Design of biocompatible hydrogels with regions of different chemical and mechanical properties

thumbnail.default.placeholder
Tarih
2018
Yazarlar
Arğun, Aslıhan
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science and Technology
Özet
Jeller canlılarda sıkça rastlanan, kolay ve etkin şekilde iyon ve molekül taşıyabilmeyi sağlayan yapılardır. Bir polimer jel, basitçe ıslak ve yumuşak malzeme olarak tanımlanır. Polimer jelleri tanımlayan iki kritik bileşen vardır. Bunlar, sahip oldukları çapraz bağ yapısının bir arada tuttuğu üç boyutlu, elastik, polimer ağyapı ve içerisinde çözünmediği ancak şişebildiği, ağyapısını ayakta tutan ve çökmesini engelleyen sıvıdır. Polimer jellerin elastik, çapraz bağlı ağyapısı malzemeye yumuşak olma özelliğini verirken, içinde hapsolan sıvı sayesinde jeller ıslak malzemeler olarak anılırlar. Her nekadar bu malzemeler ıslak ve yumuşak tabiata sahip görünseler de, endüstride kullanılan cam, metal, seramik gibi malzemelere kıyasla oldukça yüksek deformasyonlara dayanabilirler. Çok çeşitli yapısal mimarilerde ve kimyasal içerik çeşitliliğinde sentezlenebilen bu malzemelerin pek çok alanda yaygın olarak kullanılmalarının yanı sıra, biyomedikal uygulamalar ve kemik-doku mühendisliği gibi alanlarda da oldukça dikkat çekici uygulamalara dahil olmakta ve süren çalışmalar ile geliştirilmektedir. Bu tez çalışması dahilinde, iki farklı jel malzeme farklı yönleri ile incelenmiştir. Bunlardan ilki olan tek ağyapılı (SN), çift ağyapılı (DN) ve üç ağyapılı (TN) kriyojeller, biyo-uyumlulukları bakımından incelenmiştir. İkinci çalışma ise; sentez aşamasının, tasarımının ve termal, mekanik özelliklerinin incelendiği çok parçalı hibrit hidrojelleri içermektedir. İpek, kökleri 5000 yıldan fazla bir geçmişe dayanan biyolojik malzemedir. İpek böceği kozalarından iplikçikler şeklinde elde edilen ipek proteini, geçmişte kraliyet ailelerinin giyiminde de tercih edilmeleri ile seçkin bir ham madde olarak kültürler arasında bir köprü vazifesi görmüştür. Günümüzde de çekme dayanımı, düşük ısı iletkenliği, parıltısı ve nem emme kapasitesi ile yaygın olarak tekstil endüstrisine hizmet etmektedir. İpeğin diğer ilgi çekici uygulama alanları ise şöyle sıralanabilir: ev içi dekorasyon, paraşüt kumaşı, bisiklet tekerleği, yatak dolgusu, vb. Ayrıca ipek, çeşitli fiziksel özellikleri, biyo-uyumluluğu ve pek çek hücre türünün tutunması, gelişimi ve yayılışını desteklemesi sayesinde doku mühendisliği ve rejeneratif tıp gibi biyomedikal sahalarda kullanılan en önemli malzemelerdendir. Bu tez çalışmasının ilk bölümü kapsamında, Bombyx mori türü ipek böceğinden elde edilen ipek-fibroin proteini kullanılarak sentezlenen SN, DN ve TN ipek-fibroin kriyojellerinin biyo-uyumlulukları ön-yapım hücre iskelesi olarak incelenmiştir. Araştırmada kullanılan kriyojeller, araştırma grubumuz tarafından önceden mekanik ve morfolojik özellikleri belirlenmiş malzemelerdir. Önceden belirlenmiş mekanik ve morfolojik karakterleri göz önüne alınan bu kriyojellerin kantitatif sonuçları MTT hücre canlılığı tespit testi ile elde edilmiştir. Kriyojellere ait kalitatif izlenimler ise Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi (LCSM) tekniği ile edinilmiştir. Hücre iskelelerindeki hücre canlılığını