Vinca Alkaloıtlerının Vinca Türlerinden İzolasyonu Ve Yapı Tayini Ve Vınorelbıne Yüklenmiş Nano-ilaç Taşıma Sistemlerinin Sitotoksik Aktivitelerinin Araştırılması

Abstract

Bu tez çalışması başlıca iki farklı kısımdan oluşmaktadır. İlk kısım, Türkiye’de yetişen üç Vinca türünden (V. minor, V. major ve V. soneri’den) alkaloitlerinin izole edilmesi ve yapılarının tayininden oluşmaktadır. İkinci kısım ise kanser tedavisinde kullanılan dimerik Vinca alkaloitlerinden birinin seçilerek ki bu amaçla Vinorelbin seçilmiş ve farklı üç misel ile hazırlanan nano-taşıyıcı sistemlere yüklenerek fiziksel ve sitotoksik aktivitesi yönüyle incelenmesinden ibarettir. Bilindiği gibi kanser tedavisinde doğal ürünler veya onların yarı-sentetik türevleri oldukça önemli bir yer almaktadır. Günümüzdeki kemoterapötik ajanların en önde gelenlerini yine doğal ürünler veya türevleri ve özellikle de alkaloitler oluşturmaktadır ki başlıcaları Taxol, Catharanthus ve Vinca alkaloitleri veya yarı-sentetik türevlerinden ibarettir. Bunlardan biri olan dimerik Vinca alkaloitlerinin farklı ürünleri akciğer, yumurtalık ve meme kanseri tedavisinde kullanılmakta, fakat Vinca alkaloitleri de dahil tüm antikanser ilaçların pek çok yan tesiri bulunmaktadır. Bu amaçla bu tez çalışmasında hem Türkiyede yetişen Vinca türlerinin alkaloitleri izole edilerek yapıları belirlenmiş ve ilaç olma potansiyelleri araştırılmış, hem de Vinca alkaloitlerinden son yıllarda tedavide sıklıkla kullanılan Vinorelbinin vücuttaki biyoyararlanımı arttırılarak yan tesirlerinin azaltması için hazirlanan yeni ilaç taşıyıcı sistemlerinin misel formu hazırlanarak Vinorelbin yüklemeden ve yüklendikten sonraki fiziksel ve kimyasal özellikleri incelenmiş, yanı sıra sitotoksik özelliklerinde bir değişlik olup olmadığı araştırılmıştır. Yapılan fitokimyasal araştırmada öncelikle toplanan her üç Vinca türünün alkaloit ekstreleri hazırlandı ve kromatografik yöntemlerle içerdikleri alkaloitler izole edilerek kimyasal yapıları modern NMR (1H ve 13C NMR, BB, APT, DEPT, COSY, gHSQC ve gHMBC) ve kütle spektroskopisi başta olmak üzere spektroskopik yöntemlerle tayin edildi. İncelenen üç Vinca türünden Vinca soneri bilim dünyasına henüz kazandırılmış Türkiye’ye endemik yeni bir Vinca türü’dür . Zaten Türkiye’de 4 Vinca türü vardır, bunlardan V. herbacea grubumuz tarafından yakın geçmişte incelenmiştir. Vinca soneri’den - ve -Yohimbin alkaloitlerinin yanı sıra Vallesiachotamine alkaloidi elde edilmiştir. Bu sonuncu alkaloit Vinca minor bitkisinden iso-Vallesiachotaminin yanı sıra Vallesiachotamine de elde edilmiştir, Vallesiachotamine’in Vinca türlerindeki mevcudiyeti ilk kez bu çalışma ile gösterilmiştir. Sonuç olarak, Vallesiachotamine, iso-Vallesiachotamin, - ve -Yohimbin Vinca türlerinden ilk kez elde edilen indol alkaloitleri, Vinca major bitkisinden izole edilerek yapısı aydınlatılan 11-Hydroxypolineuridin ise doğadan ilk kez elde edilen bir indol alkaloitidir. Tezin ikinci kısmını oluşturan Vinorelbinin nanoformülasyonların hazırlanmasında, Vinorelbin (VLB)i lipid bazlı ve ayrıca polimerik miseller oluşturarak hazırladığımız nanoilaç taşıyıcı sistemlerine (MNDD) yükleyip kanserli bölgeyi hedef almak, yüksek geçirgenlik ve alıkonma (EPR) özelliklerine sahip yüksek etki ve düşük yan etkili bir nanoilaç haline getirmeyi amaçladık. Bu amaçla hazırlanılan MNDDs lerden biri hedefli kanser tedaviyi amaçlayan çalışmalarda çok iyi bilinen bir hedeflendirme reaktifi olan DiStearoylPhosphatidylEthanolamine-PolyEthyleneGlycol 2000 (DSPE-PEG 2000) dir. Polimerik Nano-VLB yi hazırlamak için ise iki farklı polimerik misel nano-drug delivery (MNDD) sistem hazırlandı.Onlardan biri dört kollu yıldız şekilli Poly--Caprolactone (PCL), PolyEthyleneGlycol (PEG) den ibaret (PCL4-PEG4) ve diğeri iseY şekilli PCL2-PEG dir. Bu polimerler Prof. Dr. G. Hızal ve Ü. Tunca’nın polimerik sentez araştırma grubunca sentezlendiğinden bu tez çalışmasına dahil edilmemiştir. Bu iki polimerin karakterizasyonları için kritik misel konsantrasyon (CMC) ları ölçülmüş ve dört kollu yıldız polimer için CMC 50 mg/L ve Y şekilli PCL2-PEG miselleri için 1mg/L olarak tatmin edici sonuçlar vermiştir. Sonuçta hem Polimerik Nano-VLB formülasyonları, hem de DSPE-PEG-VLB formülasyonları in vitro koşullarda sitotoksik aktiviteyi arttırsalarda DSPE-PEG-VLB formülasyonlarının hem daha yüksek aktivite göstermesi hem de DSPE-PEG sisteminin polimerik sistemlerden daha yüksek miktarda VLB taşıma kapasitesi göstermesi en azından bizim sonuçlarımız ve bugüne dek yapılan çalışmalara göre lipid bazlı sistemlerin daha iyi ilaç taşıyıcı sistemler olduğunu göstermektedir.

