Kitosan Nanolifleri Üzerine Β-galaktosidaz İmmobilizasyonu

Abstract

Enzimler, gıda, eczacılık, kozmetik gibi bir çok endüstriyel alanda kullanılan proteinlerdir. Spesifik reaksiyonlara girebilmeleri ve prosesteki etkinlikleri nedeniyle geniş kullanım alanlarına sahiptirler. Ancak günümüzdeki enzim kullanımının büyük kısmı enzimlerin serbest şekilde proses ortamına katılmasıyla gerçekleşmektedir. Bu da yüksek miktarda enzim kullanımı anlamına gelmektedir. Serbest halde kullanılan enzimleri prosesten geri kazanmak zordur. Bu nedenle çoğu proseste geri kazanılmadan yalnızca bir kez kullanılmaktadırlar. Ayrıca değişken proses şartlarına, yüksek veya düşük pH, yüksek sıcaklık gibi zorlu şartlara dayanıksızdırlar. Bu da, enzimlerin kullanım alanını daraltmaktadır. Enzimlerin saflaştırılması ve üretiminin zorluğu düşünüldüğünde bu durumun büyük bir maddi kayba yol açtığı sonucuna varılmaktadır. Enzimlerin geri kazanımı için kullanılan mevcut bazı yöntemler yüksek enerji tüketiminin yanında uygulama zorluğu ve zaman kaybı açısından tercih edilmezler. Bu amaçla enzimlerin serbest olarak değil; immobilize, yani bir yüzeye tutunmuş halde kullanılması denenmiştir. İmmobilizasyon ile enzimin stabilitesinin, yarı ömrünün önemli ölçüde arttırıldığı görülmüştür. Bunun ardından immobilize edilmiş enzimin aktivite yönünden de performansını arttırmak için çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda, aktivitenin ve hassasiyetin önemli ölçüde enzimin bağlandığı yüzeye ve bağlanma metoduna bağlı olduğu görülmüştür. Çeşitli inorganik veya organik, hidrofilik veya hidrofobik, porlu veya porsuz yüzeyler denenerek farklı maddelerin aktiviteyi nasıl etkilediği araştırılmıştır. Nanoteknolojinin de gelişmesiyle nano boyuttaki malzemelerin immobilizasyon yüzeyi olarak kullanılabileceği anlaşılmıştır. Nano malzemeler makro ve mikro boyutlarına göre farklı fiziksel ve kimyasal özellikler taşırlar. Bu özellikler, enzim performansını belli yönlerden geliştirdiğinden, nano yapılar enzim immobilizasyonu için tercih edilebilir olmuşlardır. Nanolifler, nano malzemeler arasında yüzey alanı genişliği, üretiminin kolaylığı, ucuzluğu ve yüzey özellikleri bakımından en dikkat çekici yapılardan biridir. Nanoliflerin çapı 1-100 nm aralığındadır. Elektroeğirme (elektrodöndürme) metoduyla kolaylıkla üretilebilirler. Elektroeğirme basit ve ucuz bir yöntemdir. Elektroeğirme metodu bir güç kaynağı, bir pompa ve toplayıcı plakadan oluşur. Kullanılacak polimerin çözeltisi bir şırınga içerisinde pompaya yerleştirilir. İğnenin ucu güç kaynağına bağlanır. Güç kaynağının çalıştırılmasıyla sisteme yük verilir ve bir elektriksel alan oluşur. Pompa belli bir hız ile elektriksel alana çözeltiyi besler. Elektrik alanın etkisiyle polimer metal toplayıcı plakada toplanır. İmmobilizasyon yüzeyi olarak porlu cam ve silika gibi inorganik maddeler; polisakkaritler ve sentetik polimerler seçilebilir. Sentetik polimerlerin fonksiyonel özellikleri, ucuzluğu ve kolay ulaşılabilirliği; yüzey olarak kullanım açısından avantajlıdır. Bunun yanında sentetik polimerle nanolif üretimi, polisakkaritlere göre daha kolaydır. Biyopolimerlerin (polisakkaritler ve proteinler) elektroeğirme yöntemiyle nanolif haline getirilmesi kompleks kimyasal yapılarından dolayı zordur. Bu nedenle biyopolimerlerle sentetik polimerler karıştırılarak nanolif üretiminde kullanılabilir. Bu çalışmada polimer olarak kitosan seçilmiştir. Kitosan biyobozunur, biyofonksiyonel, toksik olmayan ve antibakteriyel özellik gösteren bir maddedir. Proteinlerle etkileşiminin iyi olmasının yanında, mekanik dayanıklılığı yüksek bir polimerdir. Organik polimerle nanolif üretiminin zorluğu nedeniyle kitosanın uygun bir çözeltide iyice