Rhodosporidium Toruloidesy 27012 Mayasından Karotenoid Ve Tek Hücre Yağı Üretimi Ve Optimizasyonu

thumbnail.default.placeholder
Tarih
2014-07-09
Yazarlar
Alakraa, Furat
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science and Technology
Özet
Bazı mikroorganizmaların yüksek miktarda lipit ve karotenoidleri depolama kabiliyeti yıllardır bilinmektedir. Son yıllarda yollarının incelenmesi ve üretim koşulları ve kültür ortamlarının optimizasyonu için gerçek çabalar gösterildi. Tek hücreli yağlar (SCO) olarak bilinen mikrobiyal lipit bileşikleri özel ve hassas nitelikleri nedeniyle endüstriyel ilgiye sahiptirler.       Yağlı mayalar (OY) hücresel kuru ağırlıklarının %20’sine kadar lipit depolama kabiliyetine sahip olarak tanımlanmıştır. Bu mayalar toplam mayaların küçük bir bölümünü teşkil eder fakat yaklaşık %25’leri lipidin %25’ini üretebilirler.  Son yıllarda, sentetik renklerin toksikolojik etkileri hakkında artan kanıtlar dünya çapında düzenleyici kuruluşların izin verilen gıda renkleri listesini radikal bir şekilde budamasına yol açmıştır.  Kimyasal olarak sentezlenen saflaştırılmış pigmentlere uygulanan katı kurallar sonucunda ve tüketici tercihleri ile gıda endüstrisinin büyümesinin bir sonucu, güvenli ve uygun renklendiriciler olarak karotenoidlere olan talep artmaktadır.  Mikroorganizmalar karotenoidlerin biyoteknolojik yöntemlerle ucuz üretimini sağlar ve kimyasal senteze bir alternatif oluşturur.  600’den fazla farklı karotenoid bitkiler, bakteri ve mantarlar tarafından üretilir. Ancak, sadece birkaçı kimyasal sentezle faydalı miktarlarda elde edilebilir ve doğal kaynaklarından çıkartılır veya mikrobiyal fermantasyonla elde edilebilir.        Bu çalışmada, karotenoidlerin ve Rhodosporidium toruloides Y27012’den lipitlerin üretimi üzerinde besiyeri katkılarının etkisi araştırılmış ve ayrıca besiyeri bileşenleri, yanıt yüzeyi metodolojisi (RSM) ile optimize edilmiştir.  Çalışmanın birinci bölümünde, ultrasonik (US) destekli ve HCI destekli extrasyon  teknikleri olmak üzere karotenoidlerin Rhodosporidium toruloides Y27012. HCl-‘den çıkarım verimi üzerinde 2 yöntem, kontrol tekniği (öğütme) ile mukayese edildi. Karotenoidlerin HCl destekli extrasyonu, 977±43.25 µg/g karotenoid verimi ve 31.24±0.78 mg/L konsantrasyonu ile US yöntemi ve öğütme (kontrol) ile mukayese edildiğinde en etkin yöntem olarak bulundu.                 Çalışmanın ikinci bölümünde, muhtelif  karbon kaynakları, azot kaynakları ve farklı karbon azot oranları (C/N) ve katkı maddeleri Rhodosporidium toruloides Y27012’den en yüksek karotenoid üretimini elde etmek için araştırıldı. Çalışma süresince lipit içerikleri de belirlendi.  İncelenen azot kaynakları arasında maya özütü karotenoid verimi ve konsantrasyonu (977.12 ± 43.25 µg/g ve 31.24±0.78mg/L) için en iyi azot kaynağı olarak tespit edildi, bunu pepton ve amonyum sülfat izledi. Maya özütü aynı zamanda en yüksek lipit içeriğini ve lipit verimini de verdi (41.71±%1.02, 15.23±2.06g/L).     Pigmantasyonu ve lipit üretimi  için, farklı şekerlerin karbon kaynağı olarak kırmızı maya Rhodosporidium toruloides Y27012 tarafından asimilasyonunda en yüksek karotenoid veriminin,  karbon kaynağı olarak glikozun  C/N = 40 oranında kullanıldığı zaman, 977.12±43.28 µg/g olduğunu gösterdi; ancak bu araştırmadan glikoz ve gliserol kaynakları kullanıldığında lipit içerikte belirgin bir fark bulunmadığının farkına varıldı. Glikozun, gliserol ve ksiloz ile karşılaştırıldığında en düşük  konsantrasyonu veren gliserol (6.16±0.40 g/L)  ile mukayese edildiğinde en yüksek lipit konsantrasyonunu 15.23±2.06 g/L verdi             C/N oranının lipit ve karotenoidlerin üretimine etkisi üzerinde çalışılmak üzere incelendi. Maksimum karotenoid üretimi, C/N= 40 ve 60 oranındaki düşük ortam azot içeriğine kıyasla,C/N 20 oranında elde edildi (24.76±1.78 g/L, 1001±17.87 µg/g). Fakat bu oranda lipit içerikler ve lipit verimleri düşük bulundu. Lipit içeriğinin, C/N’deki artışla (düşük azot) arttığı fark edildi ve en yüksek lipit içerik C/N=60 yüksek oranında gözlemlendi (49.83±%2.53, 16.98±0.79 g/L).     