Development of microfluidic systems for differential sorting of microparticles and investigation of their performances

Abstract

Inertial microfluidics, an emerging tool in scientific studies, offers rapid, continuous, and high-throughput cell/particle separation. They can be mainly utilized in various applications such as blood separation, the isolation of cancer cells (Circulating Tumor Cells), disease diagnostics and monitoring, and biological processes. For the isolation of targeted particles or cells at the micro scale, a variety of methods has been proposed. Among these methods, label-free, size-dependent cell-sorting applications based on inertial focusing phenomena have attracted much interest during the last decade. In this thesis, five-loop spiral microchannels with a height of 90 µm and a width of 500 µm are introduced. Unlike their original spiral counterparts, four of the proposed channels have elliptic configurations of differing elliptic aspect ratios of 3:2, 11:9, 9:11, and 2:3. Accordingly, the curvature of these configurations increases in a curvilinear manner through the channel. Additionally, the other of proposed microchannel differs due to the implementation of a filtration platform consisting of cylindrical microposts. Both microchannels were designed in order to improve the separation capability. The proposed microchannels were fabricated by using the standard soft lithography method. As channel material, PDMS (polydimethylsiloxane) was utilized. The steps of the microfabrication process were adjusted in order to meet the predetermined geometical features. The fabrication of the cylindrical microposts was challenging due to several reasons such as low quality of printed photomasks, loss of some microposts during PDMS cast (channel material) removal and clogging problem by dust and debris in the experiments. Therefore, the study was carried out with the elliptic configurations. The effects of the alternating curvature and the channel Reynolds number on focusing of fluorescently dyed particles with diameter of 10 and 20 µm in the prepared suspensions were investigated by using the fabricated microchannels. After focusing particles at distinctive positions across the microchannel, the optimum volumetric flow rates between 0.5 mL/min and 3.5 mL/min allowing separation were determined for each channel. These flow rates were specified by utilizing the captured microscopic image sequences of the particle migration trajectories at the outlet. At these rates, each channel was tested in order to collect samples at the designated outlets. Then, these samples were analyzed by counting particles visually under a fluorescence microsope to determine the separation purity. As a result, these elliptic microchannels were capable of separating 20 and 10 µm particles with total yields up to approximately 95% and 90%, respectively. The results exhibited that the level of enrichment and the focusing behavior of the proposed configurations are promising compared to the existing microfluidic channel configurations. Considering their advantages as high operating flow rates, non-complex configuration, and less expensive process requirements, these microfluidic devices offer cost-effective and high-throughput prototypes for efficient separation of microparticles/cells such as CTCs, blood cells, bacteria, viruses, etc. and could be further customized for various sorting applications.