kanıtlayan bu teknikle elde edilen görüntüler hücre iskelesinin çeşitli derinliklerinden alınıp üst üste istiflenmesi ile elde edilmiş, kompozit görüntülerdir. Bütün hücre kültürü içeren çalışmalarda normal insan deri fibroblast (NHDF) hücre hattı kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan hücre iskeleleri arasında hücre canlılığı- ile gözenek boyutu, yüzey alanı, çeper kalınlığı ilişkisini gözlemleyebileceğimiz iki tür malzeme bulunmaktadır. Farklı ipek-fibroin derişimlerinde sentezlenen SN kriyojelleri serisinde, artan ipek-fibroin derişimine bağlı olarak düşen gözenek boyutu ve gözeneklilik, çeper kalınlığında ise artış gözlemlenmiştir. Diğer kriyojel serisi ise, ipek-fibroin derişimi artışı ilk ağyapı olan SN'e yeni ağyapıların gömülmesi ile elde edilen DN ve TN kriyojel serisidir. Bu seriye dahil kriyojel örneklerinde gözlemlenen en önemli özellik, çeper kalınlığının artmamasıdır. Bu özellik SN kriyojelin sahip olduğu büyük gözenekler içerisinde, yeni ağyapıların eklenmesiyle meydana gelen, "ikinci nesil gözenekler" olarak adlandırılan, yeni küçük gözeneklerin oluşmasındandır. Ayrıca, çeper kalınlığı artmaksızın oluşan bu ikinci nesil gözenekler sayesinde hücre tutunması için yüzey alanı oldukça artmaktadır. Hem SN kriyojellerin, hem de ikinci nesil gözeneklere sahip DN ve TN kriyojellerin ortak ve önemli özelliği ise, biyomedikal uygulamalarda büyük önem taşıyacak olan içten birbiri ile bağlantılı gözenek yapısına sahip olmalarıdır. MTT hücre canlılığı tespit testi sonuçları %90 ve %75 gözeneklilik oranına sahip kriyojellerde hücre canlılığının daha iyi olduğunu göstermiştir. Bu sonu. literatür ile uyumludur. Ayrıca sonuçlar hücre canlılığı oranlarının kriyojellerin sahip olduğu ipek-fibroin derişiminden bağımsız olduğunu göstermiştir. Normal insan deri fibroblast hücresinin büyütülmesi için gerekli hücre iskelesinin gözenek boyutu literatürde 5-15μm olarak belirtilmesine rağmen, Bu çalışmada incelenen SN-4 (33μm) ve DN-4/29 (3,4μm) kodlu kriyojellerde, 3., 7. ve 10. günlerde, %50'nin oldukça üzerinde iyi hücre canlılığı gözlemlenmiştir. Değerlerin %50'nin üzerinde olması kriyojellerin akut toksititeye sebep olmadığının kanıtıdır. Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi yöntemi ile SN-4 (33μm) ve TN-4/7/20 (4,3μm) kriyojelleri için alınan kompozit görüntüler ile de kantitatif hücre canlılığı testi sonuçları doğrulanmıştır. TN-4/7/20 kodlu kriyojelde gözlemlenen iyi seviyedeki hücre canlılığının bu malzemenin iç yapısında oluşan ikinci nesil gözenekler ile sağlandığı tespit edilmiştir. Görüntülerde hücre çekirdeği ve aktin filamentleri sırasıyla mavi ve kırmızı renklerde net olarak gözlemlenmiştir. Bu gözlem de sağlıklı bir sonuç alındığını kanıtlamıştır. SN, DN ve TN ipek- fibroin kriyojelleri ile yapılan çalışma sonucunda bütün malzemelerin iyi derecede hücre canlılığı gösterdiği, ancak DN ve TN kriyojellerin yapılarındaki ikinci nesil gözenekler yardımı ile küçük gözenek boyutlarına rağmen beklenenin ötesinde iyi hücre canlılığı oranları gösterdiği belirlenmiştir. Bu sebeple, SN kriyojellerin yanı sıra özellikle DN ve TN kriyojellerin ikinci nesil gözenekleri ve üstün mekanik dayanım özellikleri yardımı ile yük dayanımı gerektiren ön-yapım