Rational design of hydro- and organo-cryogels

Abstract

Over billions of years of evolution, nature has selected soft materials, i.e. cells and tissues, as vital components for living beings. For instance, articular cartilage tissue in Homo Sapiens covers the bone ends and joints and it provides the actualization of basic movements such as bending of the arms and legs. This tissue can endure almost 1 million cycles per year, and it can be compressed up to a stress of 10 MPa without fraction. In addition, it possesses direction-dependent mechanical properties, i.e. anisotropy. However, these extraordinary mechanical properties of the tissues providing continuity in the lifespan of a living being can not be easily observed in man-made soft materials, i.e. hydrogels. In another word, hydrogels prepared by traditional methods are very brittle materials and some of them can not be endured to even one cycle, and break at Pa- or kPa-order stress values. Besides, their mechanical properties are not direction-dependent and they have isotropic mechanical properties. After revealing nature's design principles in cells and tissues, i.e. when understand their chemical compositions and physical organizations, material scientists started to fabricate mechanically durable materials via mimicking nature. For instance, the mechanical stability of the articular cartilage arises from the extracellular matrix (ECM), which is composed of a structural protein called collagen creating a strong framework, and proteoglycans such as hyaluronan acting as energy dissipative fragments within ECM. Therefore, techniques developed for the preparation of high strength and toughness hydrogels have been mainly based on creating an efficient energy dissipation mechanism within the gel network. Cryogels, i.e. cryogenically synthesized macroporous polymer gel matrices, exhibit this energy dissipation mechanism via poroelasticity effect, due to their interconnected micron-sized pores. Moreover, cryogels possess extraordinary compressive strength up to MPa order as their gel walls originate from unfrozen liquid fractions where the concentrations of the reactants are much higher than that of their initial state. Another advantage of the cryogels is their convenience to orienting the pores as desired to create anisotropy. Within the scope of this thesis, novel hydro- and organo-cryogels were prepared from aqueous and organic reaction solutions of specific polymers, respectively. Therefore, the thesis can be divided into two main parts associated with hydro- and organo-cryogels. The first part, i.e. hydro-cryogel part, is based on two publications, in which anisotropic silk fibroin (SF) cryogels possessing aligned pore morphologies were fabricated by using two different pathways. SF is a natural biopolymer derived from some spiders and silkworms. Due to its extraordinary properties such as biocompatibility, biodegradability and excellent mechanical toughness, it has become a very demanded biopolymer for biological applications. Therefore, SF was used in this thesis in order to fabricate hydro-cryogels. On the other hand, organic solutions of butyl rubber, i.e. synthetic isoprene-isobutylene rubber, were used to synthesize organo-cryogels as macroporous passive sampler sorbents. In the first publication, anisotropic SF cryogels were obtained after directly immersing the reactors containing aqueous SF reaction solutions into liquid nitrogen at various immersion rates. The cryogel scaffolds exhibited a Young's modulus in the range of MPa and sustained up to 20 MPa compressive stresses. In addition to high mechanical