Katkı maddelerinin C/N= 20 oranında ve etanol ilavesi (10 g/L) ile karotenoidler ve lipit üretimi üzerinde etkisi, kontrol numunesi ile karşılaştırıldığında (1732.17±39.45µg/g, 22.92±0.95 mg/L),karotenoid konsantrasyonunda değişiklik olmaksızın karotenoid verimini artırdı, kontrol numunesinde lipit içerik 40.28±%2.44’den 44.92±%5.43’e kadar arttı. Ancak lipit konsantrasyonu kontrol numunesininkine oranla daha düşüktü (8.59±1.05 g/L).           Asetik asit ilavesinin (5 g/L) lipit içerikte muazzam bir artış yarattığı fakat asetik asit ilave edildiğinde karotenoidlerin saptanmadığı not edildi.      Bazı katkı maddeleri %0.1 (v/v) gibi düşük konsantrasyonlarda ilave edildiğinde, karotenoid verimi üzerinde herhangi bir etkileri olmadı ve karotenoid konsantrasyonu hala hemen hemen yaklaşık 20 mg/L civarındaydı. % 1 (v/v) gibi yüksek konsantrasyonda Tween 80 ve Tween 20 ilave edildiğinde ve  C/N=20 oranında olacak şekilde ayarlandığında, karotenoid veriminde ve karotenoid konsantrasyonunda bir artış gözlemlendi. Tween 80 sırasıyla 25±2.07 mg/L, 1014.46±68.44 µg/g karotenoid verimi ve konsantrasyonu verdi. Her ne kadar Tween 20, herhangi bir aktifleştiricisiz kontrol numunesinden daha yüksek olan 25.26±1.19 mg/L vermiş olsa da, karotenoid verimleri (1002.79±46.87 µg/g), kontrol numunesi ile mukayese edildiğinde küçük fark ve hücre biokütlesinde azalma ile hemen hemen aynı idi (1001.51±17.87 µg/g). Yani C/N=20 oranına sahip düşük glükoz konsantrasyonlarında, %1’lik (v/v) Tween20, Tween 80 kontrol numunesine kıyasla karotenoid veriminde az   bir artışla beraber karotenoid konsantrasyonunu arttırdı.             %0.1 ve %1 (v/v)’de Tween 80 ve Tween 20 ilave edilmesi lipit içerikte artışa neden oldu ve %1 (v/v)’de Tween 80 ilave edildiğinde en yüksek lipit içeriği 66.33±%1.38’e ulaştı. Ancak, Pamuk tohumu yağı ve keten yağı %0.1 ve %1 (v/v)’de kullanıldıklarında, Rhodosporidium toruloides Y27012 herhangi bir karotenoid üretmedi ve ortamın fermantasyondan 5 gün sonra bile hala herhangi bir rengi yoktu. Çalışmanın üçüncü bölümünde yanıt yüzeyi metodolojisi (RSM) biokütle, karotenoidler ve lipitlerin üretimi için ortam katkı maddelerini optimize etmek üzere uygulandı.  RSM sadece büyüme ve üretimi geliştirmekle kalmaz aynı zamanda süreç değişkenliğini, gelişim süresini ve genel maliyetleri de düşürür.    Gözlemlenen deneysel değerlere karşın model tarafından öngörülen değerlerin grafik çizimi yanıt için biokütle, lipit içerik ve karotenoid verimi için tepki olarak lineer bir dağılım gösterdi (sırasıyla R²=0.947, 0.959 ve 0.921).Bu, biokütle, lipitler ve karotenoidlerdeki %92  ̴  96’ya kadar olan değişimlerin bu denklemlerle açıklanabileceğini gösterdi.        F model değerleri F tablosuna kıyasla yüksek olduğundan, biokütlenin modeli öngörü için fazlasıyla uygundu.     Biokütle kaynaşması üzerinde en önemli etkilerin etanol olarak bulunduğu gözlemlendi. "Glikoz", "etanol*ethanol" ve "glikoz* etanol" (p> 0.05) olarak biyokütle üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.  Oysaki "glikoz*glikoz", "maya özütü*maya özütü", "etanol* etanol", ve "maya özütü*etanol"’ün, (p> 0.05) olarak lipit içerik üzerinde bir etkisi vardır. Diğer yandan  "maya özütü*maya özütü", "etanol* etanol", ne "glikoz*maya özütü"’nün karotenoid verimi üzerinde etkileri vardır.     RSM ile optimizasyondan sonra azami biokütlenin (18.78 g/L), 9.2819 g/L’lik glikozda ve 1.78 g/L’e azaltılmış maya özütünde, aynı zamanda, azami lipit içeriğin (%75.1405) azaltılmış maya özütü oranında (1.77g/L) elde edildiği ortaya koyuldu. Azami karotenoid verimi (1680.25 µg/g) 6,43 g/L’lik glikoz konsantrasyonunda ve göreceli olarak yüksek maya özütü konsantrasyonunda elde edildi.     