çözünmesi ve nanolif üretiminin ardından aktive edilmesi gerekir. Aktivasyon ile kitosan nanolifi üzerindeki enzimlerin bağlanabileceği aktif kısımların çoğaltılması amaçlanır. Aktivasyon işlemi ile kitosanın fonksiyonel grupları eşleşir ve stabil bir yapı elde edilir. Böylelikle suda çözünebilir olan kitosan nanolifinin sulu çözeltide çözünebilirliği engellenir. Çalışmada immobilize edilmek üzere gıda endüstrisinde laktoz parçalamada sıkça kullanıldığı bilinen β-galactosidaz seçilmiştir. Laktoz intoleransı olan insanların dünya nüfusunun yaklaşık %70’ini oluşturduğu bilinmektedir. Laktoz intoleransı, laktaz enziminin vücuttaki eksikliğini ifade eder. Bu kişilerde laktoz alımı, kramplar, kusma, ishal gibi sağlık problemlerine yol açar. β-galactosidaz enziminin dışarıdan alımı ile laktoz glukoz ve galaktoza parçalanır ve bu etkiler azaltılabilir veya giderilebilir. β-galactosidaz süt endüstrisinde ürün kalitesini ve proses verimini arttırmak ve süt ürünlerinin sindirilebilirliğini arttırmak için kullanılır. İmmobilizasyon ile bu enzimin ısıl stabilitesinin arttırılabileceği ve tekrar kullanılabilirliğinin sağlanabileceği bilinmektedir. Bu tezin amacı kitosan nanolifleri üzerine immobilize edilmiş β-galaktosidaz’ın ısıl stabilitesini ve tekrar kullanılabilirliğini araştırarak etkin bir enzim tutuklama yüzeyi oluşturmaktır. Çalışmada çözelti olarak trifluoroasetik asit (TFA) ve diklorometan (DCM) ve ayrıca asetik asit kullanılmıştır. TFA uçucu bir asit olduğundan çalışılması zor ve tehlikeli olabilmektedir. Bunun için öncelikle asetik asit ile kitosan çözeltisi hazırlanmış ve nanolif üretimi denenmiştir. Kitosanın asetik asit içerisinde çözünmesiyle nanolif elde edilememiştir. Kitosana polivinil alkol (PVA) katılarak nanolif üretimi gerçekleştirilmiştir. Ancak PVA’nın uzaklaştırılması ayrıca bir işlem gerektirdiğinden ve oluşan nanolifin çoğu PVA olduğundan verimli sonuç alınamamıştır. Bunlar üzerine kitosan TFA ve DCM içerisinde çözünmüştür. 95 saatlik nanolif üretimi sonucunda, 1.35 g kitosan nanolifi elde edilmiştir. Enzim bağlama metodu olarak kovalent bağlama seçilmiştir. Bunun sebebi kovalent bağlamanın yüzey ile enzim arasında en stabil bağı oluşturan yöntem olmasıdır. Kovalet bağlama ile enzimin taşıyıcı yüzeyden ayrılması minimize edilir. İmmobilize enzimin ortamdaki diğer moleküllerle etkileşime geçmesi engellenir. Kovalent bağlama için kimyasal aktive edici ajanlar kullanılması gerekir. Bu ajanlar ile enzimin bağlanma verimi ve yüzey üzerindeki mobilitesi arttırılır. Bu çalışmada kitosan nanoliflerini aktive etmek için glutaraldehit (GA) kullanılmıştır. Üretilen nanolifler ayrı ayrı GA buharı ve GA’nın %4’lük çözeltisi ile aktive edilmiştir. Çalışmadaki ölçümler enzim aktivitesinin spektrofotometrik olarak belirlenmesi ile gerçekleştirilmiştir. Substrat olarak β-Galactosidase ile reaksiyonu sonucunda sarı renkli bir bileşik veren o-Nitrofenil ß- D – Galactopiranosit (ONPG) seçilmiştir. Belirli konsantrasyonlarda enzim ve substrat reaksiyonu sonrasında oluşan sarı renkli çözeltinin, spektrofotometrede absorbansı ölçülmüştür. Absorbansların bulunmasının ardından kullanılan eşitliklerle enzim aktivitesi ölçülmüştür. GA ile aktif hale getirilmiş kitosan nanolifler farklı konsantrasyonlardaki enzim çözeltilerinde inkübe edilerek enzim yüklemesi yapılmıştır. Buna göre 0,25 mg enzim/ml konsantrasyondaki enzim çözeltisinde inkübe edilen nanoliflerin 69±20% oranına kadar enzim yüklenebildiği görülmüştür. 