strength, they also exhibited anisotropic microstructure and hence anisotropic mechanical properties, e.g., the Young's modulus (E) is 3.4 ± 0.5 MPa and 0.8 ± 0.3 MPa when measured along with the directions parallel and vertical to the freezing direction, respectively. In the second publication, we presented a different experimental set-up consisting of a copper bottom plate and a cylindrical polytetrafluoroethylene (PTFE) mold in order to fabricate anisotropic SF cryogels. The copper bottom plate was immersed in a cold bath at -30 or -196 °C, whereas the cylindrical PTFE mold locating outside of the cold bath was filled with aqueous solutions of SF of various concentrations. Unidirectionally frozen SF solutions were then subjected to cryogelation at -18 °C. Finally, we obtained mechanically strong SF scaffolds exhibiting microstructural, swelling and mechanical anisotropies. The scaffolds exhibited the highest modulus anisotropy of 21 ± 5 so far reported to our knowledge, i.e., Young's moduli E = 2.3 ± 0.5 and 0.11 ± 0.03 MPa measured along parallel and perpendicular to the freezing direction, respectively. We also demonstrated that, independent on the fibroin concentration or direction of the measurements, 60% of the mechanical energy given to the cryogels are dissipated due to the friction between the fibroin pore walls, which is responsible for their squeezability and self-recoverability. In the organo-cryogel part, butyl rubber (IIR) based organo-cryogels as a macroporous passive sampler were fabricated. After obtaining a primer IIR cryogel, i.e. single network (SN) cryogel, double (DN) and triple network (TN) cryogels were also prepared via successive cryogelations that were conducted within the pores of the previous cryogel. These multiple network based-cryogelation technique provided fabrication of IIR cryogels with tunable mechanical properties and pore distributions. For instance, they can be stretched up to 400%, and compressed at least 10-times without any significant mechanical deficiency as compared to the initial state. It was also shown that these IIR-based organo-cryogels can be used as an efficient passive sampler for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), whose sampling abilities mainly depend on their pore size distribution. For instance, SN rubber sorbent absorbed most rapidly PAHs which is attributed to its largest porosity and pore volume. On the other hand, TN sorbent had the highest sorption capacity because of its smaller pores and low porosity, preventing the escape of PAHs from the sorbent to the solution phase at longer time scales. SF-based hydro-cryogels and IIR-based organo-cryogels fabricated within the scope of the thesis are both novel macroporous materials with extraordinary properties. Due to tissue-like MPa-order mechanical properties and anisotropic architecture, SF cryogels are suitable for several biological applications, especially for tissue engineering. On the other hand, fatigue-resistant and stretchable IIR-based organo-cryogels with adjustable pore morphology can be used as a passive sampler sorbent for organic pollutants in environmental applications.

