Controlled release system including nanoparticles that can be used for hypothyroidism treatment

Abstract

Thyroxine (T4) and Triiodothyronine (T3) hormones secreted by the thyroid gland are required for many vital functions such as regulation of metabolic rate, heart rate, body temperature, breathing, and development of central and peripheral nervous systems, control of body weight, growth and brain development. Hypothyroid disease, which develops due to the low functioning of the thyroid gland, is a clinical condition that should be treated for lifelong to substitute the function of the thyroid hormones that can not be secreted at the required levels. The immune system of hypothyroid patients produces anti-TPO and anti-Tg antibodies against thyroid peroxidase (TPO) and thyroglobulin (Tg) found in thyroid cells. These antibodies not only destroy TPO and Tg, but also damage thyroid cells over time. As the thyroid gland cells are damaged and diminished, the gland begins to lose its feature further due to the reduced number of cells that produce hormones. While some of the T3 needed is produced in parenchymal cells in healthy people, the rest is produced by the deiodination of T4 and Selenium (Se) plays a very important role in performing the functions of deiodinase enzymes. Cepharanthine (CEP), another active agent used in this thesis, is a natural plant extract and can prevent T cell activation by blocking the binding of Tg peptides to the corresponding sequence (HLA-DRβ1-Arg74). In the light of this information, a double-effect release system was created in order to regulate hormones and prevent autoimmune response formation in hypothyroid disease within the scope of this thesis. Characterization studies of the system was performed, release profiles of CEP and Se, which are the active agents, were followed, and at the last step, cytotoxicity tests of each component of the system were carried out in-vitro cell experiments. In the first part of the thesis, nanoparticles (NP) consisting of poly (ethylene-co-vinyl acetate) (PEVA) and poly (ethylene glycol) (PEG) monomethyether were produced by using emulsion diffusion - solvent evaporation method. Nanoparticle synthesis process was optimized by changing the amount of PEG monomethyether (15, 20, 25 and 30%, w/w) added to PEVA and sonication time. It was determined that PEVA based NPs containing 20% PEG monomethyether by weight of PEVA (PEG20-PEVA) and sonicated for 5 minutes have the most appropriate particle size (166.1 nm) and the most monodisperse (PDI: 0.464) size distribution. The chemical characterization of the produced PEG20-PEVA NPs was performed with Raman spectroscopy, and the physical characterization studies were carried out by zetasizer and Scanning Electron Microscopy (SEM). CEP, with 10%, 20 and 30% by weight of PEVA, was loaded into the NPs and encapsulation efficiency and the amount of encapsulated active agent was determined. Although the amount of encapsulated CEP increased as the initial CEP concentration increased, there was a significant decrease in encapsulation efficiency so it was decided to load 10% of CEP by weight of PEVA to the NPs. It was measured that the average size of the CEP loaded particles was 190.5 nm and the PDI value was 0.54. At the beginning of release studies, the effect of particles' drying method on CEP release profile was analyzed. In the study carried out for 14 days, it was determined that the NPs dried in oven released ~7.7% of encapsulated CEP, while the NPs dried in freeze dryer released ~11.3% of CEP. This difference is probably due to the reduction of surface areas of the particles which were agglomerated while drying in the oven. For this reason, long-term release studies in the following stages were carried out using NPs which were freeze-dried and it was observed that PEG20-PEVA NPs released ~35% of encapsulated CEP in 100 days. In the second part of the thesis, block copolymer containing Se was produced in two successive steps. At first, di-(1-hydroxylundecyl)selenide and then PEG-PUSe-PEG block copolymer were synthesized. Characterization of these materials was performed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy. Scale-up could not be achieved during the polymer synthesis, so PEG-PUSe-PEG block copolymer was synthesized in low quantities (~0.45 g/ batch). The synthesized block copolymer was mixed with polyurethane (PU) which is a commercial polymer and matrix production was carried out by using physical mixing - particulate leaching technique. The porosities of the matrices produced by using PU: PEG-PUSe-PEG block copolymers in the ratio of 2: 1 and 1: 1 by weight were both measured as 60% using the liquid exchange method. The pore structures of the matrices were analysed with SEM images and it was seen that matrices had wide pore area distribution with more than half of pore areas are less than 40 μm2. The NPs containing CEP produced in the first stage of the thesis were integrated into the matrices with the help of a micropipette and SEM images showed that the NPs were distributed homogeneously in the matrix. In the parallel study, the release of CEP from both free NPs and NPs loaded into the matrix was followed for 66 days, and it was found that CEP release from NPs are ~23% and ~21.5%, respectively. No hindering effect of matrices to CEP release was observed due to the large pore size. The release of Se which is the second active agent used in the thesis, was followed in ultrapure water and water including 0.1% H2O2 (v/v) and samples taken for 7 days were analysed by Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS). At the end of this period, it was determined that 2:1 and 1:1 (w/w) PU: PEG-PUSe-PEG block copolymers released 0.88 and 11.96 μg Se in ultra pure water, respectively; and 2525.90 μg and 2097.76 μg Se in water containing 0.1% H2O2, respectively. Significant increase in Se release in H2O2 presence was probably caused by the oxidation sensitivity of selenide block copolymers. The responsiveness of Se release to oxidative stress may be an advantage in hypothyroid disease, which has been reported to cause oxidative stress. In the last part of the thesis, three different cytotoxicity tests were done. Firstly, NPs with and without CEP were directly incubated with NIH 3T3 cells. Secondly, matrix effluents of 100% PU, 2:1 and 1:1 PU: PEG-PUSe-PEG block copolymers (w/w) were interacted with cells in cell media (indirect interaction), and finally matrices were seeded with cells (direct interaction). In MTS analysis performed to measure cell viability, it was determined that the cells which interact with the materials showed similar viability with the control groups, in other words, none of the materials had cytotoxic effects on fibroblast cells. The images taken by light microscope, fluorescence microscope and SEM showed that, the cells interacted with the materials, spread on matrices and inside of pores, at the same time, they could interact each other and no difference in the cell morphology was observed compared to the control group. The chemical and physical characterization, imaging, release and cell culture studies carried out within the scope of the thesis have shown that the double-acting system produced by biocompatible materials has the potential to be used as local long-term delivery system for effective treatment of hypothyroidism by reducing the autoimmune response and regulating related hormones.

