Peptit İle Fonksiyonlandırılmış Nanoparçacıkların Langmuir Blodgett Yöntemi İle Silika Tabanlı Yüzey Üzerine Kaplanması Ve Karakterizasyonu

Abstract

Doğada gözlemlenen birçok yapı hem organik hem de inorganik malzemelerden oluşmuştur. Bu malzemeler makro ve mikro boyutlarda olabiliceği gibi büyük çoğunluğu nano boyutlardadır ve üretimleri nano boyutlarda gerçekleşir. Günümüzde doğanın bu müthiş üretim mekanizmanı taklit ederek yeni malzemeler tasarlamaya ve üretmeye dayalı araştırmalar hız kazanmıştır. Bu hızlı ilerlemede nano bilim ve nano teknolojinin de katkıları büyüktür. Nano bilim, 1-100 nm arasındaki malzeme ve sistemleri inceleyen bilim dalıdır. Doğada bulunan birçok yapı ve doğada gerçekleşen birçok olay nano boyutlarda olduğu için bu bilim alanındaki gelişmeler biyoteknoloji alanındaki gelişmeleri doğrudan etkilemektedir. Nano bilim ve biyoteknoloji alanlanlarının kesiştiği yeni bilim alanına nanobiyoteknoloji adı verilmektedir. Doğanın organik ve inorganik yapıları büyük bir uyum içerisinde sergilediği birçok örnek sayılabilir. İnsan vücudu bunlardan en önemlisidir. Bunların yanısıra doğada organik ve inorganik malzemelerin düzenli bir hibrit yapı oluşturduğu örnekler de mevcuttur. Diş minesi, deniz kabukları, ipek ve manyetik bakteriler bunlara örnek gösterilebilir. Bu yapıların üretiminde doğa hiçbir kimyasal malzeme, yüksek sıcaklık ve pH değerlerine gereksinim duymaz. Bu hibrit yapılı malzemelerin üretiminde moleküler tanıma ve kendiliğinden montaj (self-assembly) mekanizmaları rol oynar. Moleküler tanıma, iki ya da daha fazla molekülün geometrik ve fizikokimyasal özelliklerine dayanarak birleşmesi olarak tanımlanabilir. Bu mekanizma, sıvı bir ortamda birleşen moleküller arasında Van der Waals, elektrostatik etkileşimler ve hidrojen bağları gibi özel bir etkileşim gerçekleşmesi ile olur. Kendiliğinden montaj yönteminde ise dışarıdan herhangi bir müdahaleye gerek kalmadan, moleküllerin kendi kendilerine düzenlenmelerine dayanır. Kendiğinden montaj yöntemi doğanın çok fonksiyonlu malzemeler ve sistemler oluşturmakta sıklıkla uyguladığı bir yöntemdir. Bakterin koloni oluşturmasından, galaksilerin oluşmasına kadar kendiliğinden montaj yönteminin etkin olduğu görülür. Doğanın kullandığı kendiğinden montaj ve moleküler tanıma gibi yöntemlerin protein ve peptitlerin yardımı ile gerçekleşmektedir. Proteinlerin sert dokuların oluşmasında iki önemli görevleri vardır. Bunlardan ilki, mineral kristallerine bağlanarak bunların büyümelerini sağlamak; ikincisi ise, minerallerin bağlanmaları için iskele görevi görmektir. Organik – inorganik hibrit yapıların görevinde rol oynayan bu peptit ve proteinler birçok bilim adamının ilgisini çekmektedir. İnorganik yapıları kendiliğinden ve özel olarak tanıyan peptitlerin ilk eldesi, özel organizmalardan bu peptitlerin moleküler biyoloji yöntemleri ile çıkarılması ile gerçekleştirilmiştir. Ancak bu yöntemin oldukça zahmetli, zaman alıcı ve elde edilebilecek peptitlerin doğada olanlar ile sınırlı olması gibi çeşitli dezavantajları vardır. Bu sebeple bilim adamları ilgilendilendikleri malzemeye özel olarak bağlabilecek peptitlerin seçmek için faj ve hücre gösterim sistemlerini geliştirmişlerdir. Bu alandaki ilginin artması ile de faj ve hücre gösterim kütüphaneleri oluşturulmuştur. Peptitlerin seçiminden sonra bilgisayara dayalı yöntemlerle yeniden dizaynları mümkün olabilmekte, ve peptitler genetik klonlama ile üretilebildikleri gibi, çoğunlukla Fmoc yöntemi ile sentezlenmektedirler. 