Oksijen İndirgenme Reaksiyonlarında Kullanılmak Üzere Karbon Nanotüp Üzerine Sabitlenmiş Enzimlerini İçeren Biyo Yakıt Pilleri İçin Katot Geliştirmesidir

Abstract

Dünya ekonomisinin sürekli gelişmesi ile birlikte ortaya çıkan en büyük sorun enerji kaynaklarının yetersiz olmasıdır. Son yüzyılda pek çok farklı enerji kaynakları bulunmuştur. Bu enerji kaynaklarından bir tanesi de yakıt pilleridir. Diğer enerji kaynakları ile kıyaslandığında yakıt pilleri çok daha verimli ve ekonomiktir aynı zaman da yakıt pillerinin doğaya zarar vermemesi en önemli avantajıdır. Günümüzde birçok farklı yakıt pili vardır. Bu yakıt pillerinin bazıları yüksek sıcaklıkta, bazılar ise oda koşullarında çalışmak için tasarlanmıştır. Çok farklı boyutlarda yakıt pilleri mevcuttur. Bazıları küçük bir elektrik santrali boyutundadır, bazılar ise mikroskobik ölçekte olup vücudun içerisine yerleştirilebilmektedir. Dolaysıyla, her çeşit yakıt pillerinin yapımında kullanılan malzemeler de farklıdır. Yüksek sıcaklıkta çalışan yakıt pillerinde seramik esaslı malzemeler kullanılır. Oda sıcaklığında çalışan pillerde aktivasyon enerji bariyerini aşmak ve verimliliği artırmak için metal katalizörler kullanılır. Bu yakıt pillerinin en büyük dezavantajı kullanılan metal katalizörlerin pahalı olması, katalizleme işlemi sırasında ortamda bulunan karbon monoksit türevi gazların metal katalizöre inhibitör gibi davranması ve metal katalizörün reaksiyon için spesifik olmamasıdır. Bu sorunları çözmek için çeşitli metal alışımla katalizörler kullanılabilir. Biyoyakıt pilleri canlı mikroorganizmaları ve bu mikroorganizmalardaki molekülleri kullanmaktadır. Mesela, mikrobiyal yakıt pilleri katotta veya anottaki mikroorganizmalarda gerçekleşen reaksiyonların sonucunda çıkan ürünleri kullanır. Anotta ya da katotta katalizör olarak enzim kullanılırsa, bu yakıt pili enzim yakıt pili olarak adlandırılır. Bazı durumlarda ise hem anotta hem de katotta enzim kullanılmaktadır. Enzimlerin en büyük avantajı, substrata özel olmasıdır. Bu yüzden seçici bir membrana gerek kalmaz. Ancak, enzim yakıt pilleri çok düşük akım üretir, dolaysıyla verimi düşüktür. Bunun yanı sıra enzimin konumu ve pozisyonu da önemlidir. Enzim yakıt pillerinin en büyük dezavantajı kısa ömürlü olmasıdır. Bu da enzim yapısındaki metallerin aktivitesini yitirmesinden kaynaklanmaktadır. Bütün yakıt pillerinde en önemli etkenlerden birisi aktif yüzey alanıdır. Yüzey alanı artırmak için karbon nanopartiküller, nanofiberler ya da nanotüpler gibi malzemeler kullanılmaktadır. Bu çalışmada, aktif yüzeyi artırmak amacıyla tek duvarlı karbon nanotüp kullanıldı. Karbon nanotüp elektrotta geniş aktif yüzey alanı oluşturup, elektronlar için serbest geçiş alanı oluşturdu. Bu da, uygun pozisyonda veya konumda bulunmayan enzimlerin aktif olma olasılığını yükseltti. Bu deneyde, katalizör olarak iki çeşit enzim kullanıldı: lakkaz ve bilirubin oksidaz. Bu enzimler mavi multi-bakır enzim ailesine aittir. Yani, bunların aktivite gösteren bölgelerinde bakır atomları bulunmaktadır. Her iki enzimin yapısı birbirine büyük oranda benzerdir, aktivite bölgeleri ise aynıdır. Bu da bize karşılaştırmalı çalışma imkanı sağlar. Bu enzimler camsı karbon yüzeyine adsorbe olmuş karbon nanotüp üzerine immobilize edildi. Bu konumda enzimlerin aktivitelerine bakıldı. Kullanılan enzimlerde iki aktif bölgesi vardır. Birinci bölgede substratlar kabul olur, diğer bölgede ise elektronlar. Her iki adımda da bakır atomları büyük rol oynar. Deney esnasında enzimlerin aktivitelerini yitirmemeleri