hücre iskelesi uygulamalarında kullanılabilecek uygun malzeme adayları olduğu görülmüştür. Bu tez çalışmasının ikinci kısmında ise çok segmentli hibrit hidrojeller incelenmiştir. Çalışma dahilinde sentezlenip incelenen çok segmentli hibrit hidrojeller, iki ya da üç adet kendi içerisinde farklı fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip segmentlerin bir arada olduğu tek bir hibrit hidrojel yapısıdır ve bu hidrojeller, mekanik karakterizasyona tabi tutulmuştur. Genel anlamı ile "hibrit" tabiri iki farklı elamanı yeni bir karakter elde etmek için yapısında birleştiren, yapısında bulunan elementlerin karışık bir karakterini sergileyen her hangi bir şeydir. Hidrojel çalışmalarında genel kullanımına göre ise fiziksel ya da kimyasal iki bileşeni bünyesinde toplayarak, içeriğindeki bileşenlerden farklı bir karakter sergileyen malzemedir. Kimyasal anlamda doğal ve sentetik, kimyasal ve fiziksel gibi farklı özelliklerin hibriti oluşturabilir. Fiziksel anlamda ise, malzemeden beklenen performansın sergilenebilmesi için, izotropi ve anizotropi, amorfluk ve yarı-kristalin yapı gibi özelliklerin bir araya getirilmesinden doğan yeni bir hidrojel karakteri olabilir. Biyolojik dokular genellikle anizotropik, homojen olmayan, çok fazlı, yumuşak ve sert dokuların oldukça tok bir arayüz ile birbirine kenetlendiği yapılardır. Bazı önemli örnekleri, intervertebral disk (IVD), kemik, ligament ve tendon olarak sıralanabilir. Hidrojeller de, yapılarında su ya da vücut sıvısı gibi sulu-çözeltileri hapsedebilme özellikleri ile biyoloji dokulara oldukça benzer özellikler gösteren malzemelerdir. Son zamanlarda, kimyasal çapraz bağlı geleneksel hidrojellerin sahip olduğu kırılgan yapı dezavantajı, yapılan pek çok çalışma ile aşılmaya çalışılmış ve oldukça iyi örnekleri rapor edilmiştir. Ancak bu hidrojel çalışmalarının çoğu izotropik karakterli malzemeleri sunmuştur. Bu çalışmada ilk defa, anizotropik çok segmentli hidrojeller, segmentleri oluşturan monomer çözeltilerinin yoğunluk farkı katmanlaştırması/stratifikasyonu yöntemi ile bir araya getirilmiş ve tek basamaklı, UV-tetikleyicili kütle polimerizasyonu metodu ile sentezlenmiştir. Yoğunluk farkı ile katmanlaştırma yöntemi yardımı ile çok segmentli hibrit hidrojel yaklaşımı çok çeşitli monomerler için uygulanabilir, uygun bir yöntem olarak sunulbilmektedir. Bu yöntem ile yap-boz parçaları birleştirir gibi, kimyasal ya da fiziksel olarak istenen özellikteki bileşenler bir araya getirilebilir ve anizotropik çok segmentli hibrit hidrojeller elde edilebilir. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan polimerlerin biyouyumlu oldukları bilindiği için, malzemenin olası biyo-uyumlu malzemeler olduğu söylenebilmektedir. Çalışma dahilinde sentezlenen çok segmentli hibrit hidrojellerin segmentleri, bir hidrofilik ve bir ya da iki hidrofobik monomer içermektedir. Kullanılan hidrofilik monomerler N-dimetil akrilamid (DMA) veya akrilik asit (AAc)'dir. Hidrofobik monomerler ise oktadesil akrilat (C18A), stearil metakrilat (C17.3M) ve lauril metakrilat (C12M)'dır. Farklı uzunlukta alkil yan zincirlerine sahip hidrofobik monomerler sayesinde hidrojellerde supramoleküler ve yarı-kristalin yapı sağlanmıştır. Yapıdaki hidrofilik ve hidrofobik