Hsp70 Lerin Atpaz Parçasındaki Moleküler Aktifleşme Mekanısmasının Araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Hsp70’in iki bölge arasındaki sinyal iletim mekanizmasının moleküler temellerinin aydınlanmasını sağlamaya yönelik derin bir bakış açısı kazanılması amaç edinilmiştir. Bu bakımdan, DnaK(1-388) kullanılarak ATPaz allosterik mekanizmasında kritik öneme sahip olduğu düşünülen birçok amino asit ile mutasyon analizleri yapılmıştır. Bu mutasyon analizleri için seçilen residüler, ATPaz bölgesinin nükleotid bağlanma bölgesine yakın His226, Thr225, Asp85, Arg71 ve bu bölgeden biraz uzak olan His295’dir. Deneysel sonuçlarda, D85A ve R71A mutantlarının ATPaz aktivitelerinde yabanıl tip DnaK(1-388)’e kıyasla yüksek oranda artışa sebep oldukları gözlenmiştir. Bu sonuçlar, Asp85 ve Arg71 residülerinin ATPaz aktivitesinin düzenlenmesinde baskılayıcı etkilerinin olduğunu göstermektedir. Bunun yanında, H226A, H226F ve T225A mutantlarınınn pH aktivite profillerinin yabanıl tip DnaK(1-388)’e benzer olması bu mutasyonların ATPaz mekanizmasında bir etkilerinin olmadığını düşündürtmüştür. Bunların dışında, D85E ve H295D mutantları yabanıl tipten farklı bir pH aktivite profili sergilemiş ve DnaK(1-392)’ye benzer olarak pH 7.5 civarında bir aktivite artışı göstermişlerdir. Bu sonuçlar, bu mutantların DnaK(1-392)’ye benzer bir konformasyon gösterip, DnaK(1-392)’den kıyasla daha az da olsa ATPaz aktivitesinin stimülasyonunda etkilerinin olduğunu düşündürtmüştür. ATPaz aktivite deneyleri dışında mutasyonların neden olduğu ikincil yapısal değişiklikleri gözlemlemek için yapılan denatüre edici olmayan jellerde D85E ve H295D mutantlarının ATP varlığında benzer oligomerizasyon göstermeleri DnaK(1-388)’de bağlaç olmamasından dolayı IA ve IIA alt bölgeler arasındaki hidrofobik bölgesinin ATP-bağlı haldeyken açık olması sayesinde eksi yüklü residüler ile etkileşime girerek oligomerizasyona yol açtığını düşündürtmüştür.

In this study, we aimed to understand allosteric mechanism underlying the linker binding effects to the ATPase domain by pinpointing the critical residues that are present in DnaK(1-388). In this regard, mutagenesis was performed on these residues and pH-dependent ATPase assays were done to understand the roles of these residues in the pH-dependent ATPase activity. When pH-activity profiles of Thr225 and His226 replacements were compared to that of the ATPase constructs, we found that mutations of these sites did not alter the ATPase mechanism and we revealed that the activity mechanism of the ATPase domain is different for linkerless version, DnaK(1-388), compared to DnaK(1-392). On the other hand, we found that replacement of Asp85 and Arg71 cause 16 fold increase in the ATPase rate indicating these residues have repressive effects on the modulation of ATPase activity in the linkerless version, DnaK(1-388). In this study, His295 was also investigated for its possible effect on the pH- dependent ATPase activity. We observed similar shift in the pH activity profiles of H295D and D85E mutantsas observed in the DnaK(1-392) may indicating these mutations can stimulate ATPase to a lesser extend than DnaK(1-392). In addition, to understand the structural effects of mutations we also did native gel electrophoresis and observed similar oligomerizations for D85E and H295D suggesting that linker binding cleft is exposed in the DnaK(1-388) in ATP-bound state and interact with negative residues.