7-14 amino asit büyüklüğünde sentezlenebilen bu kısa peptitler belirlenen inorganik yüzeylere fizikokimyasal kovalent olmayan bağlarla özel olarak bağlabilirler. Bu peptitler, genetik olarak modifiye edilmiş inorganiğe bağlanabilen peptitler (Genetically Engineered Inorganic Binding Peptides (GEPI)) olarak isimlendirilir. GEPI’ler doğadan esinlenerek yeni malzeme tasarlama ve üretme alanında yapılan çalışmalara hız kazandırmış ve yeni bir bakış açısı katmıştır. Son on yılda, metaller (Au, Ag, Pt ve Pb), oksitler (ZnO, Al2O3 ve SiO2), yarıiletkenler (GaN, Cu2O, TiO2 ve ITO) gibi birçok farklı inorganik malzemeye ve bunların yanısıra grafit, kalsit, mika ve hidroksiapatit gibi fonksiyonel malzemelere bağlanabilen GEPI’ler sentezlenmiştir. GEPI’lerin malzemeye özel olmaları onları diğer peptit ve proteinlerden ayrı kılmakta ve çok geniş uygulama alanlarında kullanılabilmelerini sağlamaktadır. Farklı uygulamalarda kullanılabilirlikleri arttırmak için GEPI’lerin yüzeye bağlanma mekanizmaları araştırılmaktadır. Literatürde bu amaçla yapılan hem deneysel hemde moleküler dinamik yöntemlerle birçok çalışma mevcuttur. GEPI’ler inorganik yüzeyleri fonksiyonlandırmak, hibrit yapılar üretmek ve nanoparçacıklar sentezlemek için moleküler bağlayıcılar olarak kullanılmaktadırlar. Son yapılan çalışmalarda, iki farklı yüzeye özel olarak bağlanabilen ikili fonksiyonlandırılmış GEPI’ler üretilmiştir. Bu ikili fonksiyona sahip peptitler, altın nanoparçacıkların tek bir aşama ile üretiminde ajan olarak ve düzenli hibrit yapıların elde edilmesinde moleküler bağlayıcı olarak kullanılmaktadır. Birden çok yüzeye tanımlı olarak bağlanabilen peptitler oluşturulan hibrit yapıların stabilitelerinin ve fonksiyonlandırılabilirliklerinin artmasında önemli rol oynamaktadır. Nano boyutlarda yüzeylerin modifiye edilmeleri ve fonksiyonlandırılmaları nano- biyoteknoloji ve nanobilim alanlarında büyük öneme sahiptir. Fonksiyonlandırılmış yüzeyler mikro- ve nano-elektronik, kimya, biyokimya ve biyomedikal endüstrilerinde yeni aletlerin üretiminde kullanılmaktadır.Yüzeylerin fonksiyonlandırılmasında kimyasal ve biyokimyasal moleküller kullanılmaktadır. Tiyol ve silan grupları yüzey fonksiyonladırılması amacıyla en yaygın olarak kullanılan moleküllerdir. Yüzeylerde oluşturulan kimyasal gruplar yüzeylere üzerlerine bağlanan hücre, protein ve DNA gibi moleküllere, sıcaklık, pH ve hidrofobiklik/hidrofiliklik gibi çevresel faktörlere karşı sinyal ve seçicilik özellikleri kazandırırlar. Günümüzde, yüzeylerin modifiye edilmelerinde kendiliğinden monolayer oluşturma (SAM) yöntemi ve litografik metotlar yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Ancak bu yöntemler yüksek fiyatları, kompleks yapıları, çevresel faktörlerden etkilenmeleri ve özel ekipmanlar gerektirmeleri gibi çeşitli dezavantajlara sahiptirler. Bunların yanı sıra bu yöntemlerde kullanılan kimyasalların kompleks ve zararlı olmaları biyolojik çaışmalar için uygun değildir ve biyomedikal uygulama alanlarını kısıtlar niteliktedir. Literatürde yapılan çalışmalarda peptit bağlı nanopartiküllerin yüzeye bağlanmaları kendiliğinden montaj ile olabilmekte, bunun yanı sıra PDMS gibi soft litografi yöntemleri de kullanılarak istenilen array ortamına yerleştirilebilmektedir. Langmuir Blodgett yöntemini kullanılarak organik bileşikler istenilen kalınlıklarda tek veya çok katmanlı olarak katı yüzeylere