RSM ile optimizasyondan sonra münferit karotenoidler ve yağ asidi bileşimleri yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisi (GC) ile saptandı.        Yağ asidi bileşimi dört ana yağ asidi bileşeni ortaya koyulduğunu gösterdi; oleik asit (18:1), palmitik asit (16:0), stearik asit (18:1) ve linoleik asit (18:2). Oleik asit %38.54, takiben palmitik asit (%20.82), sonra palmitoleik asit (%12.71),  linoleik asit (%12.01), stearik asit (%4.4%), palmitoleik asit olarak gözlemlendi. Diğer yağ asitleri düşük oranlarda idiler.
The ability of certain microorganisms to accumulate high amount of lipid and carotenoids has been known for years. In the last years, real efforts have been made to study their pathways, and optimization of production conditions and culture medium. Microbial lipid compounds, known as single cell oils (SCO) have industrial interest due to their particular and precise properties. Oily yeasts (OY) have been described to be able to accumulate lipid up to 20% of their cellular dry weight. These yeasts represent minor proportion of the total yeasts, but about  25% of them are able to produce 25% of lipid.  In recent years, increasing evidences for toxicological effects of synthetic colors have prompted regulatory agencies worldwide to drastically prune the list of permitted synthetic food colors. As a result of stringent rules and regulations applied to chemically synthesize purified pigments, and consumer preferences and growth of food industry, demand of carotenoids as safe and suitable coloring agents is on rise. Microorganisms offer economical production of carotenoids through biotechnological methods and provide an alternative to chemical synthesis. More than 600 different carotenoids are produced by plants, algae, bacteria, and fungi. However, only a few can be obtained in useful quantities by chemical synthesis, and extracted from their natural sources or obtained by microbial fermentation. In this work, effect of medium additives on the production of carotenoids and lipids from  Rhodosporidium toruloides Y27012 were investigated and furthermore medium components were optimized by response surface methodology (RSM).  In the first part of the study, two methods such as ultrasonic (US) assisted  and HCl  assisted extractrion techniques were compared with control technique (grinding) on carotenoids extraction yield from Rhodosporidium toruloides Y27012.HCl-assisted extraction of carotenoids was found to be the most effective method with a carotenoid yield of 977±43.25 µg/g and concentration of 31.24±0.78 mg/L, compared with US method and grinding (control).   In the second part of the study, various carbon sources, nitrogen sources and different carbon to nitrogen ratios (C/N) and additives were investigated in order to obtain the highest carotenoids production from Rhodosporidium toruloidesY27012. Lipid contents were also determined during the study.  Among the nitrogen sources that were examined, yeast extract was found to be the best nitrogen source for  carotenoids yield and concentration (977.12 ± 43.25 µg/g and 31.24±0.78mg/L) followed by peptone and ammonium sulfate.    Also yeast extract gave the highest lipid content and lipid yield (41.71±1.02 %,15.23±2.06g/L ). Assimilation of different sugars as carbon source by the red yeast Rhodosporidium toruloidesY27012for its growth and pigmentation showed that highest carotenoids yield was 977.12±43.28 µg/g when glucose was used as carbon source at C/N ratio of 40, whereas It was noticed from this research that no clear difference between  lipid content was found  when  glucose and glycerol sources were used. Glucose gave the highest lipid concentration 15.23±2.06 g/L compared with glycerol (6.16±0.40 g/L) which gave the lowest one compared with glucose and xylose.  