Hücre ve dokular, canlıların hayati öneme sahip bileşenleri olup, fizik perspektifinde belli bir mekanik ve viskoelastik özelliği olan jel benzeri yumuşak malzemelerdir. Milyarlarca yıldır süregelen evrimsel süreçte doğa, canlıları değişen çevreye en uygun şekilde seçip işlemesi ile canlılardaki hücre ve doku gibi yumuşak malzemeleri de şekillendirmiştir. Muazzam fiziksel ve mekanik özelliklere haiz olan dokular, canlıların yaşam süreleri içerisinde belli bir devamlılığın sağlanmasında kilit rol oynamaktadır. Örneğin insanların kemik uçlarında ve eklemlerinde bulunan kıkırdak doku, kemikler arası sürtünmeyi azaltarak kol ve bacakların istenilen şekilde bükülmesini ve sonuç olarak insanın hareket etmesini sağlamaktadır. İnsan yaşamında her sene yaklaşık 1 milyon döngüye maruz kalan kıkırdak doku, ayrıca 10 MPa'lık bir sıkıştırma gerilimine kadar da parçalanmadan dayanabilmektedir. Diğer yandan bu doku yaklaşık 1000 J.m-2 gibi bir parçalanma tokluğuna da sahiptir. Geleneksel yöntemlerle üretilmiş hidrojel gibi sentetik yumuşak malzemeler ise doğanınkilerden oldukça düşük mekanik özelliklere sahip olup; bazıları tek bir tam döngü bile tamamlanmadan çok düşük toklukla Pa ya da kPa mertebesindeki bir gerilim altında parçalanmaktadır. Doğanın biyolojik sistemlerdeki jeller için tasarım prensiplerinin anlaşılması ile, yani hücre ve dokuları oluşturan bileşenlerin kimyasal yapısı ve düzenlenmesinin ortaya koyulması ile, malzeme bilimciler doğayı taklit ederek üstün mekanik özelliklere sahip malzemeler geliştirmeye başlamışlardır. Kıkırdak dokunun yukarıda bahsedilen mekanik özelliklerine sahip olması, ekstrasellüler matriks (ECM) adı verilen ve çeşitli biyopolimerlerin en uygun şekilde düzenlenmesi ile oluşan bir yapıdan ileri gelmektedir. ECM'de kollajen proteini lizil oksidaz enzimi ile çapraz bağlanarak ECM'nin rijit ve yüksek elastikiyete sahip ana iskeletini oluşturmaktadır. Diğer yandan hyaluronan gibi proteoglikanlar ise ECM'nin viskoz karakterini arttırarak yapıda bir enerji dağılım mekanizması yaratmaktadır. Ek olarak, ECM'nin gözenekli yapısı poroelastisite etkisi ile de enerjinin dağılımına katkı sağlamaktadır. Olağanüstü mekanik özelliklere sahip hidrojellerin sentezi için geliştirilen yöntemler de, dokularda olduğu gibi yapıda etkili bir enerji dağıtım mekanizması oluşturmayı esas almaktadır. Örneğin, yaklaşık 20 yıl önce literature giren çift ağyapı tekniği ile sentezlenen hidrojellerin mekanik özellikleri muazzam bir oranda iyileşmektedir. Bunun sebebi, jelin yapısını oluşturan ağyapılardan birisinin kuvvet altında kendisini feda ederek parçalanması; ancak diğer ağyapının bütünlüğü koruyarak tüm sistemin parçalanmasına engel olmasıdır. Diğer bir deyişle, mekanik enerjinin bir kısmı parçalanan ağyapı tarafından dağıtılarak tüm sistem toplamda daha yüksek tokluğa sahip olmakta ve daha fazla mekanik deformasyona dayanacak hale gelmektedir. Çift ağyapılı jellerin haricinde topolojik jeller ve nanokompozit jeller de benzer yaklaşımla sentezlenen, mekanik mukavemeti yüksek yumuşak malzemeler arasındadır. Bu doktora tezinin ana konusunu oluşturan kriyojeller de mekanik dayanımı yüksek malzemelerin sentezi için geliştirilen bir yöntemdir ancak yukarıda bahsedilen jellerden önemli bir farklılığa sahiptir. Bu farklılık, kriyojellerin gözenekli bir yapıya sahip olmalarından ileri gelmektedir. Tamamı donmuş gibi gözüken ancak içerisinde donmamış bölgeler içeren sistemlerden sentezlenen kriyojellerde, donan fazın bir kalıp etkisi görmesi ile gözenekler oluşmakta; donmamış fazda gerçekleşen jelleşme reaksiyonları ile ise gözenek duvarları elde edilmektedir. Birbirleri ile bağlantılı makrogözenekli yapısı kriyojellerin dışarıdan gelen uyarılara da çok hızlı bir şekilde yanıt vermesine imkan tanımaktadır. Örneğin çift ağyapılı jeller her ne kadar mekanik olarak dayanıklı olsalar da, sentezlendikleri monomer veya polimerin özelliğine göre şişme dengesine ulaşmaları günler hatta haftalar sürmektedir. Diğer yandan kriyojellerin kütlece ve hacimce şişme dengesine ulaşması saniyeler içerisinde bile gerçekleşebilmektedir. Parçalanmadan tekrar tekrar