kaplanabilir. LB yöntemiyle metal nanoparçacıkların da katı yüzeylere kaplanması ile ilgili birçok çalışma mevcuttur.LB metodunda küvet içerisinde doldurulmuş olan sıvı bir madde, genellikle su, moleküllerin hava/su arafazında monolayer oluşturulması için kullanılır. Bu nedenle, katı yüzeye çekilmesi istenen moleküller uçucu bir çözücü içerisinde çözülürler. Su üzerine damlatılan solusyondan uçucu çözücü buharlaşırken içerisinde bulunan moleküllerinde suyun üst kısmına doğru çıkmalarına yardımcı olur. Su üzerinde oluşan tek molekül katmanının düzenlenmesi bariyerler yardımı ile gerçekleştirilir. Hava/su arafazında oluşturulan tek molekül katmanının katı bir yüzeye alınması, bu katı yüzeyin belli bir sabit hızla suya daldırılıp çıkarılması ile gerçekleştirilir. LB filmin yapısı faklı parametrelere bağlıdır, bunların en önemlileri moleküllerin yapısı, yüzeyin hidrofilik/hidrofobik olması, pH ve sıcaklıktır. LB tekniği, zorlu ortam şartları ve ekstra zararlı kimyasallar gerektirmemesi nediyle biyolojik olarak uyumlu yapıların üretilmesi için oldukça uygundur. Bu çalışma kapsamında, altın nanoparçacıkların fonksiyonlanmaları için inorganik yüzeylere bağlanabilen multi-fonksiyonel peptitler kullanılmıştır. Bu multi-fonksiyonel peptitler iki adet genetik olarak modifiye edilmiş inorganiğe bağlanabilen peptitlerin (GEPI) esnek bir bağlayıcı ile birleştirilmesinden oluşmaktadır. Peptit sekansı kombinatriyal peptit faj yöntemi veya hücre görüntüleme kütüphaneleri kullanılarak seçilip Fmoc yöntemi ile CSBio 336s peptit sentezleyici cihaz kullanılarak sentezlenmiştir. Bu çalışmada hem altına hem de kuartz’a bağlanma özelliği olan AuBP4-QBP2 peptiti kullanılmıştır. Bu peptidin sekansı RAVRRRSVRREVGGGPWLPPSLPPWPP şeklindedir. AuBP4-QBP2’nin LB yöntemiyle katı yüzeye kaplanabilmesi için su üzerinde monolayer oluşturması gerekmedir. Bu amaçla su, ethanol ve 1:1 ethanol:su çözeltilerinde çözülmüştür. Ethanol uçucu özelliği nedeniyle peptidin suyun üzerinde durmasını sağlayacaktır. Altın nanopartiküllerin peptit ile fonksiyonlandırılmasını sağlamak için oluşturulan peptit solusyonları ile altın kolloidler farklı oranlarda karıştırılmıştır. Bu karışımların spektroskopik analizleri yapılarak, LB film tekniği ile katıyüzeye kaplanması için en uygun oranları içeren solusyonun tayini yapılmıştır. Bu amaçla UV/Vis spektrofotometre ve FT-IR yöntemleri kullanılmıştır. LB film tekniği kullanılarak sadece peptitlerin, sadece altın nanopartiküllerin, peptit ve altın nanopartiküllerin sırayla ve peptit fonksiyonlandırılmış altın naopartiküllerin kuartz yüzey üzerine transferleri gerçekleştirilmiştir. Bu esnada elde edilen isotherm eğrileri ve transfer oranları grafikleri katı yüzey üzerinde elde edilen monolayer film hakkında bilgiler vermektedir. Kaplanmış yüzeylerin mikroskobik incelemeleri AFM ve FEG-SEM yöntemleri ile yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar göstermiştir ki, ikili fonksiyona sahip olan peptitler altın nanoparçacıklara bağlanmaktadır ve onları aglomere olmalarına neden olmaktadır. Peptitlerin çözücüleri altın nanoparçacıkların birleşerek çökelmelerinde ve peptitlerin LB film oluşturmasında önemli etkene sahiptir. AFM ve FEG-SEM sonuçlarında, LB film yöntemi ile oluşturulan alt katmanı peptit, üst katmanı altın nanoparçacık olmak üzere oluşturulan iki katmanlı yapıların peptit solusyonundan ve altın nanoparçacıkların boyutlarından etkilendikleri görülmüştür.

