Oksitetrasiklinin Termofilik Anaerobik Dışkı Çürütücülerinin Performansı Ve Aktif Mikrobiyal Popülasyon Üzerine Etkileri

Abstract

Son yıllarda hızla gelişen endüstri ve nüfus artışıyla birlikte bütün dünyada enerji ihtiyacı da hızla artmaktadır. Enerji kaynağı olarak fosil yakıtların fazlaca tüketilmesi sera gazı etkisi yaratması nedeniyle iklim değişikliğine sebep olmaktadır. Bu kaynakların çevre üzerinde yarattığı olumsuz etkileri minimum seviyeye indirgemek için alternatif ve çevre dostu enerji kaynakları kullanılması öngörülmektedir. Bu anlamda, anaerobik çürütme yoluyla biyogaz üretimi yenilenebilir enerji üretimi açısından diğer enerji formlarına göre önemli avantajlar sunmaktadır. Bu süreç, atmosferdeki sera gazı (SG) emisyonlarını azaltabilmekte ve bu prosesin son ürünü olan digestate bitkiler için gübre olarak yeniden kullanılabilmektedir. Bu nedenlerle, anaerobik çürütme prosesi biyoenerji üretimi için en tasarruflu ve çevreye faydalı teknolojilerden biri olarak kabul edilmektedir. Organik atıkların herhangi bir türü anaerobik çürütme işlemi için substrat olarak kullanılabilmektedir. Elde edilmesi son derece kolay olan hayvansal atıklar (hayvan dışkısı) en yaygın olarak kullanılan substratların başında yer almaktadır. Diğer taraftan, bu atıkların kullanılması anaerobik çürütücü sistemlerinde bazı sorunlar yaratabilmektedir. Veteriner hekimliğinde kullanılan antibiyotikler, zayıf metabolize olma özellikleriyle, vücuttan gübre olarak atılarak hayvan dışkısında sıklıkla tespit edilmişlerdir. Bu antibiyotikler havasız çürütme sistemlerindeki hassas mikroflaraya zararlı olduklarından, hayvan gübresinin biyogaz üretiminde substrat olarak kullanılması sırasında problem teşkil edebilirler. Ayrıca, antibiyotik içeren hayvan atıkları toprakla şartlandırıldığında çevre üzerinde bu antibiyotik kalıntılarının potansiyel etkisi dikkate alınması gereken önemli bir diğer husus haline gelmektedir. Antibiyotiklerin sık kullanımı mikroorganizmaların antibiyotiklere karşı direnç geliştirmeleri ile ilgili sorunları önemli ölçüde arttırmaktadır. Bunlara ek olarak, OTC hayvanların sindirim sistemlerinde indirgenerek metabolitlerine ayrışmaktadır. Oluşan bu metabolitler mikrobiyal popülasyon üzerine etki eden inhibitörlerdir. Orijinal molekül tarafından üretilen inhibisyondan ziyade bu antibiyotik metabolitleri bakteriyel faaliyetler üzerine inhibisyon etkisi yaratmaktadır. Bu maddelerin biyogaz üretimi üzerindeki etkileri mühendislik açısından incelenmiş olmasına rağmen, mikrobiyal popülasyon üzerindeki olası etkileri ile ilgili çalışmalar oldukça azdır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı yaygın olarak kullanılan bir veteriner antibiyotiği olan OTC’nin, aktif mikrobiyal popülasyon üzerine ve termofilik gübre çürütücülerdeki biyogaz üretimi üzerine olan etkilerinin değerlendirmesidir. Bu çalışmada, sık kullanılan bir veteriner antibiyotiği olan oksitetrasiklinin (OTC), intromasküler enjeksiyon yoluyla aşılanmış olan büyükbaş hayvanın gübresinin termofilik havasız çürütücülerinde biyogaz ve metan üretimleri ile mikrobiyal populasyon üzerine olan etkisi farklı katı oranları ve karıştırma hızları denenerek gözlemlenmiştir. Çalışma doğrultusunda, Set1 ve Set2 olmak üzere iki deney seti kurulmuştur ve bu setlerin her biri 2 tane kontrol ve 2 tane de OTC içeren olmak üzere 4 (D1, D3, D4 and D5) reaktör içermektedir. D1 ve D4 kontrol (OTC içermeyen), D3 ve D5 ise OTC içeren reaktörlerdir. Set1, termofilik koşullarda (55±10C), 90 rpm karıştırma hızında ve farklı katı oranlarıyla (5-5.5 %TS and 7.5-8 %TS) kurulmuştur. Set2, sadece Set1’den farklı olarak 120 rpm karıştırma hızıyla kurulmuştur diğer koşullar Set1 ile aynı olacak şekilde kurulmuştur. Bu çalışmada, mikroorganizmaların yüksek sıcaklığa adapte olabilmelerini sağlamak adına sıcaklık 1. gün 37 °C, 2. gün 