Vücut Sıvılarından Biyogösterge Ayrımı İçin Antikor Bağlı Magnetik Nanopartikül Üretimi Ve Karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, kompleks biyolojik matriksler içerisinden astım biyogöstergelerini ayırmada kullanılabilecek antikor bağlanmış magnetik demir oksit (Fe3O4: magnetit) nanopartikülleri sentezlenmiştir. Sentez aşamasında, molce 1’e 2 oranında demir (II) sülfat ve demir (III) klorür çözeltileri ile amonyum hidroksit (NH4OH) reaksiyona sokulmuştur. Nanopartiküllerin stabilizasyonu için oleik asit, yüzey işlevselleştirilmesi için kitosan (chitosan) ve çapraz bağlama reaksiyonu için de glutaraldehid kullanılmıştır. Sentezlenen nanopartiküllerin karakterizasyonu FT-IR, XRD ve TEM kullanılarak gerçekleştirilmiş ve magnetit nanopartiküllerinin kitosan ve glutaraldehid ile birlikte başarılı bir şekilde sentezlendiği saptanmıştır. Sonraki aşamada, üretilen bu nanopartiküllere antikor (anti-Cys-LTs ya da anti-8-iso PGF2α) eklenmiş ve bu şekilde işlevselleştirilen nanopartiküller, Cys-LTs ve 8-iso PGF2α moleküllerini bulundukları ortamdan ayırmada kullanılabilecek hâle getirilmiştir (immünomagnetik nanopartikül). Çalışmadaki ayırma prensibi, magnetik nanopartiküllere bağlanmış olan antikorlar ile matrikste (EBC) bulunan antijenler (biyogösterge) arasında spesifik bir kompleks oluşturma ve bu kompleksin güçlü bir mıknatıs yardımıyla bulunduğu ortamdan ayrılmasına dayanmaktadır. Biyogöstergelerin miktarları yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile birleştirilmiş kütle spektrometre cihazı (HPLC-MS) ile saptanmıştır. Bu çalışmada uygulanan analitik prosedür optimize edilmiş ve optimum koşullar doğrulanmıştır. Daha sonra bu yöntem, astım teşhisi konmuş hastalardan ve kontrol grubunu oluşturan sağlıklı bireylerden alınan gerçek EBC örnekleri üzerinde analitik olarak da test edilmiştir.

In this study, magnetic iron oxide nanoparticles, magnetite (Fe3O4) were synthesized through the co-precipitation method of ferrous (Fe2+) and ferric (Fe3+) aqueous solutions by addition of a base (NH4OH). To prevent the agglomeration among the particles oleic acid was used. Then chitosan was added to coat on the surface of the Fe3O4 nanoparticles as a polymeric shell. The amino groups on the chitosan were cross-linked using glutaraldehyde, and finally the magnetic Fe3O4–chitosan nanoparticles were obtained. The characterization of the particles was performed by the XRD, FTIR and TEM. After synthesizing the magnetic Fe3O4–chitosan nanoparticles, the immunomagnetic nanoparticles were prepared by immobilizing antibodies on the surface of the particles. These immunomagnetic nanoparticles were used to separate cysteinyl leukotrienes (Cys-LTs: LTC4, LTD4, and LTE4) and 8-iso Prostaglandin F2α (8-iso PGF2α), which are essential biomarkers of asthma and oxidative stress present in exhaled breath condensate (EBC), respectively. The principle of separation method was based on forming an antibody-antigen (antibody-biomarker) interaction owing to antibodyʼs ability to form a specific complex with antigens and isolating targeted molecules by applying an external magnetic field. The amount of separated molecules was measured by a highly selective and sensitive detection method: high performance liquid chromatography–mass spectrometry (HPLC-MS). The analytical procedure was optimized, validated and analytically tested on real EBC samples collected from patients diagnosed with two sub-types of bronchial asthma (occupational asthma and hard-to-treat asthma) and on the control group of healthy subjects.