Clostrıdıum Acetobutylıcum Tiyolaz Ve Meıothermus Ruber Tiyolaz Enzimlerinin Tanımlanması Ve Karakterizasyonu

Abstract

Butanol gerek kimya gerek tekstil sektöründe büyük öneme sahiptir. Bunun yanısıra özellikle son zamanlarda biyoyakıt endüstrisinde hidrofobik özellikleri ve enerji yoğunluğu bakımında büyük öneme sahip olmuştur. Biyoteknolojik butanol üretimi, Clostridia türlerinin anaerobik fermentasyon prosesine dayanmaktadır. ABE fermentasyonu olarak bilinen bu proseste şekerler butanol, etanol ve asetona çevrilmektedir. Tiyolaz enzimi de glikozun butanola biyosentetik yöntemle çevrilmesi sırasında kullanılan anahtar enzimdir. Tiyolaz enzimi Claisen kondenzasyonuna dayanarak karbon-karbon bağlarının tiyoesterin katalizlenerek oluşturulmasından sorumludur. Spesifik olarak, tiyolaz asetil-koa molekülünün kondenzasyonundan sorumludur. Bunun sonucunda asetoasetil-koa molekülü meydana gelmektedir. Clostridia tiyolazlar oksijene karşı düşük direnç gösterirler ve ne çözelti ne de sıcaklık stabillikleri söz konusudur. Bu durumda butanol verimini düşürmektedirler. Bu çalışmamızda, hem çözelti hem de sıcaklık stabilliği gösteren bir enzim olan Meiothermus Ruber’dan tiyolaz enzimi izole edildi. Bu enzimin özellikleri daha önce üzerinde araştırmalar yapılmış Clostridium Acetobutylicum tiyolazı ile karşılaştırıldı. İlk olarak ekspresyon sistemi ile hücrelerin proteini yüksek miktarda üretmesi sağlandı ve bir dizi aşamadan sonra enzim saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi için ise adsorbsiyon temeline dayanan afinite kromatografisinin çeşitlerinden biri olan metal şelat afinite kromatografisini (IMAC) kullanıldı. Afinite kromatografisinin temeli kolon içerisinde yer alan sabit faza, ligandın kovalent olarak immobilize olmasına dayanır. Bu sayede saflaştırılmak istenen molekülü içeren karışım kolondan geçirildiğinde istenen molekül ligand tarafındna tutulur, safsızlıklar ise tampon çözelti ile kolondan ayrılır. Kolonda liganda bağlı olan molekül ise elüsyon çözeltisi ile kolondan ayrılır. Metal şelat afinite kromatografisinde ise Zn (II), Cu (II), Ni (II), Co (II) gibi geçiş metallerinin sistein, histidin ve triptofana karşı afinitesi önem taşımaktadır. Çünkü proteinlerin özellikle sistein, histidin ve triptofan gibi kısımları kolonun metal iyon koordinasyon alanlarına bağlanmasına yardımcı olur. Çalışmamızda ise bu temele dayanan, Ni afinite kromatografisi kullanıldı. Bağlayıcı tampon çözelti olarak 20 mM imidazol, %10 gliserin ve %0,1 tween20 içeren 50 mM HEPES kullanıldı. Elüsyon çözeltisi olarak ise 500 mM imidazol, %10 gliserin ve %0,1 tween20 içeren 50 mM HEPES kullanıldı. Fraksiyonlar SDS-PAGE kullanılarak analiz edildi. En yoğun enzim içeren fraksiyonlar toplanıp, osmatik membran içerisine konularak diyaliz işlemi uygulandı. Diyaliz işlemi, saflaştırma sırasında ve önceden meydana gelen küçük moleküllü safsızlıkların uzaklaştırılması için gerçekleştirildi. Saflaştırma işleminin ardından tiyolaz aktivitesine bakıldı. 