This thesis study mainly consists of two different parts. The first part forms isolation and structure elucidation of Vinca alkaloids from the three Vinca species (Vinca major, Vinca minor and Vinca soneri). The second part consists of loading of a dimeric Vinca alkaloid, Vinorelbine to three different types of micellar nano drug delivery systems (MNDDS) and physical characterization of MNDDS and investigation of their cytotoxic activity. As it is known, natural products or their derivatives have an important place in cancer therapy. Among present chemotherapeutic agents natural drugs or their semi-synthetic derivatives, namely alkaloids from Taxus, Catharantus and Vinca species are the most common drugs. Particularly dimeric Vinca alkaloids which have indeed Catharantus alkaloids and their derivatives are used in lung, ovarian and breast cancer therapy. However, all of the anti-cancer drugs including Vinca alkaloids have numerous side-effects. For this purpose, both isolation and structure elucidation studies for the Vinca alkaloids growing in Turkey were carried out, and the three micellar drug delivery systems were prepared and investigated for their physical properties and cytotoxic activity of the MNDDS with and without Vinorelbine. For the phytochemical research, alkaloids’ extracts of the three Vinca species were prepared, and structure of alkaloids, isolated by chromatographic methods, were determined with modern spectroscopic techniques, namely NMR (1H and 13C NMR, BB, APT, DEPT, COSY, gHSQS and gHMBC) and mass spectroscopy. From the three Vinca species, Vinca soneri has just been brought to the world of science as a new endemic species to Turkey. In fact, there are four species of Vinca in Turkey and among them, investigations on V. herbacea have just now published by our group. Vallesiachotamine and Picrinine were isolated from Vinca soneri as well as α and β-Yohimbine. Vallesiachotamine is also isolated from Vinca minor besides iso-Vallesiachotamine. This is a first isolation of Vallesiachotamine, iso-Vallesiachotamine, α and β-Yohimbine from Vinca species as known Indole alkaloids. It is noteworthy that 11-Hydroxypolyneuridine was obtained from V. major as a new Indole alkaloid in this study. The studies of the second part is the preparation of the Vinorelbine nanoformulations. Vinorelbine is uploaded to one lipid based and two polymeric nano-drug delivery systems. The aim of these formulations is to prepare drug delivery systems which target cancerous tissue by using Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect with high efficiency and lesser side effects. One of the MNDDS used in this study is a very well known targeting carrier, DiStearoyl PhosphatidylEthanolamine-PolyEthyleneGlycol 2000 (DSPE-PEG 2000) which has been used in targeted cancer therapy researches, reported for several times. We also used two different Polymeric MNDDS to produce Nano-VLB. One of them is four arm star-shaped Poly-ε-Caprolactone (PCL), PolyEthyleneGlycol (PEG) (PCL4-PEG4), and the other one is Y shaped PCL2-PEG. These polymers have been synthesized by Prof. Gurkan HIZAL and Umit TUNCA polymer research group and the synthesis procedure was not involved in this study. The structure and synthesis pathway of these two polymers are new and we are reporting characterization of micelles prepared by these two co-polymers. For the characterization of these two polymeric micelles their CMC were investigated and gave satisfactory results (CMC is 50 mg/L and 1mg/L for Star and Y-Shaped PCL-PEG micelles, respectively) and we are introducing two new drug delivery systems for hydrophobic agents by preparing two new Nano-VLB formulations. As a result, although both polymeric nano-VLB formulations and DSPE-PEG formulation showed enhanced in vitro cytotoxic activity, the latter one exhibited higher activity and drug loading capacity than the former one. Thus, it can be summarized that DSPE-PEG systems can be considered as better drug delivery systems, at least based on our experimental results as well as the accumulated knowledge.