için tüm hazırlık aşamaları önceden yapılır. Enzimlerin deney dışındaki aktivitelerini inhibe etmek için ve stabil bir saklama ortamı oluşmak için fosfat tampon çözeltisi hazırlandı ve enzimler bu çözeltide saklandı. Karbon nanotüplerin elektrot yüzeyindeki homojen dağılımını elde etmek için karbon nanotüpler ilk önce dimetilformamit çözeltisinde çözüldü. Daha sonra üç saat boyunca ultrasonik banyosunda bekletildi. Karbon nanotüp solüsyonu elektrot yüzeyine damlatılır ve on beş dakika boyunca azot gazın altında bekletilir. Adsorbe olmayan karbon nanotüpler asetat tampon çözeltisiyle yıkandı. Böylece enzim için yüzey alanı yüksek olan bir zemin hazırlandı. İlk adım olarak, spektrofotometrik ölçümler alınır. Bu ölçümlerde indikatör olarak ABTS molekülü kullanıldı. ABTS molekülü mavi-bakır enzimlerin ailesinin aktivitelerini gözlemek için kullanılan bir yapıdır. ABTS oksitlendiğinde ABTS radikal katyona dönüşür. Bu değişim 420 nm dalga boyunda gözlenebilir. Spektrofotometrik ölçümleri iki adımdan oluştu. İlk adımda enzimler serbest olarak elektrolitin içinde bulundu, ikinci adımda ise karbon nanotüplü elektrot yüzeyinde sabitlenmiş yapısındaydı. Her iki enzim için ayrı ölçüm alındı ve oluşan farklar gözlemlendi. Çıkan sonuçlara göre, lakkaz enzimin serbest konumunda bilirubin oksidaz enziminden ABTS molekülünü daha hızlı oksitlenmektedir. Ancak elektrot yüzeyine sabitlendiğinde lakkaz enzimi ABTS molekülünü bilirubin oksidaz enziminden 2.35 kat daha yavaş oksitledi. Bu sonuç lakkaz enzimin pozisyon ve konumuna daha bağlı olduğunu ispatlanmaktadır. Elektrokimyasal analizinde en çok döngüsel voltametri tekniği kullanılmıştır. Çeşitli tarama hızlarında ve potansiyel aralıklarında yükseltgenme ve indirgenme piklere bakıldı. İlk önce tek duvarlı karbon nanotüp yüzeyine adsorbe olmuş bilirubin oksidaz reaksiyon voltammetrisine bakıldı. Daha sonra aynı işlem lakkaz enzimine uygulandı. Çıkan döngüsel voltamogramlar birbiriyle karşılaştırıldı. Her iki enzim için iki katodik ve bir anodik pik gözlemlendi. İki katodik pik oksijen indirgenme reaksiyonun iki aşamada oluştuğunu göstermektedir. Eksik anodik pik ise yükseltgenme reaksiyon basamağının diğer basamaklarla kıyaslandığında daha hızlı oluşması anlamına gelmektedir. Lakkaz enzim voltammogramda gözlemlenen düşük akım değerleri lakkaz enzimlerin çok küçük kısmının aktif olduğunu göstermektedir. Bu sonuç lakkaz enzimin konumuna ve pozisyonuna daha bağlı olduğunu bir daha göstermektedir. Bilirubin oksidaz enzimin voltammogramına bakıldığında daha büyük ve net pikler gözlenmektedir. Bu sonuç bilirubin oksidaz enzimin konumuna ve pozisyonuna daha az bağlı olduğunu gösterdi. Sonuç olarak elektrokimyasal ve spektrofotometrik sonuçlar birbirine benzerdir. Enzimler ve hidrofobik karbon nanotüp arasındaki etkileşimini geliştirmek için polivinilpirolidon kullanıldı. Bu molekül karbon nanotüpteki hidrofobik özelliğini ortadan kaldırıp daha hidrofilik yapısına dönüştüreceğine beklendi. Ancak beklenen sonuç alınmadı. Bu da, polivinilpirolidonun film oluşturup elektron ve substrat akışı için gereken tünellerinin tıkanmasından kaynaklanabildiğini inanıldı. Randles-Sevcik denkleme göre, taranma hızı ve pik yükseklikler arasındaki bağlantı araştırıldı ve spektrofotometrik sonuçlar ile karşılaştırıldı. Çıkan sonuçlara göre lakkaz enzimin aktivitesi bilirubin oksidaz enzimin aktivitesine oranı 1:2.27 (spektofotometrik) ve 1:2.35 (elektrokimyasal). Lakkaz enzimine daha fazla oksijen ulaştırmak amacı ile hidrojen peroksit