0,1 mM DTNB, 0,2 mM asetil-KoA, 50 mM HEPES (pH8.0/50°C) kullanılarak master mix hazırlandı ve bu karışım 50°C’de 10 dk boyunca inkübe edildi. Isıtılmış karışımdan 180 µl alınıp microplate’e konuldu ve üzerine 20 µl tiyolaz enzimi ilave edilerek reaksiyon 50°C’de başlatıldı. Bu işlemler ayrı ayrı hem Cab-tiyolaz için hem de Mr-tiyolaz için yapıldı. Reaksiyonda asetil-KoA’nın asetoasetil-KoA’ya dönüşümü sırasında açığa çıkan KoA molekülünün renksiz DTNB’nin disülfit bağlarının ayrılmasını ve sarı renkli TNB2- dianyonunun ortaya çıkmasını sağladığı gözlemlendi. Reaksiyondaki bu değişim spektrofotometrik olarak kolaylıkla gözlemlendi. Elde edilen grafikler ve yapılan hesaplamalar sonucunda Mr-tiyolazın aktivitesi 0,6068 U/mg, Cab-tiyolazın aktivitesi ise 0,9239 U/mg olarak bulundu. Enzim aktivitesi belirlendikten sonra enzim karakterizasyonu için denemeler yapıldı. pH 6.0-11.0 aralığında farklı tampon çözeltiler kullanılarak ölçümler alındı. Hem Cab- hem de Mr-tiyolazın optimum pH’ı 10.0 olarak bulundu. Tiyolaz enzimi üzerinde sıcaklığın etkisini görmek için 20°C’den 65°C’ye kadar farklı sıcaklıklarda ölçümler alındı ve Mr-tiyolaz için optimum sıcaklık 50°C ve Cab-tiyolaz için optimum sıcaklık 60°C olarak bulundu. Termostabilite testi için 40, 50 ve 60°C sıcaklıklarda 150 saate kadar ölçümler alındı ve hesaplamalar sonucunda her iki enzim için de 150 saat sonra bile enzim aktivitesi gözlendi. Enzimin etanol ve butanol stabilitesi, tiyolaz enziminin etanol-butanol üretimlerinde görev almasından kaynaklı büyük önem taşımaktaydı, bu yüzden enzime %5, 10, 15 ve 20 oranlarında olmak üzere ethanol ilave edilerek 50°C’de ısıtılıp reaksiyon plate readerda okunup, ölçümler alındı. Hem Mr- hem de Cab- tiyolaz aktivitesinde azalma gözlemlendi ancak azalma oranının çok düşük olduğu görüldü. Ayrıca enzime %2, 4, 6, 8 ve 10 olmak üzere butanol ilave edilip, önceki koşullarla aynı ortamda reaksiyon gerçekleştirildi. Bu işlemden elde edilen sonuçlarda ise butanol ortamında Mr-tiyolaz aktivitesinde belirgin düşüş gözlenirken, Cab-tiyolazda o kadar büyük bir düşüş gözlenmedi. Solvent stabilitesine bakmak için ise reaksiyon karışımına DMSO (%5, 10, 15) ilave edilerek analizler yapıldı. DMSO miktarı arttıkça Mr-tiyolazın aktivitesinin de arttığı diğer taraftan Cab-tiyolaz aktivitesinin de azaldığı görüldü. Son olarak kinetik ve inhibisyon çalışmaları yapıldı. Değişen asetil-KoA konsantrasyonlarında tiyolaz aktivitesi ölçüldü. Elde edilen kinetik grafiğinin eğiminden ve denkleminden yararlanılarak kinetik sabitlere ulaşıldı. Mr-tiyolaz için kinetik sabit (KM) 4,82 mM, Cab-tiyolaz içinse bu değer 3.07 mM olarak bulundu. Diğer taraftan Vmax değerleri Mr-tiyolaz için 13,089 µmol min-1 mg-1 olarak Cab-tiyolaz için ise 11,806 µmol min-1 mg-1 olarak bulundu. NAD+’ın inhibisyon etkisi görüldükten sonra değişen oranlarda NAD+ kullanılarak da inhibisyon testleri yapıldı. Bu testler sonucunda elde edilen grafiklerden Mr-tiyolazın yarışmalı inhibisyon gösterdiği bulundu. Sonuç olarak; Mr-tiyolazın aktivitesi Cab-tiyolazın aktivitesinden düşük olarak bulundu. Hem Mr- hem de Cab-tiyolaz için optimum pH’ın aynı olduğu gözlendi. Mr-tiyolazın optimum sıcaklığının Cab-tiyolazın optimum sıcaklığından düşük olduğu görüldü. Diğer taraftan Mr-tiyolazın termostabil olduğu kanıtlandı. Etanol ve butanol varlığında, tiyolaz enziminin nasıl davranacağının taşıdığı önem bakımından yapılan deneylerde etanol varlığında Mr-tiyolazın Cab-tiyolaza göre daha stabil olduğu gözlenmesine rağmen butanol için tam tersi görüldü. Diğer bir açıdan, etanol için her iki