Dimension of systems in vival organisms allows us to benefit from the outstanding property of nano-scale materials especially in medical, biological and small-scale engineering applications. In nature, there are many examples of inorganic – organic hybrid composite structures such as bone, teeth, shells, sponge spicules, silk, magnetotactic bacteria. However, mankind has not been as successful as mother nature in the production of these structures by simple, environmentally friendly, and hierarchical manner. Biomimetics is the science and technology of mimicking nature both for understanding the production methodology and characteristics of these extraordinary materials. By a better understanding of the nature’s way of production of these hybrid nano structured materials, several revolutionary achievements are expected to occur in areas such as contraction of the original cell detection systems, signal and imaging systems, bio-electronic and photonic systems, controlled release systems and biosensors. The implementation of molecular recognition and self-assembly systems is vital for understanding stated materials. In nature, proteins and peptides have an important role in the formation of biological hard tissues. The growth of these biological materials is arisen at room temperature and at neutral pH values. These production processes are directed and controlled by proteins and peptides with molecular recognition and self-assembly methods. Therefore, it is important finding these specific peptides sequences in order to design new materials by mimicking the nature. Selection of peptides can be connected to inorganic substances are carried out using phage or cell display systems via combinatorial biology. After the selection of peptides, it is possible to re-designs them using computer-based methods, and peptides can be produced not only bygenetic cloning but also synthesized by Fmoc method. In the literature, there are studies on surface binding properties of peptide functionalized nanoparticles produced via self-assembly and the PDMS soft lithography methods. Another alternative for controlled deposition of organic materials onto solid surfaces with controlled thicknesses as monolayer / multilayer is the Langmuir Blodgett method. There are several studies in the literature that are utilizing LB technique to assembly metal nanoparticles onto solid supports; however, in these studies complex and harsh chemicals are used to modify the surface structure and gold nanoparticles in order to obtain stable monolayers. These chemical processes are not biologically friendly and limits the applications of sensing in the biomedical area. The originality and the aim of this study are to benefit from the selective binding properties of GEPI for binding nanoparticles to inorganic surfaces (instead of using detrimental chemicals used for this purpose) by LB method. For this purpose silicate based substrates and gold nanoparticles are selected as a model system. We used multi-functional inorganic binding peptide to both for functionalizing gold nanoparticles and the silicate based substrate. These multi-functional inorganic binding peptides were a combination of two different genetically engineered inorganic binding peptides (GEPI) joined a flexible linker. Peptide sequence that was selected from combinatorial peptide phage or cell surface display libraries is synthesized via Fmoc method using CSBio 336s peptide synthesizer by Mustafa Güngörmüs in Washington University. In this regard, AuBP4-QBP2, which has an ability to bind to both gold and quartz, was used in this study. The sequence of the AuBP4-QBP2 was RAVRRRSVRREVGGGPWLPPSLPPWPP. For establishing a monolayer of AuBP4-QBP2 on water surface which is required for mono layer coating on the silicate solid surface using LB method different solvents are used; ultrapure water, ethanol and 1:1 ethanol:ultrapure water. Ethanol allowed standing of the peptide layer on water surface thanks to its volatility properties. Peptide solutions were mixed with the gold colloids in different proportions to create peptide functionalized gold nanoparticles. The amount of nanoparticles required for the production of LB films was determined by spectroscopic analysis of the mixtures. For this purpose, UV/Vis spectrophotometer, spectrofluorimeter and FTIR were used. Solutions comprising of only peptides, only the gold nanoparticles, peptides and gold nanoparticles, mixture of peptide-functionalized gold nanoparticles were transferred on the silica-based surfaces using the LB technique. Surface pressure/Area isotherm graphics were obtained. Transfer ratio and isotherm graphs provided information about the thin film. Coated surfaces were investigated by using AFM and FEG-SEM. Results indicate that the peptides were specifically bind to gold nanoparticles and caused to aggregation of them. The solvent of the peptides significantly influenced the aggregation of the gold nanoparticles and also the LB film formation of peptides onto substrate. According to the AFM and FEG-SEM results, the structure of the LB films consisting of peptides as bottom layer and gold nanoparticles as upper layer were influenced by the solvent used in preparation of peptide solution, the size of gold nanoparticles.