40 °C, 3. gün 45 °C, 4. gün 50 °C ve 5. gün 55 °C olacak şekilde kademeli olarak ayarlanmıştır. Termofilik çürütücülerin mezofilik çürütücülere kıyasla, yüksek metabolizma hızı, prosesin daha hızlı olması ve daha yüksek verimde biyogaz üretimi, düşük hidrolik bekleme sürelerinin olması, daha yüksek organik yükleme oranları ile beslenme yeteneği ve patojenlerin daha yüksek verimle ölmelerinin sağlanması gibi birçok avantajı bulunmaktadır. Ayrıca, bu çalışmaya göre, termofilik koşullarda mezofiliğe oranla daha yüksek metan oranı bulunmuştur ve OTC’nin yarı ömrü de daha düşük olarak saptanmıştır. Bu çalışma kapsamında, 3.5 yaşındaki dişi Holstein ırkı, 440 kg vücut ağırlığındaki süt ineğinin vücudunun her iki tarafına, musculus semitendinosus ve musculus semimembranosus kaslarına, eşit miktarda ve standart uygulama dozunda 50 ml solusyon (20 mg/kg) oksitetrasiklin (OTC) enjekte edilmiştir. 5 gün boyunca her 24 saatte bir hayvandan dışkı örnekleri toplanmış ve homojen bir numune elde etmek için bu 5 numune karıştırılmıştır ve bu karışım deney boyunca anaerobik çürütücüler için substrat olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada, çürütücülere laboratuvar ölçekli dışkı çürütücülerinden alınan aşı çamuru 1:10 oranında eklenmiştir. Her iki set için de hidrolik bekletme süresi (HRT) 20 gün olarak belirlenmiştir ve her 5 günde bir analitik, moleküler ve fizikokimyasal analizler için numune alınmıştır. Çürütücülerdeki biyogaz üretimi, TS giderimi, biyogaz ve VFA konsantrasyonları izlenmiştir. Fluorescent in situ Hybridization (FISH) and RNA tabanlı Q-PCR yöntemleri kullanılarak mikrobiyal populasyonun çeşitliliğine bakılmıştır. Bu çalışmada, Set 1 ve Set 2’de maksimum biyogaz verimi 132-134 L/kgTVS olarak bulunmuştur. Sonuçlar, 90 ve 120 rpm karıştırma hızlarınnın biyogaz verimi üzerine önemli bir etki yaratmadığını göstermiştir. 20 günün sonunda, 1,5-4,7 mg/L değerler aralığındaki OTC konsantrasyonunun toplam biyogaz üretimi üzerine inhibisyonu %10-18 oranında olmuştur. 20 günlük işletme sonunda maksimum TS giderimi %30 oranında bulunmuştur. Asetik ve propiyonik asit baskın olarak gözlenmekle beraber inhibisyon etkisi yaratabilecek konsantrasyonlarda VFA birikimi gözlenmemiştir. İşletme süresi boyunca OTC azalma eğilimi göstermiştir ve termofilik anaerobik çürütücülerde yarı ömrü 14 gün olarak hesaplanmıştır. Aktif populasyon dinamiği FISH ve Q-PCR gibi moleküler yöntemler kullanılarak incelenmiştir. FISH sonuçlarına göre, aktif bakteri populasyonu işletmenin sonunda bütün çürütücülerde azalırken aktif Methanomicrobiales populasyonu yükselmiştir. Bütün çürütücülerde en fazla bulunan metanojen (%48 oranında) Methanobacteriales olmuştur.Ayrıca Methanobacteriales spp. kontrol çürütücülerinde değişme göstermemekle birlikte OTC içeren çürütücülerde azalma göstermiştir. Aktif Methanosarcina populasyonu dalgalanmalar göstermiştir ve spesifik bir trend izlenmemektedir. Q-PCR sonuçlarına göre, Set 1 çürütücülerinde bakteriyal, Methanobacteriales, Methanomicrobiales, Methanosaeta ve Methanosarcinales gen kopya sayısı zaman içinde azalmıştır. Methanobacteriales and Methanosarcinales gen kopya sayısı 90 rpm karıştırma hızıyla işletilen Set 1’de azalırken 120 rpm karıştırma hızıyla işletilen Set 2’de artma göstermektedir. Bakteriyel, Methanomicrobiales and Methanosaeta gen kopya sayıları bütün çürütücülerde azalmıştır. Methanosaeta gen kopya sayısı oldukça düşük konsantrasyonlarda tespit edilmiştir ve zaman içinde önemli bir azalma göstermemiştir. Methanosaeta türlerinin aktivite ve gen kopya sayıları setlerin bütün çürütücülerinde düşük konsantrasyonlarda gözlenmiştir ve bu da metan oluşumunun özellikle Methanosarcinales türleri ve hidrojenotrofik metanojenler grubundaki Methanobacteriales ve Methanomicrobiales türleri tarafından gerçekleştirildiğini göstermektedir.