The effect of C/N ratio was examined to study its effect on lipid and carotenoids production. The maximum carotenoids production was obtained at C/N ratio of 20 (24.76±1.78 g/L, 1001±17.87 µg/g) compared with low medium nitrogen contents at C/N ratio of 40 and 60. But at this ratio lipid contents and lipid yields were found to be low. It was noticed that lipid content increased with the increase in C/N (low nitrogen), and the highest lipid content was noticed at high C/N ratio 60  (49.83±2.53%, 16.98±0.79 g/L). Effect of additives on carotenoids and lipid production at C/N ratio of 20 and ethanol addition (10 g/L) increased the carotenoid yield with no change in carotenoid concentration compared with control sample (1732.17±39.45µg/g, 22.92±0.95 mg/L), lipid content increased until 44.92±5.43% from 40.28±2.44% in control sample. But the lipid concentration was lower (8.59±1.05 g/L) compared with the control one.  It was noticed that addition of acetic acid (5 g/L) made a huge increase in lipid content but the carotenoids were not detected when acetic acid was added. When some additives were added  at low concentration such as 0.1% (v/v), they did not have any effect on carotenoid yield, but carotenoid concentration was still almost the same around 20 mg/L. When Tween 80 and Tween 20 were added at high concentration such as 1% (v/v) and glucose was adjusted to have C/N ratio of 20,  an increase in  carotenoid yield and carotenoid concentration were observed. Tween 80 gave 25±2.07 mg/L, 1014.46±68.44 µg/g carotenoids yield and concentration, respectively. Although  Tween 20 gave 25.26±1.19 mg/L which was higher than control sample without any activators, but the carotenoid yields was almost the same with littile difference (1002.79±46.87 µg/g) compared with the control sample (1001.51±17.87 µg/g) with decrease in cell biomass. So at low glucose concentrations to have C/N ratio of 20, Tween20, Tween 80 at 1% (v/v) increased the carotenoid concentration with little increase in carotenoid yield compared with control sample.  Adding Tween 80 and Tween 20 at 0.1% and 1% (v/v) caused increase in lipid content, and the  highest lipid content reached to 66.33±1.38 % when Tween 80 was added at 1% (v/v). Whereas when cotton seed oil and linseed oil were used at 0.1% and 1% (v/v),  Rhodosporidium toruloides Y27012 didn’t produce any carotenoids and the medium was still without any color even after 5 days of fermentatio  In the third part of the study, response surface methodology (RSM) was applied for optimizing the medium additives for the production of biomass, carotenoids and lipids. RSM  can not only improve growth and production, but also reduce process variability, development time, and overall costs. The graphic plot of predicted values by the model vs. observed experimental values showed a linear distribution for biomass , lipid content, and carotenoid yield(R2=0.947, 0.959, and 0.921, respectively) for the response, This indicated that up to  92  ̴  96 % of the variations in biomass, lipids , and carotenoids can be explained by these equations. The model of biomass was highly appropriate for the prediction since the Fmodel values was high compared to the F table. It is obsorved that the most important effects on biomass  incorporation was found as ethanol. "Glucose" , "ethanol*ethanol" , and "glucose* ethanol" do not have any effect on biomass as (p>0.05). Wherease "glucose*glucose",  "yeast extract*yeast extract", "ethanol* ethanol", and "yeast extract*ethanol" have an effect on lipid content as (p
Açıklama
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Instıtute of Science and Technology, 2014
Anahtar kelimeler
Rhodosporidium Toruloides Y27012, Karotenoid, Tek Hücre Yağı, Lipit, Yağ Asitleri, Rhodosporidium Toruloides Y27012, Carotenoids, Single Cell Oil, Lipid, Fatty Acids
Alıntı