine dayalı iki yöntem geliştirilerek farmasötik dozaj formlarına uygulanmıştır. Yöntem geliştirmede, dönüşümlü, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi teknikleri kullanılmıştır. Bu tekniklerde, yükseltgenme akım sinyalinin hangi pH ve tampon ortamında var olduğunu ya da daha yüksek bir değere sahip olduğunu belirlemek amacıyla farklı tampon ortamlarında (H2SO4, asetat, fosfat) pH taraması yapılmıştır. Çalışılacak tampon ortamı ve pH değeri belirlendikten sonra, ilaçların voltametrik davranışı farklı tarama hızlarında (0.005–1 V/s aralığı) incelenmiştir. Yapılan hız taraması deneyleri sonucunda ilaç etken maddeleri oksidasyonunun difüzyon ya da adsorpsiyon kontrollü olup olmadığı ve reaksiyonun geri dönüşümlü mü, geri dönüşümsüz mü olduğu belirlenmiştir. Bu belirlemeden sonra, Azasitidin ve Kladribin ilaçlarının tayini için hızlı, kolay, doğru, duyarlı, kesin, seçici ve herhangi bir ayırma işlemine gerek duyulmayan voltametrik teknikler geliştirilmiş ve bunların etken madde içeren farmasötik dozaj formlarına uygulanabilirliği istatistiksel olarak gösterilmiştir. Geliştirilen yöntemin gerekli tüm validasyon (yöntem geçerliliği) çalışmaları yapılmıştır. Validasyon parametrelerinden elde edilen sonuçlar; Kladribin için algılama limiti (LOD) değerinin 0.30 µM olduğunu göstermiştir. İlaç etken maddelerinin tayini, dsDNA-ilaç etken maddesinin etkileşimi üzerinden geliştirilen ikinci bir yöntem ile de kıyaslanmıştır. Bu yöntemde kalibrasyon eğrisi, farklı ilaç etken maddesi derişimleri ile dsDNA'nın guanin bazının yükseltgenme akım sinyali arasındaki değişimler izlenerek elde edilmiştir. Bu yöntemde Kladribin için algılama limiti 0.92 µM, Azasitidin için ise 0.62 µM olarak bulunmuştur.