Son yıllarda bilimsel çalışmalar kapsamında geliştirilen, atalet kuvvetlerine dayalı mikro akış sistemleri hızlı, sürekli ve yüksek verimli hücre/partikül ayrıştırma imkanı sunmaktadır. Bu sistemlerden kan hücrelerinin ayrıştırılması, kanda dolaşan kanserli hücrelerin izole edilmesi, hastalık teşhisinin konulup seyrinin takip edilmesi ve biyolojik prosesler gibi farklı uygulamalarda yararlanılmaktadır. Bu zamana kadar mikro ölçekte hedef partiküllerin ya da hücrelerin izole edilerek ayrıştırılması için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler harici bir kuvvet uygulanması durumuna göre aktif ve pasif olarak sınıflandırılmaktadır. Harici kuvvet uygulanan aktif sistemler daha hassas ayrıştırma sağlasalar da yüksek proses maliyetleri, düşük çalışma hızları ve karmaşık konfigürasyonları sebebiyle pasif sistemlerin yanında dezavantajlı konuma düşmektedir. Pasif yöntemler arasında sadece atalet kuvvetlerine dayalı fokuslamayı temel alan, boyut bazlı, partiküllere ya da hücrelere biyokimyasal imleme (etiketleme) yapılmadan ayrıştırma yapılan uygulamalar son yıllarda oldukça önem kazanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında yüksekliği 90 µm ve genişliği 500 µm olan dikdörtgen kesitli, 2 giriş ve 8 çıkışlı, 5 tur spiral döngülü mikrokanallar geliştirilmiştir. Pasif sistemlerde genel olarak süspansiyon içinde yer alan partiküllere sıvının kanal içinde dolaşımı sırasında hidrodinamik kuvvetler etki etmektedir. Bu kuvvetlerin etkisinde partiküllerin boyutlarına göre fokuslanması ve ayrıştırılması pasif sistemlerin temelini oluşturmaktadır. Doğrusal kanallarda partiküllere ataletlerinden kaynaklanan kaldırma ve sürükleme kuvvetleri etki etmektedir. Bu kanallarda sürükleme kuvveti akış doğrultusunda etkili olduğu için partiküllerin fokuslanmasında akışa dik doğrultuda etkiyen kaldırma kuvvetleri rol oynamaktadır. Cisme uygulanan kaldırma kuvveti temel olarak birbirine ters yönde etkiyen kayma gerilmesi (hız gradyanı) ve duvar etkisi kaynaklıdır. Kayma gerilmesi kaynaklı kaldırma kuvveti, akışkanın parabolik hız profili sebebiyle partikül etrafında meydana gelen bağıl hız farkının dengelenmesi için kanal merkezinden duvarlara doğru etkimektedir. Duvar etkisi kaynaklı kaldırma kuvveti ise partikül ve duvar arasında sıkışan akışkanın yarattığı basınç ile duvardan merkeze doğru etki yaratmaktadır. Dikdörtgen kesitli kanallarda bu iki kaldırma kuvvetinin etkisinde partiküller kanal içinde 4 farklı pozisyonda hizaya gelmektedir. Spiral kanallarda ise eğriliğin yarattığı atalet akışa dik düzlemde ikincil bir akış meydana getirmektedir. Bu ikincil akış etkisinde Dean sürükleme kuvveti olarak adlandırılan ikincil bir sürükleme kuvveti oluşmaktadır. Dikdörtgen kesitli eğrisel kanallarda hem Dean sürükleme kuvveti hem de net kaldırma kuvveti etkisi altındaki partiküller kanal içinde tek bir pozisyonda fokuslanmaktadırlar. Bu pozisyon partikülün boyutuna göre değişiklik göstermesi prensibinden yararlanarak farklı boyutlu partiküllerin ayrıştırılması gerçekleştirilmektedir. Orijinal spiral kanallardan farklı olarak bu çalışma kapsamındatoplam 7 farklı kanal geliştirilmiştir. Bu geliştirilen kanallardan dördü eliptik konfigürasyona sahiptir. Bu konfigürasyonlardaki elips formuna ait en-boy oranı 3:2, 11:9, 9:11 ve 2:3 olacak şekilde her bir kanal için değişmektedir. Eliptik konfigürasyonun sonucu olarak eğrilik yarıçapı kanal boyunca dalgalı bir şekilde artış göstermektedir. Benzer