Elektro Çekim Yöntemi İle Elde Edilmiş İletken Polimer Nanofiber Mat Yüzeylerinde Biyomimetik Hücre Zarı Üretimi Ve Karakterizasyonu

Abstract

Biyolojik zar yapıları hücrede canlılığın korunmasında önemli bir role sahiptir. Hücre zarı tüm organizmalar tarafından hücre içeriğini dış etmenlerden ayırmak ve korumak amacıyla kullanılmaktadır. Yüksek yapılı canlılarda ise diğer biyolojik zar yapıları bölümleşme ve organel oluşturulmasında kullanılmaktadır. Biyolojik zarların içeriği fonksiyon ve kullanıldığı bölgeye göre değişse de, ana bileşenler fosfolipitler ve proteinlerdir. Diğer bileşenler ise karbonhidratların protein veya lipit yapılarına eklendiği glikoprotein ve glikolipit yapılarıdır. Hücre zarının yapı ve fonksiyonunu detaylıca anlayabilmek, hücreler arası etkileşimin manipülasyonu, sinyal yolaklarının karakterizasyonu, ilaç taşıma ve hedeflemeleri ile biyosensör platformlarının geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Bu sebeple model membran sistemlerinin kullanılması ve geliştirilmesi büyük önem arz etmektedir. Hücre zarının ortalama %40-50 oranında fosfolipitlerden oluşması çift katmanlı lipit zar modellerini bu tür çalışmalar için uygun bir aday haline getirmektedir. Globular proteinlerin tutuklanması ile yapılandırılan çok sayıda biyosensör üretilip kullanılmasına rağmen, geniş hidrofobik bölgeler içeren membran proteinlerinin kullanıldığı platformlar sayıca azdır. Bunun nedeni membran proteinlerinin globular proteinler gibi sulu ortamda fonksiyonel üç boyutlu yapısını koruyamayarak denatüre olmasıdır. Ancak, ilaçların ve biyolojik savaş ajanlarının büyük bir bölümü membran proteinlerini hedef aldığından bu sistemlerin çalışılması önemlidir. Bu sebeple membran proteinlerinin canlılarda bulunduğu şekli ile çift katmanlı lipit membranlara entegre edildiği sistemler geliştirilmesi gereklidir. Bu çalışmanın amacı iletken nanofiber matı üzerinde çift katmanlı bir lipit zarı oluşturmaktır. İmal edilen yapının model biyosensör platformu olarak kullanılması hedeflenmektedir. Polikaprolakton (PCL) nanofiber matları elektro çekim yöntemi ile üretilmiştir. Elektro çekim yönteminde nanofiberler bir şırınga içindeki polimer çözeltisinin yüksek voltajla hızlandırılarak elektrik alan içinde taşınıp hedef üzerinde toplanmasıyla oluşturulur. Bu taşınma sırasında çözücü buharlaşır ve hedef (toplayıcı) üzerinde yalnızca nanofiberler kalır. Nanofiberlerin morfolojik yapıları çözelti ve üretim sürecine ait çeşitli parametrelerin değiştirilmesi ile değiştirilebilir. Bu çalışmada elde edilen fiberler rastgele konumlandırılmıştır. PCL nanofiberler üzerine in situ polimerizasyon yöntemi ile polipirol (PPy) tabakası kaplanmıştır. Dopant olarak Demir(III)Klorür çözeltisi kullanılmıştır. Çeşitli monomer (pirol (Py)) konsantrasyonları ve polimerizasyon zamanları in situ polimerizasyon yöntemi için denenmiştir. Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR-ATR) ve Raman Spektroskopisi yöntemleri PCL ve PPy ile kaplı PCL nanofiberlerinin kimyasal karakterizasyonu amacı ile kullanılmıştır. 3500-2700 cm-1 civarındaki geniş N-H bandı ve 1100 cm-1 ye denk düşen düzlem içi N-H deformasyon bantları polipirolün yapıya katıldığını göstermektedir. Bu FTIR-ATR sonucu Raman spektroskopisi ile ayrıca desteklenmektedir. Nanofiberlerin morfolojik özellikleri ve pürüzlülükleri Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ile incelenmiştir. Elektro çekim ile elde edilen PCL nanofiberlerinin çapı 251,81 nm olarak ölçülmüştür ve yüzey pürüzlülüğü düşüktür. Düşük monomer konsantrasyonlu in situ polimerizasyon denemelerinde fiber çapı 453,20 nm olarak ölçülmüş olup pirol ile ilişkilendirilen karnabahara benzer yapı gözlemlenmiştir. Yüzey pürüzlülüğü polimerizasyondan sonra artmıştır. Py konsantrasyonunun arttırılması ile birlikle PPy katmanının sadece nanofiberlerin üzerini kaplamadığı, gözeneklere de girdiği gözlemlenmiştir. Monomer miktarı ve polimerizasyon zamanı arttırıldıkça yüzeyin PPy filmi ile kaplanırlığı ve oluşan katmanın kalınlığı yükselmiştir. Nanofiber çaplarının arttığı gözlemlenmiş olsa da üzerlerindeki katman nedeniyle tam boyutunu belirtmek mümkün olmamıştır. Bu aşamadan sonra optimize edilmiş olan PPy kaplı PCL (PCL/PPy) elektrotlarının üzeri fosfatidilkolin (PC) ile kaplanmıştır (PCL/PPy/PC). PC hücre zarının yapısında en çok bulunan fosfolipit olup zwitteriyonik yapıda bir moleküldür. PC lipozomları (kesecik) PBS çözeltisi içinde lipozom yayma tekniği ile PCL/PPy elektrotları üzerine kaplanmış olup yüzey kaplamaları SEM ile gözlemlenmiştir. SEM görüntülerinde yüzey kaplamalarının her örnek için benzer olmadığı görülmüştür. Üretilen elektrotların elektrokimyasal özelliklerine ilişkin veriler Elektrokimyasal Empedans Spektroskopisi (EIS) ile elde edilip Eşdeğer Devre Modellemesi (ECM) ile analiz edilmiştir. Empedans ölçümleri 0.01 Hz ve 100 kHz frekans aralığında gerçekleştirilmiştir. Yük transfer direnci (Rct) elektrot yüzeyinin direnci ile doğrudan bağlantılı olup yüzeyin iletkenlik özelliklerinin karakterizasyonunda önemli bir parametredir. Bu çalışmada Rct değerinin en yüksek olduğu durum PCL elektrotlarına aittir. PPy kaplaması ile Rct değeri düşmüştür. Yapıdaki artan PPy konsantrasyonu ile birlikte Rct değerindeki düşüş artmıştır. PC lipozomları ile yapılan kaplama sonucu Rct değerinin yükseldiği gözlemlenmiş, ancak bu yükseliş PCL seviyesine ulaşmamıştır. Sonuç olarak, PCL elektrotlarının PPy ile kaplanması iletkenliği arttırmış, PPy üzerinin PC lipozomları ile kaplanması görece yalıtkan bir tabaka oluşturmuştur. Tüm bu değişimler empedans grafiklerinde ayırt edilebilir farklara neden olduğundan EIS metodunun süreci takip etme açısından verimli olduğu belirlenmiştir. İmal edilen sistemin membran proteinlerinin entegrasyonu ve/veya hücre zarı ile etkileşen çeşitli bileşiklerin tespitinde kullanılması hedeflenmektedir. Sistemin geliştirilmesi amacı ile lipozomlar PC ve fosfatidilserin(PS) fosfolipitlerinin değişik moleküler oranlarda karıştırılması ile hazırlanılarak ve elektrokimyasal olarak incelenebilir.