monomerlerin değiştirilmesi ya da derişimlerinin değiştirilmesi yoluyla, hidrojellerin termal ve mekanik özellikleri istenilen şekilde ayarlanabilmektedir. İncelemeler sonucunda elde edilen sonuçlara göre, iki segmentli hibrit hidrojeller, yüksek modül (0,46-74 MPa) ve çekme dayanımı (0,19-3,9 MPa) göstermektedir. Basma dayanımı testlerinde ise 24-30 MPa yüke %78-83 gerinim ile dayanım gösterdikleri belirlenmiştir. Üç segmentli hibrit hidrojellerinde yüksek modül (89-118 MPa) ve %50-75 gerinim oranı aralığında 3,6-4,6 MPa çekme dayanımı sergilediği bulunmuştur. Bu özelliklerin IVD'nin mekanik dayanım özelliklerini karşılayabilecek sınırlarda olduğu belirlenmiştir. Çok segmentli hidrojellerin bir ya da iki segment zarar gördüğünde, hidrojellerin kendilerini erime sıcaklığı (Te) üzerinde bir sıcaklıkta onarabildiği görülmüştür. Hidrojellerin arayüzünü taklit etmesi için ayrıca sentezlenen hidrojeller üzerinde yapılan çalışmaya göre, arayüzler de kendilerini onarma özelliğine sahiptirler. Kendini onarma özelliği yanında, çok segmentli hibrit hidrojeller psödö/sözde üçlü- ve çoklu- şekil hafıza özelliği sergilemektedirler. Şekil hafıza yeteneği de bu hibritlerin segmentlerinde var olan yarı-kristalin yapıdan kaynaklanmaktadır. Örneğin, iki segmentli H2-2 olarak kodlanmış hidrojel örneği: bir segmenti amorf, diğer segmenti yarı-kristalin bölge içeren bir hidrojeldir. Yarı-kristalin yapıdaki segment kendi özelinde ikili-şekil hafıza özelliği göstermektedir. Amorf kısım bir Te sıcaklığı göstermediği için şekil hafıza özelliği göstermemektedir (ancak supramoleküler yapısı dahilindeki hidrofobik etkileşimler sayesinde kendini onarma özelliği göstermektedir). Dolayısı ile H2-2 hidrojeli ikili şekil hafıza özelliği göstermektedir. Ancak örneğin, H2-2 hidrojeli her iki segmenti yarı-kristalin yapıda olduğu için ancak geçici şekiller bölgesel olarak segmentlerde sergilenip, malzeme bütününde yaygın olmadığı için psödö/sözde üçlü-şekil hafıza özelliği göstermektedir. Benzer şekilde üç segmentli H3-2 hidrojeli yapısındaki her üç yarı-kristalin bölgeye sahip segment yardımı ile psödö/sözde çoklu-şekil hafıza özelliği sergilemektedir. H3-1 hidrojeli örneğinde ise, her üç segment yarı-kristalin bölgeye sahiptir. Ancak iki uç segmentin Te sıcaklığı birbirine çok yakın, orta segmentin Te sıcaklığı diğerlerinde belirgin şekilde farklı olduğu için bu hidrojel örneği psödö/sözde üçlü- şekil hafıza özelliği göstermektedir. Bu çalışmada sergilenen sentetik yöntem ile beklentilere uygun çok segmentli hibrit hidrojellerin kendini onarma ve çoklu-şekil hafıza gibi üstün özelliklerle sentezlenebildiği gösterilmiştir. Yöntem segmentlerin gerekli mekanik ve termal özelliklerde ayarlanabileceği ve istenen dizilimle bir araya getirilebileceğini göstermiştir. Çalışmada hazırlanan hidrojeller yüksek yük dayanımı gerektiren biyomedikal uygulamalar için uygun birer adaydır. Çalışmadan edinilen genel çıkarım ise, jel sentezinde kimyasal kompozisyon kadar, malzeme mimarisini değiştiren sentez tasarımlarının da büyük önem taşıdığıdır. Aynı kimyasal kompozisyon ve derişimlerdeki malzemelerin sentezde kullanılacak yeni bir tasarımla yepyeni ve daha gelişmiş özellikler sergileyebileceği bu çalışma dahilinde gösterilmiştir.