Antibiotics used in veterinary practice are poorly metabolized and excreted withinmanure; hence posing a threat to biogas production from substrates as such, for they are possibly detrimental to microflora of anaerobic digestion processes. In this study, effects of a commonly used veterinary antibiotic, OTC (oxytetracycline), on biogas production in thermophilic anaerobic digestion of cattle manurewas investigated. Effects of changing operational parameters such as mixing rate and solid content on biogas yield,active microbial population and eliminaton of oxytetracycline was also studied. In this study, two sets (Set1 and Set2) each containing four digesters (D1, D3, D4 and D5) were setwith both blank (as control) and medicated cow manure. Set1 was maintained under thermophilic conditions (55 0C±1), with 90 rpm mixing rate and two different total solid content (5-5.5 % and 7.5-8 % TS content). Set2 was similar to Set1 except mixing rate which was 120 rpm. Seed from a lab-scale manure digesters was added at a ratio of 1:10.HRTs were set to 20 days in both Set1 and Set2 and samples were taken for analytical, molecular and physicochemical analysisfor every 5 days. Digesters were monitored for biogas production, total solid (TS) reduction, biogas and volatile fatty acid concentrations.In situ Hybridization (FISH) and RNA based Q-PCR were used to monitor of active microbial populationsdynamics. In this study, maximum biogas yields of132-134 L/kg TVS were found in control digesters, in Set1 and Set2, respectively. Results showed that 90 and 120 rpm mixing rates did not effect biogas production performance significantly. Inhibitions in cumulativebiogas production after 20 days were between 10-18% for the digesters containing OTC concentrations of 1.5-4.7 mg/L. MaximumTS reduction reached to 30% at the end of 20 days digestion period. Although acetic and propionic acids were dominantly detected in slurries; their concentrations were not at inhibitory level at the end of 20 days.OTC concentration showed a decreasing trend during operational time and half life of OTC was evaluated to be 14 days for thermophilic anaerobic digestion. Dynamics of active populations were investigated by molecular methods such as FISH and RNA based Q-PCR. According to FISH results, active bacterial population decreased in all digesters at the end of operation whereas active Methanomicrobiales population increased. Methanobacteriales was most abundant methanogen in all digesters as reaching percentage of 48%. Methanobacterialesspp. also decreased in OTC containing digesters.Active Methanosarcina population oscillated in digesters showing no spesific trend. According to Q-PCR results, bacterial, Methanobacteriales, Methanomicrobiales, Methanosaeta ve Methanosarcinales gene copy numbers decreased with operational time in all digesters in Set1. Methanobacteriales and Methanosarcinales gene copy numbers decreased in Set1 digesters where mixing rate was 90 rpm whereas gene copy numbers increased in Set2 digesters where 120 rpm were maintained. Bacterial, Methanomicrobiales, Methanosaeta gene copy numbers decreased in all digesters during operational time. Methanosaeta gene copy numbers were low and did not show significant decreasing trend within operational time. Both activity and gene copy number of Methanosaeta spp. was low in number indigesters suggesting methanogenesis was performed mainly by Methanosarcinalesspp. and hydrogenotrophic archaea like Methanobacteriales and Methanomicrobiales.