sıkıştırılabilme ve uygun çözücülerde çok kısa süreler içinde şişebilme özelliği ile sünger-benzeri kriyojeller, birçok farklı uygulamada kullanıma uygundur. Kriyojeller, sulu ya da organik çözeltilerden veya kolloidal dispersiyonlardan elde edilebilmektedir. Kriyojelleşme yöntemi ile bir kriyojel sentezlemek için ilk olarak uygun bir başlangıç sistemi seçilmeli, ardından bu sistem içerdiği çözücünün donma noktasının altında bir sıcaklığa soğutulmalıdır. Çözücü donarken içerisinde çözünmüş reaktifler dışlanarak yüksek konsantrasyonlu donmamış bölgeleri oluştururlar. Jelleşme reaksiyonları bu donmamış bölgelerde meydana gelirken; donan çözücü kristalleri de kalıp etkisi göstererek kriyojelleşme işlemi ile bir kriyojel sentezlenmiş olur. Jelleşme işleminin ardından oda sıcaklığına getirilen kriyojeller, bu durumda gözeneklerinin içerisinde sentez sırasında donmuş, ancak oda sıcaklığında tekrardan erimiş olan çözücüyü içermektedir. Çözücünün gözeneklerden dondurmalı-kurutucu gibi bir kurutma yöntemi ile uzaklaştırılması ile de kuru durumda bir kriyojel iskeleti elde edilir. Bu tez kapsamında hem sulu hem de organik çözeltiler başlangıç sistemi olarak seçilerek bunlardan sırası ile hidro-kriyojeller ve organo-kriyojeller sentezlenmiştir. Dolayısı ile tez, hidro- ve organo-kriyojellerle ilişkili olacak şekilde 2 ana kısımda ele alınabilir. Saygın bilimsel dergilerde yayınlanmış 3 adet makaleden oluşturulmuş bu tezde ilk iki makale hidro-kriyojeller ile, son makale ise organo-kriyojeller ile ilgilidir. Hidro-kriyojeller, ipek fibroin proteininin sulu çözeltilerinden sentezlenmiştir. İpek fibroin, bazı örümcek türleri ve ipek böceğinden elde edilen doğal bir polimerdir. Fibroin, sahip olduğu biyouyumluluk, kolay işlenebilirlik ve yüksek mekanik mukavemet gibi özelliklerinden dolayı tez kapsamında çalışılan ana malzemelerden birisi olarak seçilmiştir. İpek fibroin kriyojellerinin sentezinden önce tek eksenli dondurma yöntemi ile çözücünün belli bir yönde donması sağlanarak gözenekler yönlendirilmiştir. Bu sistemin uygulanma amacı, dokularda gözlenen anizotropik özelliklerin tez kapsamında sentezlenen ipek fibroin kriyojellerinde de yaratılmasıdır. Böylece, biyolojik uygulamalarda kullanıma uygun, anizotropik mekanik özelliklere sahip ipek fibroin esaslı biyomalzemeler üretilmiştir. Organo-kriyojellerin sentezinde ise bütil kauçuğun benzen içerisindeki organik çözeltileri kullanılmıştır. İzopren ve izobütilen kopolimeri olan bütil kauçuk sentetik bir kauçuk türü olup, endüstride ve akademide oldukça fazla talep görmektedir. Bu tez kapsamında ise bütil kauçuk, çevresel uygulamalarda organik kirleticilerin örneklenmesinde kullanılmak üzere makrogözenekli organo-kriyojellerin üretiminde kullanılmıştır. Birinci makalede anizotropik ipek fibroin kriyojelleri, reaksiyon çözeltisini içeren reaktörlerin (polipropilen şırıngalar) ilk olarak sıvı azota belli bir yönde ve hızda daldırılması (tek eksenli dondurma), ardından -18 °C'de 24 saat bekletilmeleri (kriyojelleşme) ile üretilmiştir. Reaksiyon çözeltisi ipek fibroinin sulu çözeltisi olup, %4.2 ağ/hac konsantrasyonunda ipek fibroinin yanında kimyasal çapraz bağlayıcı olarak 1,4-bütandiol diglisidil eter (BDDE) ve pH ayarlayıcı olarak N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (TEMED) içermektedir. İlk aşamada çözeltiler 2.5 ile 35 mm.dak-1 arasında değişen hızlarla sıcaklığı -196 °C olan sıvı azota daldırılmıştır. İkinci basamakta ise belli bir yönde donması sağlanan çözeltiler kriyojelleşme işlemi için -18 °C'ye ısıtılmış, sonuç olarak ipek fibroinin BDDE ile çapraz bağlanması ile makrogözenekli bir protein ağyapısı (kriyojel) elde