A polymer gel is simply a soft and wet material. There are two critical points to form a polymer gel. These are: a crosslinked, elastic three dimentional (3D) polymer network architecture and a fluid, filling the interstitial spaces of network, in which the polymer network can swell without dissolving. Their elastic crosslinked network brings them a soft texture, while the entrapped fluid renders this materials wet. Although polymer gels have wet and soft look, they are capable of bearing large deformations. Therefore, polymer gels are mostly used materials with their wide-ranging and tunable properties in such areas like bone-tissue engineering, biomedical applications, etc. Within this thesis, two different kinds of gels were investigated from two different aspects. First, single network (SN), double network (DN) and triple network (TN) cryogels were investigated in the manner of biocompatibility. Then, in the second part, multi-segmented hybrid hydrogels were discussed within the framework of their synthesis, creation aspects and mechanical properties. Silk, as a biological material, covers a history more than 5000 years. This protein polymer in the form of fibers spun by silkworms has served as a bridge between cultures. Today, silk is mainly utilized in textile industry, for its unique properties such as strength, low heat conductivity, luster and moisture absorbance capacity. Another interesting applications of silk include: the interior decoration of houses, parachute clothing, bicycle tires, bed filling, etc. Moreover, most importantly, silk is used in biomedical fields such as tissue engineering and regenerative medicine with their various physical characteristics, biocompatibility and ability to support the attachment, proliferation and differentiation of many types of cells. Within the scope of this thesis, biocompatibity of Bombyx mori based silk-fibroin protein was investigated as a pre-made scaffold through the specific form of porous gels, SN-, DN- and TN- silk-fibroin cryogels. Investigations were carried out on readily-prepared scaffold samples which of their mechanical and morphological properties were already identified by our research group. Pre-identified feature-dependent changes in cell viability was tested quantitatively by MTT assay and qualitative observations were conducted through layer-by-layer images (3D images, composite images collected from different depths of scaffold) from Laser Confocal Scanning Microscopy (LCSM). For all cell-culturing purposes, Normal Human Dermal Fibroblast (NHDF) cell line was used. Among the scaffolds, there were two kinds of materials available to clarify the relationships between cell viability and pore size, surface area and wall thickness. SN cryogels synthesized by increasing fibroin concentrations represents decreasing pore size and porosity while wall thickness is increasing. The other set of cryogels, named as DN and TN through this thesis, formed by double-networking concept represent increasing fibroin concentrations by the penetration of new networks into the SN. However, DN and TN cryogels exhibit no increase in wall thickness with the help of formed pores inside the bigger pores of single network pores, called as second generation pores. Moreover, decreasing in pore size occasioned by second generation pores and increasing fibroin concentration cases were run with increasing surface area. Besides all, both of two cryogel types have an advantage for biomedical applications as they have interconnected pores. MTT assay results represented that cryogels with the porosity (%) ratios between 90 and 75% reveal better cell viability (%) ratios which are in correlation with literature. Additionally, it was revealed that the cell viability results are independent from silk-fibroin concetrations (CSF) of cryogels. Pore size ranges of scaffolds in dermal fibroblast culturing were reported between 5-15μm. Within the range of scaffolds, SN-4 codded cryogel has the bigger pore sizes as 33μm which decrease to 3.4μm for DN-4/29. For both case, MTT say results show good level of cell viability (far more higher than 50 % for 3rd, 7th and 10th days which are the evidence for the absence of acute toxicity). LCSM images received from the SN-4 (33 μm) and TN4/7/20 (4.3μm) cryogels supported the viability results. This good viability results of TN-4/7/20 is attributed to the extraordinary pore architecture generated by second generation pores. As a summary of these results, it was revealed that the DN and TN cryogels can increase the cell viability and be protected from any loss on mechanical properties as well. For this reason, these "second generation pores" make DN and TN cryogels a good candidate for load-bearing pre-made scaffolding approaches. Within the second part of this thesis, multi-segmented hybrid hydrogels with two or three individual segments, which of each have chemically and physcially different properties were investigated from the stand point of designing and mechanical characterization. As a general meaning, "hybrid" term corresponds to a thing which combines two different elements to obtain a new, mixed character. Within hydrogel studies, hybrid is a common use to describe the material via their structural components' character