0,025 mg enzim/ ml konsantrasyonlu enzim çözeltisinde bekletilmiş nanoliflerde ise immobilizasyon verimi % 59±20’ ye kadar çıkarılabilmiştir. Bu sonuç, artan enzim konsantrasyonunun, enzimin yüzeye bağlanma şansını arttırarak immobilizasyon verimini arttırabileceğini göstermiştir. İmmobilizasyon verimini arttırabilmek için nanolifler GA buharıyla muamele edilmiş, sonrasında ise GA çözeltisinde bekletilmiştir. Her iki işlemin ardından da enzim yükleme verimi ölçülmüştür. Nanoliflerin GA buharı ile muamele edilip, sonrasında %4’lük GA içinde bekletilmesiyle; immobilizasyon verimliliği sadece GA buharı ile muamele edilmiş nanoliflere göre %46±20 arttırılmıştır. Enzim yüklenmiş kitosan nanoliflerine termal stabilite ve tekrar kullanılabilirlik testleri yapılmıştır. Termal stabilite için 30°C, 50°C, 70°C ve 90°C’lerde immobilize ve serbest enzim için aktivite ölçümleri yapılmıştır. Ölçümler 3 tekrarlı gerçekleştirilmiştir. En yüksek aktivite hem serbest enzim hem de immobilize enzim için 50°C’de ölçülmüştür. 50°C’deki bu aktivite %100 aktivite olarak kabul edilip farklı sıcaklıklardaki aktivite değişimi yüzde olarak ifade edilmiştir. 50°C üzerindeki sıcaklıklarda aktivite hem serbest enzim hem de immobilize enzim için azalmıştır. Ancak 70°C’de serbest enzimin aktivitesi 50°C’deki aktivitesinin%31±0,01 ‘ine kadar düşerken immobilize enzimin aktivitesi %73,5±0,1’e kadar düşmüştür. Bu sonuçlar immobilizasyonun termal stabiliteyi arttırdığını göstermiştir. Tekrar kullanılabilirlik testinde 0,1 mg enzim içeren 5 mg’lık iki farklı nanolif seti farklı şartlarda 10’ar defa kullanılmıştır. Her iki sette de tekrar olarak 5 farklı nanolif kullanılmıştır. Birinci nanolif seti her kullanımda 40’ar dakika bekletilirken, ikinci nanolif seti 15’er dakika bekletilmiştir. Her kullanım sonrasında nanolif üzerine immobilize edilmiş β-galaktosidazın aktivitesi ölçülmüştür. 10 kullanım sonunda, her kullanımda 40 dakika işleme maruz bırakılan nanolifler başlangıç aktivitesinin %29±7’sini korurken ikinci nanolif seti %68±13’ünü koruyabilmiştir. Buradan uzayan proses süresinin enzim aktivitesini ciddi ölçüde azalttığı sonucuna varılmıştır. İkinci nanolif setinin 10 kullanım sonucunda aktivitesinin %68±13’ünü koruması, literatürdeki değerlerle karşılaştırıldığında kitosan nanoliflerinin tekrar kullanılabilirliği açısından umut verici bir sonuçtur. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlarla, literatür verileriyle karşılaştırıldığında, kitosan nanoliflerinin endüstriyel uygulamalarda enzim tutuklaması için uygun materyaller olduğu çıkarılmıştır. Ancak kitosanın toksik olmaması, biyobozunur olması ve gıda uygulamalarında kullanılabilir olması dışında, kitosanın TFA ve DCM gibi sağlık açısından tehlikeli çözücülerde çözünerek üretilmiş olması gıdada uygulama açısından risk oluşturmaktadır. Nanolifi aktive etmek için kullanılan ajanlardan biri olan GA toksik bir madde olduğundan kalıntısı sağlık açısından tehdit oluşturabilir. Üretilen nanolif üzerinde çözelti kalıntısı olabileceğinden ve bu kalıntı proses sırasında ürüne karışabileceğinden gerekli toksikolojik çalışmalar yapılmalıdır. Bunun dışında nano boyutta maddelerin kimyasal ve fiziksel özelliklerinin değiştiği bilinmektedir. Bu nedenle nano-malzemelerin vücuda alındığında ne gibi sonuçlara yol açacağı, vücuttaki moleküllerle nasıl etkileşime gireceği tam olarak bilinmemektedir. Bunlar dışında, kitosan nanoliflerinin tekrar kullanılabilirliği enzim immobilizasyon yüzeyinin geri kazanımınn önemini göstermiştir. Bunu göz önünde bulundurarak gelecek çalışmalarda kitosan nanolifinin geri kazanımı araştırılmalıdır. Bunun için üretim sırasında nanolife manyetik özellik kazandırılarak proses sonrası geri kazanım sağlanabilir. Kitosan nanolifleri enzim endüstrisinde kullanım açısından gelecek vadetmektedir. Ancak gıda endüstrisinde kullanılması için öncelikle gerekli düzenlemelerin ve mevzuatın oluşturulması gerekmektedir.