edilmiştir. Yönlenmiş gözeneklerinden dolayı anizotropik mekanik özelliklere sahip kriyojellerin anizotropiklik oranları sıvı azota daldırma hızının 2.5'dan 20 mm.dak-1 artması ile önce artmakta, daha yüksek daldırma hızlarında ise düşmeye başlamaktadır. Diğer bir deyişle, en yüksek anizotropiklik oranı sıvı azota 20 mm.dak-1 hızla daldırılan ve ardından kriyojelleşmeye maruz bırakılarak elde edilen kriyojelde gözlenmiştir. Örneğin, bu kriyojelin kuru durumdaki Young's modül değerleri donma yönüne paralel ve dik yapılan sıkıştırma testlerinde sırası ile 3.4 ± 0.5 ve 0.8 ± 0.3 MPa olarak tespit edilmiştir. Yani kriyojeller, yapılan sıkıştırma testinin yönüne göre 4 kattan fazla değişen bir mekanik özelliğe sahiptir. Ek olarak kriyojeller her iki yönde de parçalanmadan tamamen ardışık olarak sıkıştırılabilmektedir. İkinci makalede ise aynı reaksiyon çözeltisini daha etkili bir şekilde tek yönlü olarak dondurmak ve dolayısı ile anizotropiklik oranını arttırmak için farklı bir deney düzeneği tasarlanmış ve kullanılmıştır. Bu düzenek, sıvı azot ile temas eden bakır bir plaka ve bu plakaya sabitlenmiş reaksiyon çözeltisinin konulduğu silindirik politetrafloroetilen (Teflon) bir borudan oluşmaktadır. Bakır ile teflonun seçilmesinin nedeni, ısı iletkenlik katsayıları arasında yaklaşık 1600 kat fark olması ve dolayısı ile çözeltinin aşağıdan yukarıya doğru donarken radyal olarak donma ihtimalini minimuma indirerek anizotropiklik oranını arttırmaktır. Ayrıca, bir önceki çalışmadan farklı olarak bu makalede ipek fibroin konsantrasyonu %2.1 ile %16.7 ağ/hac arasında değiştirilerek ipek fibroin miktarının da kriyojeller üzerine etkisi incelenmiştir. Tüm kriyojeller yönlenmiş gözeneklerinden dolayı anizotropik mekanik ve şişme özelliklerine sahip olup, en yüksek modül anizotropiklik oranı en düşük ipek fibroin konsantrasyonunda (%2.1 ağ/hac) sentezlenen kriyojelde elde edilmiştir. Şöyle ki, kuru durumdaki kriyojel için donma yönüne paralel ve dik yapılan sıkıştırma testlerinde Young's modül değerleri sırası ile 2.30 ± 0.50 ve 0.11 ± 0.03 MPa olarak belirlenmiştir. Bu değerler 20 kattan fazla bir farka karşılık gelip, bu anizotropiklik oranı şimdiye kadar literatürde rapor edilen en yüksek oranlardan biridir. Diğer yandan tüm kriyojeller %85'in üzerinde bir gözenekliliğe sahiptir ve parçalanmadan %100'e kadar tekrar tekrar sıkıştırılabilmektedir. Yapılan döngüsel testler ile fibroin konsantrasyonundan ve test yönünden bağımsız olarak malzemeye verilen mekanik enerjinin de yaklaşık %60'ının dağıldığı hesaplanmıştır. Bu yüksek enerji dağıtım yeteneği kriyojellerin makrogözenekli mimarisi ile ilgilidir ve dokularda da enerji dağılım mekanizması olarak karşımıza çıkan poroelastisite adlı olgu ile açıklanabilir: Gözeneklerin içindeki su, sıkıştırılamazlığından ötürü kuvvet altında ezilen malzemeden dışarı çıkmaya başlar. Verilen enerjinin bir kımı da suyun gözeneklerden çıkması esnasında oluşan sıvı-katı (su-gözenek) ve katı-katı (gözenek-gözenek) sürtünmesinden dolayı dağılmaktadır. Ayrıca, yapılan reolojik ölçümler ile bir deformasyon altında malzemeden dışarı çıkan suyun malzemeyi kayma gerinimine karşı koruduğu da ortaya koyulmuştur. Diğer bir değişle, yaklaşık %10'luk bir kayma gerinimin üzerinde malzemenin tan δ değerinin 1'in üzerine çıktığı, yani sanki katı halden sıvı hale geçmiş gibi davrandığı görülmüştür. Bu bulgu, cihazın gözeneklerden çıkan suyu ölçmesi, dolayısı ile kriyojelin sıvılaşmış gibi görülmesi ile ilişkilendirilmiştir. Devamında yapılan ölçümler, kayma geriniminin tekrardan düşürülmesi ile malzemenin gözeneklerinden çıkan suyu tekrardan emerek, ilk halini tamamen geri kazandığını