in a chemical or physical manner. Within a chemical manner, a hybrid hydrogel may be a combination of a synthetic and a natural, organic and inorganic sources. On the other hand, in terms of physical manner, a hybrid hydrogel may be a combination of different components having different physical properties together, such as isotropy and anisotropy, amorphus and semicrystalline structure, rigidity and flexibility, etc. to create a new material with a new desired character. Biological tissues are mainly anisotropic, non-homogenous and multi-phasic natural constructs in an intermeshed architecture of hard and soft components with an extremely tough interface. Such important examples are bone, cartilage, ligament, tendon and intervertebral disc (IVD). Hydrogels are important materials with their similarity to biological tissues as they are matrices with ability to entrap the water or aqueous solutions. However, even their common brittle character was overcome by many techniques improved for decades, these high strength hydrogels reported so far were mostly isotropic. Here, for the first time, preparation step of monomer mixtures for the one-step synthesis of hybrid hydrogels was achieved by stratification method to form an anisotropic multi-segmented hybrid hydrogel. By taking advantage of stratification, it was exhibited that, this method is available for a wide range of monomers. Therefore, with several combination possibilities of different segments (with required physical and chemical properties), a multi-segmented hybrid gel formation serves as a puzzle-like method to use in various desired applications. Additionally, based on the biocompatibity of the polymers utilized in this study, hybrid hydrogels are potentially biocompatible. Within this study, two- and three- segmented hybrid hydrogels were synthesized by using UV-initiated bulk copolymerization technique as polymerized density-stratified monomer solutions of hydrophobic (at least one or more) and hydrophilic monomer mixtures. Hydrophilic monemers were N-dimethyl acrylamide (DMA) or acrylic acid (AAc); hydrophobic monomers were octadecyl acrylate (C18A), stearyl methacrylate (C17.3M) or lauryl methacrylate (C12M). Hydrophobic monomers carrying alkyl side chains of different lengths lead to the formation of supramolecular, semi-crystalline hybrid hydrogels. Through this concept, it was possible to adjust the mechanical and thermal properties of segments and interfaces by varying the combinations of monomers. By this means, anisotropic biological tissue inspired hybrid hydrogels were demonstrated, as intermeshed hard and soft components through a strong interface(s), which never rupture at interface region(s). According to the investigations, two-segmented hybrids exhibit a high modulus (0.46−74 MPa) and tensile strength (0.19−3.9 MPa) and sustain 24−30 MPa stresses at 78−83% compressions which are comparable to the natural IVD. Moreover, it was seen that it is possible to expose these gels to cyclic deformation without any irreversible deformation by the help of their semi-crystalline or supramolecular structure. In case of three-segmented hybrids, obtained results show also a high modulus (89-118 MPa) and tensile strength (3.6−4.6 MPa) with tensile strain of 50−75%. Multi-segmented hybrids have the ability to self-heal upon heating above melting temperatures (Tm) once one or both of their gel components are damaged. It was also tested by separate examinations that the interface regions, also, have self-healing ability. Besides the self-healing ability, they exhibit a pseudo triple- or multiple- shape memory effect as well, arising from the different Tm belonging to the gel components of hybrids. For instance, two-segmented hybrid H2-2 (two-segmented hybrid) have only one semi-crystalline segment because the other segment shows an amorphous character. Thus, the H2-2 exhibit only dual shape memory. However, H2-1 (two-segmented hybrid) possesses two semi-crystalline segments which reflect to the whole body of two-segmented hybrid as a pseudo-triple- shape memory effect. Moreover, in case of three- segmented hybrids, H3-1 hydrogel comprises of three semi-crystalline segments which of their two have close Tm values than that of the remaining segment. Thus, two different Tm are obtained resulted in a pseudo-triple- shape memory. Another hybrid example, three-segmented H3-2 hydrogel, was observed as it has three semi-crystalline segments, hence three Tm which of these are in far different temperatures. Stemming from these three different Tm, H3-2 is able to exhibit pseudo-multiple- shape memory effect. The synthetic strategy presented here thus enables combination of multiple gel components in a single, intermeshed material, leading to the preparation of multiple-shape memory hydrogels with multi-responsivity. Moreover, it is also possible to decide the place of stretchable and rigid parts in a multi component hybrid structure, according to the requisite, by using the monomers in different densities and chemical properties.
Açıklama
Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2018
Theses (Ph.D.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2018
Anahtar kelimeler
Biyomalzemeler, Hidrojeller, Biomaterials, Hydrogels
Alıntı