Enzymes are biocatalysts which offer a wide variety of specific functions. Large amounts of enzymes are used in native forms at industrial scale. Use of free enzyme means one-time application with no chance of recovery and reusability. Additionally free enzymes show low stability in harsh processing environments. They are sensitive to changing processing conditions such as pH and temperature change. Immobilized enzymes serves some opportunities for recovery and multiple use of enzymes providing higher stability and selectivity. Enzyme immobilization is defined as the attachment of a free enzyme on a carrier (supporting) surface which restricts or prevents the mobility of the enzyme. Immobilization technique was started to be used in 1916. The studies showed that immobilization facilitates higher stability in challenging processing conditions. In the following years, the performance of immobilized enzyme was studied to improve it. It was discovered that performance of the immobilized enzyme is highly dependent on the surface characteristics and binding methods. Afterwards, novel carrier materials and methods were studied. Inorganic or organic, hydrophilic or hydrophobic, porous or nonporous features of the carrier has altered the interaction of the enzyme with the surface. It affected the activity and the stability of the immobilized enzyme. With development of nanofibers it was found that nanomaterials has a promising potential as carrier surfaces due to their high surface area. The change of some biological and chemical characters in nanoscale compared to the macro or micro scales, pointed out that nanomaterials nano-materials can be utilized in broad range of applications. Nanotechnology involves production of materials, devices or a system in the range of 1 to 100 nm. Nanosheets, nanoparticles, nanotubes, nanofibers are examples of nanostructures. Among these, nanofibers has attracted the most attention due to their high surface to volume ratio, simple and cost-effective production, easily modifiable surface properties. The most preferred method is electrospinning for production of nanofibers. Electrospinning system consists of a high voltage power supply, pump, syringe and a collector plate. The polymer is dissolved in a suitable solvent and located on the pump in a syringe. The power supply gives a charge to the system which creates an electrical field between the capillary of the syringe and the collector plate. With the pump the solution is fed with a definite rate to the electrical field and collected on the collector plate. In this study nanofibers were fabricated using electrospinning, which is a simple and cost effective technique. The polymer was preferred as chitosan which is a non-toxic, biocompatible, biofunctional material. Since the type of solvent changes the solubility of polymer hence structure of the nanofiber, acetic acid, trifluoroacetic acid (TFA) and dicloromethane (DCM) were studied. The best solubility was observed for the solution of TFA and DCM. A solution of TFA and DCM was prepared in the ratio of 70:30. Chitosan was dissolved in TFA-DCM solution at 3% concentration. Chitosan nanofibers were fabricated at 25 kV with feed rate of 0.4 ml/h. Distance of the plate from needle was changed between 10 and 15 cm. β-galactosidase was preferred for immobilization, since it is one of the mostly used enzymes in food industry. It is used for degradation of lactose into glucose and galactose. Unlike chitosan, chitosan nanofibers are water soluble. Because of that, chitosan nanofibers reqiure to be functionalized to become insoluble and active by a coupling agent. Glutaraldehyde (GA) was used as functionalizing agent at concentration of 4%. Chitosan nanofibers were treated in GA and with GA vapor. After functionalization, chitosan nanofibers were incubated in enzyme solutions with different enzyme concentrations. The enzyme immobilization efficiency, reusability and thermal stability were measured by simply measuring the activity of enzyme solutions by use of a spectrophotometer. Assays were conducted by comparing the activities of free and immobilized β-galactosidase. The activity was determined by use of a substrate o-Nitrophenyl ß- D – Galactopyranoside (ONPG) which gives a colorful product after hydrolzed by β-galactosidase. A successful enzyme loading efficiency was obtained up to 69±20%. The immobilized and the free β-galactosidase showed highest activity at 50 °C. The activities at 50 °C were considered as 100% activity to observe the percental change in activity clearly. The activities of the immobilized and free enzyme decreased when the temperature was increased up to 90°C. At 70°C the activity of the free enzyme decreased sharply to 31±0.01% as the activity of the immobilized enzyme was lowered to 73.5±0.1%. After 10 cycles of use of immobilized β-Galactosidase at 40°C, 68±26% of the enzyme activity was retained. These results was found to be promising when compared with the data from literature. The reusability of chitosan nanofibers can be improved by production of magnetic chitosan nanofibers in further studies. It should be taken into consideration that nanomaterials have different chemical and physical characteristics compared to their macro and micro size. The results of intake of nanofibers into the body is not known for certain. For use of nanofibers in food applications, toxicological studies and regulations are required.