göstermiştir. Sonuç olarak, gözeneklerden çıkan su, mekanik enerjinin dağılımına katkı sağlarken, malzemeyi yüksek kayma gerinimlerine karşı da korumaktadır. Üçüncü makalede ise farklı nesil gözenek yapılarına sahip bütil kauçuk organo-kriyojelleri, su ortamından polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH)'ların örneklenmesi amacıyla bir "pasif örnekleyici" olarak geliştirilmiştir. Pasif örnekleme, canlılar için çok ciddi zararlara sebep olabilen organik kirleticilerin su, hava gibi ortamlardan izlenmesi ve denetlenmesi için geliştirilmiş bir yöntem olup, diğer örnekleme tekniklerine göre üstün avantajlara sahiptir. Ancak, literatürde şimdiye kadar rapor edilen ve ticari olarak kullanılan pasif örnekleyiciler çok fazlı malzemelerdir. Yani, yapılarında örnekleme işlemini karmaşıklaştıran birden fazla bileşen bulunmaktadır. Diğer yandan bu örnekleyiciler gözenekli bir yapıya sahip olmadıkları için, organik kirleticileri absorplaması ve örneklemesi uzun zaman almaktadır. Bu sorunların üstesinden gelebilmek için, temel bileşen olarak yalnızca bütil kauçuk içeren tek fazlı ve makrogözenekli organo-kriyojeller tez kapsamında üretilmiştir. Kriyojellerin gözenek boyut ve dağılımlarının farklı sayıda aromatik halka içeren PAH'lar için uygun olabilmesi için, tek ağyapılı kriyojelin yanında çift ve üç ağyapılı kriyojeller de tasarlanmıştır. İlk olarak tek ağyapılı bütil kauçuk kriyojeli benzen çözeltilerinden, %5 ağ/hac kauçuk konsantrasyonunda ve sülfür monoklorür (S2Cl2) çapraz bağlayıcısı varlığında sentezlenmiştir. Elde edilen kriyojelin benzer kauçuk çözeltisine daldırılması ve ardından yapılan kriyojelleşme işlemi ile çift ağyapılı kriyojel sentezlenmiştir. Yani, ikinci kriyojelleşme tek ağyapılı kriyojelin gözenekleri içerisinden gerçekleştirilmiş, böylece yeni nesil gözenekler oluşturulmuştur. Üç ağyapılı kriyojel ise benzer şekilde çift ağyapılı kriyojelden üretilerek, kriyojel yapısında üçüncü nesil gözenekler yaratılmıştır. Tüm kriyojeller yüksek mekanik mukavemete sahip olup; yüksek sıkıştırılabilirlik özelliklerinin yanında %400'den fazla bir oranda da çekilebilmektedir. Naftalin, fenantren, floranten ve piren gibi PAH'lar ile yapılan örnekleme testlerinde ise tüm kriyojellerin ticari olarak kullanılan gözeneksiz örnekleyici PDMS'den daha iyi bir performans gösterdiği gözlenmiştir. Kriyojellerin kendi içindeki örnekleme performansları ise doğrudan gözenek yapıları ile ilişkilidir. Şöyle ki, en büyük gözenek boyutlarına ve hacmine sahip olan tek ağyapılı kriyojel, PAH'ları en hızlı şekilde absorbe ederken; en küçük gözenek boyut ve hacmine sahip üç ağyapılı kriyojel ise yavaş bir şekilde PAH'ları absorplamaktadır. Diğer yandan, tek ağyapılı kriyojel hızlı bir şekilde absorplama yapmasına ragmen, büyük gözeneklerinden dolayı PAH'ların bir kısmını tekrardan su fazına verdiği; ancak üç ağyapılı kriyojelin daha küçük gözenekleri sayesinde daha fazla PAH'ı yapısında biriktirebildiği ortaya konmuştur. Sonuç olarak, bu doktora tezi kapsamında sulu ve organik çözeltilerden hidro- ve organo-kriyojeller üretilmiş ve başarılı bir şekilde karakterizasyonları yapılmıştır. Biyouyumlu hammaddelerden sentezlenen ipek fibroin hidro-kriyojellerinin sahip olduğu anizotropik üstün mekanik özellikleri ile doku mühendisliği uygulamalarında uygun olduğu düşünülmektedir. Diğer yandan, gözenek boyut ve dağılımlarının ayarlanabildiği, yüksek tokluk ile çekilebilme özelliğine sahip bütil kauçuk organo-kriyojellerinin ise PAH gibi organik bileşiklerin su fazından örneklenmesi için tek fazlı ve makrogözenekli bir pasif örnekleyici olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.