kullanıldı. Hidrojen peroksit hem oksijen hem de elektron kaynağı olarak kullanılabilir. Ancak, hidrojen peroksit kullanıldığında farklı pikler gözlemlendi. Bu da, hidrojen peroksitin elektrot yüzeyinde reaksiyona girdiğini anlamına gelmektedir. Daha yüksek konsantrasyonlarda ise hiç pik gözlemlenmedi. Bu da, hidrojen peroksitin elektrot yüzeyine adsorbe olan karbon nanotüp ve enzimlerin ayrışmasına sebep olduğunu göstermektedir. Enzim kinetiğine bakıldığına, bazı varsayımları yaparak ve spektrofotometrik ile elektrokimyasal sonuçları değerlendirerek difüzyon ile enzimlerin aktivite katsayıları arasındaki benzerlikler araştırıldı. Daha sonra çeşitli formulasyon sonucunda deneysel ile teorik sonuçlar karşılaştırıldı. Son olarak, enzimlerin aktivitelerindeki düşüşü araştırıldı. Alınan sonuçlara göre, fosfat tampon çözeltisinde saklanan enzimlerin aktivitesi beş gün içerisinde %70-80 düşüş gözlemlendi. Anahtar Kelimeler: Biyoyakıt Pilleri, Lakkaz, Bilirubin oksidaz, Tek Duvarlı Karbon Nanotüp  

In the worldwide growing demand for the energy resources, fuel cells play an essential role. Many types of fuel cells are being used from huge power plants to microscopic pacemakers. Each of fuel cell has its own characteristic and advantage. Although biological fuel cells express less current values when compared to fuel cells that utilize conventional catalyst, they are more specific and not subjected to poisoning by carbon monoxide. Biological fuel cell research mostly divided into two parts, anode research and cathode research. While anode based research are focused on utilizing the most proper substrate and building best anode layout, cathode researches focused on oxygen reduction using enzymes, microorganism and that will occur at high potentials and will have high current values. In this study two enzymes, Laccase and Bilirubin Oxidase, were immobilized on the electrode. These two members of blue multi copper family have two active centers that participate in oxygen reduction reactions. Thus reduction current occurs in two places. However, position, in which enzyme is immobilized plays an essential role as it enables passage of oxygen and electrons to enzyme active center. In order to increase surface are of the electrode and create proper tunneling environment for enzymes, single wall carbon nanotubes (SW-CNT) were utilized. Carbon nanotubes are known for their conductive characteristics. However, due to their hydrophobic nature, there is an issue arises when enzymes are immobilized on it. To prevent this, PVP was used to modify hydrophobic nature of SW-CNT. The activity of enzymes was measured both spectrophotometrically and electrochemically. Firstly, kinetics of enzymes that are free in solutions measured, afterwards immobilized enzymes kinetics was measured. Spectrophotometric and electrochemical results were compared to each other. Results were found to be approximately the same. Efficiency drop, hydrogen peroxide effect and PVP coating were analyzed in the study. It was found that enzymes kinetics dramatically decrease with the time. Hydrogen peroxide did not have positive impact on electrode surface, while PVP prevented process of ORR, what was reflected on CV. To calculate diffusion role in fuel cell, RDE technique was used. Somehow, from the CV obtained, it was concluded that rotation of disk somehow disturbs the surface of electrode and results does not fit RDE rules. Key Words: Biofuel cell, Single walled Carbon nanotube, Laccase, Bilirubin oxidaze