şekilde eğrilik yarıçapı ile birlikte ikincil sürükleme kuvveti de dalgalı olarak değişim göstermekte ve bu durumun partiküllerin yanal hareketlerini etkileyerek hizaya gelmelerini hızlandırması öngörülmektedir. Bu 4 kanala ek olarak, geliştirilen diğer 3 spiral kanalda ise silindirik mikro sütunların yer aldığı bir filtreleme platformu dahil edilmiştir. Mikro sütun çapları 30, 60 ve 90 µm olarak tasarlanmıştır. Mikro sütunlar 1:10 açıyla dizilerek tıkanma meydana gelmeden partiküllerin boyut bazlı filtrelenmesi ve böylelikle spiral kanallarda gerçekleşen atalet kuvvetlerine dayalı ayrıştırmanın desteklenmesi hedeflenmiştir. Genel olarak mikrokanalların hepsi ayrıştırma kapasitesini iyileştime amacıyla tasarlanmış ve performansları incelenmiştir. Tez kapsamında 4 eliptik kanal 4 ayrı durum olarak ele alınırken filtreleme platformu içeren 3 kanal tek bir durum olarak ele alınmıştır. Standard litografi yöntemi kullanılarak mikrokanalların üretimi yapılmıştır. Tasarlanan kanalların geometrileri yüksek çözünürlüklü yazıcıda asetat üzerine bastırılarak foto maskeler üretilmiştir. Foto maske yardımı ile kanal konfigürasyonu silikon plaka üzerine kaplanan SU-8 kalıba aktarılmıştır. Litografi yöntemine ait işlem basamakları istenilen geometrileri elde edecek şekilde düzenlenmiştir. Kanal üretiminde malzeme olarak PDMS (polidimetilsiloksan) kullanılmıştır. Kalıptan çıkarılan PDMS uygun boyuttaki mikroskop lam ile bağlanarak kapalı mikrokanal formu oluşturulmuştur. Silindirik mikro sütunların üretimi ise birtakım sebeplerden ötürü zorluk yaratmıştır. Bu sebepler foto maskelerin baskı kalitesinin yetersiz kalması, dökümü yapılan PDMS kalıptan çıkarılırken bazı sütunların kopması ve toz ve parçacıklar sebebiyle deney esnasında tıkanma gerçekleşmesi olarak sıralanabilir. Yukarıda açıklanan sebeplerden dolayı çalışmanın kalanına eliptik mikrokanallarla devam edilmiştir. Üretilen mikrokanallarda değişen kanal eğrilik yarıçapının ve Reynolds sayısının 10 ve 20 µm çaplı, floresan boyalı partiküllerin fokuslanması üzerine etkileri incelenmiştir. Deiyonize su ile karışımı hazırlanan partiküller kanal içinde ayırt edici pozisyonlarda fokuslanarak 0.5 mL/dk ve 3.5 mL/dk aralığında verimli ayrıştırmanın gerçekleşebileceği en uygun hacimsel debi belirlenmiştir. Bu işlem her bir eliptik kanal için tekrarlanmıştır. Bu debileri belirlerken kanalların çıkışında partiküllerin izlediği yollara ait alınan mikroskobik görüntü kayıtlarından yararlanılmıştır. Bu kayıtlardan yararlanarak 0.5mL/dk aralıklarla her debide 10 ve 20 µm çaplı partiküller için fokuslanma aralıkları belirlenmiş ve üst üste çakışmanın olmadığı ve ayrıştırma yapımına en uygun debiler tayin edilmiştir. Yaklaşık olarak 3mL/dk civarında 4 eliptik kanalda da ayrışmanın gerçekleşebildiği gözlenmiştir. Belirlenen bu debilerde her bir kanal için partikül sayım testi gerçekleştirilmiştir. Tayin edilen çıkış kanallarından süspansiyon içindeki partiküller toplanmıştır. Daha sonra toplanan örneklerden küçük numuneler lamel üzerine aktarılarak partikül sayımı floresan mikroskop altında gözle yapılmıştır. Daha doğru sonuç almak adına bu işlem defalarca tekrarlanmıştır. Sayımlar 8 çıkış için de gerçekleştirilmiştir. Tüm çıkışlardan elde edilen partikül miktarı toplam miktara oranlanarak 10 ve 20 µm çaplı partiküller için ayrıştırma verimleri hesaplanmıştır. Sonuç olarak bu çalışmada sunulan eliptik mikrokanallar 20 ve 10 µm çaplı partiküller için sırasıyla %95 ve %90'a varan ayrıştırma verimi göstermiştir. Halihazırda var olan mikrokanallarla kıyaslandığında bu kanalların partikül fokuslama ve ayrıştırma açısından daha iyi sonuçlar verdiği görülmüştür. Böylece herhangi bir dış güce ihtiyaç olmaksızın sadece eliptik formun partiküllerin yanal hareketine olumlu etkisiyle ayrıştırma veriminin iyileştiği gösterilmiştir. Floresan boyalı mikropartiküllerle elde edilen bu sonuçlara dayanarak, geliştirilen eliptik mikrokanallardan kanda dolaşan kanserli hücrelerin ayrıştırıldığı uygulamalarda da faydalanılması uygundur. 20 µm çaplı partiküller için %95.3 verimle en iyi ayrıştırma en-boy oranı 9:11 olan kanalda meydana gelmiştir. Diğer yandan 3:2 en-boy oranına sahip kanalda 90.0% verimle 10 µm çaplı partiküller daha iyi ayrıştma gerçekleşmiştir. Sadece 10 µm çaplı partikülleri ayırmak ya da 10 ve 20 µm çaplı partikülleri birbirinden ayrıştırmak için en iyi alternatifin her partikül için %90 üzerinde verim sağlayan ve en-boy oranı 3:2 olan eliptik kanal olduğu sonucuna varılmıştır. Sadece 20 µm çaplı partiküllerin izole edilmek istendiği uygulamalarda ise 9:11 en-boy oranına sahip eliptik kanalı değerlendirmek daha doğru olacaktır. Deneysel çalışmada geniş hacimsel debi aralığında test yapma imkanı sağlaması için kanallar ihtiyaç duyulandan daha uzun tasarlanmıştır. Bu uygulama kapsamında optimum debilerin yüksek değerlerde olduğu tespit edilmiştir. Yüksek debilerde partiküllerin fokuslanması için gerekli olan kanal uzunluğu daha kısadır. Eliptik kanalların spiral döngü sayıları azaltılarak kapladıkları alanlar küçültülebilir. Böylelikle üretim maliyeti de büyük ölçüde düşürülebilir. Yüksek debilerde çalışmanın bir diğer faydası ise kısa sürede daha fazla miktarda partikül ayrıştırma imkanı sağlamasıdır. Ayrıştırmanın gerçekleştiği en uygun debilerde, 10 ve 20 µm çaplı partiküllerin fokuslandığı pozisyonlar arasındaki boşluğun kısmen geniş olduğu tespit edilmiştir. Kanal genişliği daraltılarak hem bu boşluk kapatılabilir hem de kanalın kapladığı alan küçültülebilir. Fakat bu durumda kanal yüksekliğinin kanal genişliğine oranı artacağı için Dean sürükleme etkileri artacağından ayrıştırma kapasitesi açısından istenmeyen sonuçlar meydana gelebilir. Yine de fokus bantları arasındaki bu boşluk ileriki çalışmalarda boyutları birbirine daha yakın partiküllerin ayrıştırılması için fırsat doğurmaktadır. Deneylerde taşıyıcı akışkan olarak deiyonize su kullanılmıştır. Gelecekte ayrıştırma etkinliğini arttırmak için Newton tipi akışkan su yerine Newton tipi olmayan akışkanlar denenerek elastik kaldırma kuvveti sisteme dahil edilebilir ve ayrıştırma performasnında etkisi incelenebilir. Kanallar sadece tek sefer işleme tabi tutularak yüksek verimler sağlamıştır. Ardışık/paralel uygulamalar ile verim değerleri daha da yükseltilebilir. Bu çalışma kanal çıkışındaki fokuslanma mekanizması ve ayrıştırma performansına ışık tutsa da kanal boyunca partiküllerin hareketleri incelenerek çalışmanın kapsamı genişletilebilir. Yüksek operasyon hızı, basit konfigürasyon ve düşük proses maliyeti ihtiyacı gibi avantajları göz önünde bulundurulursa, bu çalışmada geliştirilen mikro akış sistemleri çeşitli ayrıştırma uygulamaları için uygun bir ön çalışma oluşturmaktadır. Bu kanallar yardımıyla kanda dolaşan kanserli hücreler, kan hücreleri, bakteriler, virüsler, vb. için düşük bütçe ve yüksek işlem hacmiyle verimli bir ayrıştırma sağlayacak sistemler kolayca geliştirilebilir.