enzimde de enzim aktivitesinde çok büyük düşüşler gözlenmedi. Ancak butanolde özellikle Mr-tiyolazda %4 butanolden sonra enzim aktivitesinde yarıdan fazla düşüş gözlendi. Her şeye rağmen %4 butanol ilave edildiğinde enzim aktivitesinin hemen hemen sabit olması yararlı bulundu. Bu yüzden 120 saat boyunca belirli aralıklarla %4 butanol içeren karışımla yapılan ölçümlerde Mr-tiyolazın aktivitesinde ani düşüşler gözlenmedi. Bunun sonucunda da butanol üretimi sırasında ortamda %4 oranına kadar bulunan butanolün reaksiyon verimini çok fazla etkilemeyeceği görülmüş oldu. DMSO varlığında Mr-tiyolazın aktivitesinin Cab-tiyolaza göre arttığı görüldü. Cab-tiyolazın KM ve Vmax değerlerinin düşük olmasından dolayı Mr-tiyolazın substratları Cab-tiyolaza göre daha zayıf bağladığı bulundu. Son olarak Mr-tiyolazın Cab-tiyolaz gibi yarışmalı inhibisyon gösterdiği bulunmuş oldu. Özetle, Mr-tiyolazın termostabil, solvent stabil olduğunu ayrıca Meiothermus Ruber’ın aerobic bir bakteri olmasından dolayı da Mr-tiyolazın oksijene dayanıklı olduğunu söyleyebiliriz. Ayrıca Cab-tiyolazın da daha önceki yapılan araştırmalardan farklı özellikler gösterdiği ve aktivitesinin, optimum pH’ının, termostabil özelliğinin daha iyi sonuçlar verdiği görüldü.

Butanol is an important platform molecule for the chemical, textile, polymer and biofuels industry due to its favourable physical properties such as increased hydrophobicity and energy density. At present, biotechnological butanol production is based on anaerobic fermentation processes with Clostridia species, which convert sugars into the solvents butanol, ethanol and acetone (ABE fermentation). Thiolase (EC 2.3.1.9) is a key enzyme in the biosynthetic conversion of glucose to butanol, where it is responsible for the formation of carbon-carbon bonds by catalysing a thioester dependent Claisen-condensation. Specifically, thiolase is responsible for the condensation of two Acetyl-CoA molecules, thereby forming Acetoacetyl CoA, the first dedicated intermediate in cell based butanol synthesis. The well characterised Clostridia thiolases show low resistance to oxygen and are neither solvent nor thermostable, which limits butanol yields. We have isolated and characterised a thermo- and solvent stable Thiolase derived from the bacterium Meiothermus ruber. The Mr thiolase gene encompasses 12 kb encoding a protein of 397 amino acids with a deduced molecular weight of 42.3 kDa. Steady-state kinetic properties, thermo- and solvent stability of Mr thiolase were analysed via the DTNB (5,5 -dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)) assay. During this assay the thiol moiety of the released CoA molecule cleaves the disulfide bond of DTNB to form one equivalent of a yellow colored TNB2- dianion. The kinetic constant of Mr thiolase in the condensation direction is: KM = 4,8 ± 0,3 mM. The enzyme exhibits an pH optimum of 10.0, while the highest activity was measured at 50 °C. Even in the presence of 4 % butanol, Mr thiolase showed no significant decrease in activity. Therefore, the new Mr thiolase enzyme system shows superior catalytic and process parameters to previous characterised thiolase enzymes. Moreover, we have isolated and characterized Thl derived from Clostridium Acetobutylicum to compare Mr-Thl.