Cell membranes are utilized by every organism for separation and protection of their contents from external environment. For higher organisms, biological membranes are used for compartmentalization and organelle formation. Understanding the structure and function of the cell membrane is crucial for manipulation of cellular trafficking, signaling pathways, drug delivery/targeting systems and biosensor applications. Biomimetic cell membranes are developed for these purposes with various strategies. One of these strategies is utilization of lipid bilayer membranes. Since the 45-50 % of the cell membrane is composed of lipid structures, lipid bilayer membranes are well suited candidates for their studies. Despite the development of variety of biosensors by immobilization of globular proteins, biosensors based on membrane proteins containing large hydrophobic parts have not been easily produced. When these proteins are incorporated into biomimetic membranes, both their structural integrity and the functionality would be preserved. The objective of this work was to construct a lipid bilayer on a conductive nanofiber mat. Constructed structure was aimed to be used as a model biosensing platform. Polycaprolactone (PCL) nanofiber mats were produced by electrospinning process. These mats were then coated with polypyrrole (PPy) by in situ polymerization method using various monomer concentrations and polymerization durations. Fourier Transform Infrared Spectroscopy-Attenuated Total Reflectance (FTIR-ATR) and Raman Spectroscopy were used for the analysis of bare PCL and PPy coated PCL structures. Broad N-H bond peak at 3500-2700 cm-1 and N-H in plane deformation peak at 1100 cm-1 were attributed to the PPy structure and it was concluded that polymerization was successfully performed. Scanning Electron Microscopy (SEM) and Atomic Force Microscopy (AFM) techniques were used for the morphological characterization of nanofibers. Smooth Polycaprolactone fibers with 251.81 nm diameter were obtained by electrospinning. When in situ polymerization performed at low concentration of pyrrole monomer, nanofibers with cauliflower-like structures (453.20 nm) were produced. With the increased Py concentration, PPy layer seemed to cover both the PCL nanofiber surfaces and the pores in between. The thickness and coverage of PPy was increased with the increasing Py monomer concentration and the duration of polymerization process. PCL/PPy electrodes were coated with phosphatidyl choline (PC) liposomes (PCL/PPy/PC) by vesicle fusion method in Phosphate Buffered Saline (PBS). PC liposome covered PCL/PPy mats were observed with SEM micrographs. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Equivalent Circuit Modelling (ECM) methods were utilized for the determination of electrochemical properties of electrodes. Impedance measurements were carried out between 0.01 Hz and 100 kHz. The charge transfer resistance (Rct) of PCL was highest. Rct of PPy significantly reduced. With increased concentration of PPy, Rct was further reduced. Coverage with PC resulted in an increase in resistance and provides an insulating layer on surface of the electrodes. Total coverage of the electrode surface rather than coverage of only nanofiber surface with PC resulted in better electrochemical properties. The constructed system was aimed to be used for different applications such as integration of membrane proteins and/or detection of different compounds which interact with cell membranes. This system can be further improved by using binary mixture of PC and phosphatidyl serine (PS) lipid for vesicle production.