Tiroid bezi tarafından salgılanan Tiroksin (T4) ve Triiyodotironin (T3) hormonları, metabolizma hızının düzenlenmesi, kalp atış hızının ayarlanması, nefes alma, merkezi ve periferik sinir sistemlerinin gelişimi, vücut ısısının ayarlanması, vücut ağırlığının kontrolü, büyüme ve beyin gelişimi gibi birçok hayati fonksiyonun gerçekleşmesi için gerekli olan tiroid hormonlarıdır. Tiroid bezinin az çalışmasına bağlı olarak gelişen hipotiroidi hastalığı, bu hormonların gerekli düzeyde salgılanmamasına yol açan ve hayat boyu tedavi edilmesi gereken klinik bir durumdur. Hipotiroid hastalarının bağışıklık sistemi, tiroid hücrelerindeki tiroid peroksidaz (TPO) ve tiroglobuline (Tg) karşı, anti-TPO ve anti-Tg antikorlarını üretir. Bu antikorlar sadece vücut tarafından üretilen TPO ve Tg'yi yok etmekle kalmaz, zaman içerisinde tiroid hücrelerine de zarar vermeye başlarlar. Tiroit bezi hücreleri zarar görüp azaldıkça, bez özelliğini kaybetmeye başlar ve hacmi küçülerek hormon üretecek hücre sayısı azalır. Sağlıklı bireylerde ihtiyaç duyulan T3'ün bir bölümü parankim hücrelerinde üretilirken, geri kalanı T4'ün deiyodinizasyonu ile oluşur ve deiyodinaz enzimlerin işlevlerini yerine getirebilmesi için Selenyum (Se) çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada kullanılan diğer bir aktif madde olan Cepharanthine (CEP) ise doğal bir bitki ekstraktıdır ve Tg peptidlerinin ilgili sekansa (HLA-DRβ1-Arg74) bağlanmasını engelleyerek, T hücre aktivasyonunun önüne geçebilmektedir. Bu bilgiler ışığında tez kapsamında, hipotiroid hastalığındaki hem otoimmun cevap oluşumunun önüne geçilmesi hem de hormonların düzenlenmesi amacıyla çift etkili bir salım sistemi oluşturularak karakterizasyonu yapılmış, etken maddeler olan CEP ve Se'nin salım profilleri çıkarılmış, son olarak in-vitro koşullarda sistemin her bileşeninin sitotoksisite testleri gerçekleştirilmiştir. Tezin ilk bölümünde, emülsiyon difüzyon-çözücü buharlaştırma yöntemi ile poli(etilen-ko-vinil asetat) (PEVA) ve poli(etilen glikol) (PEG) monometileter'den oluşan nanopartiküller (NP) üretilmiştir. Nanopartikül üretimi PEVA'ya eklenen PEG monometileter (%15, 20, 25 ve 30) miktarı ve sonikasyon süresi değiştirilerek optimize edilmiştir. Ağırlıkça %20 PEG monometileter içeren ve 5 dk boyunca sonikatörde homojenize edilen PEVA bazlı NP'lerin (PEG20-PEVA) en uygun partikül büyüklüğü (166,1 nm) ve en monodispers (PDI: 0,464) dağılıma sahip olduğu tespit edilmiştir. Üretilen PEG20-PEVA NP'lerin kimyasal karakterizasyonu Raman spektroskopisi, fiziksel karakterizasyonu ise zetasizer ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile gerçekleştirilmiştir. Enkapsülasyon verimi ve enkapsüle edilen etken madde miktarları göz önünde bulundurularak NP'lere, ağırlıkça PEVA'nın %10, 20 ve 30'u kadar CEP yüklenmiş ve başlangıç CEP konsantrasyonu arttıkça enkapsüle edilen CEP miktarı da artmasına rağmen enkapsülasyon veriminin düşmesi nedeniyle, partiküllere ağırlıkça PEVA'nın %10'u kadar CEP yüklenmesine karar verilmiştir. CEP yüklü NP'lerin ortalama büyüklüklerinin 190,47 nm, PDI değerinin de 0,54 olduğu tespit edilmiştir. NP'lerden CEP salımının incelendiği çalışmalarda, partikülleri kurutma yönteminin salım profiline etkisi analiz edilmiş ve 14 gün boyunca sürdürülen çalışmada etüvde kurutulan NP'lerin enkapsüle ettikleri CEP'in ~ %7,7'sini saldığı tespit edilirken, dondurarak kurutma cihazında kurutulan NP'lerin içerdikleri CEP'in ~ %11,3'ünü saldıkları ölçülmüştür. Söz konusu fark, etüvde kurutulan partiküllerin aglomere olmaları nedeniyle yüzey alanlarının küçülmesinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle ilerleyen aşamalardaki uzun süreli salım çalışmaları dondurularak kurutulan NP'ler kullanılarak gerçekleştirilmiş ve PEG20-PEVA NP'lerin 100 günde enkapsüle ettikleri CEP'in ~ %35'ini saldıkları gözlenmiştir. Tezin ikinci aşamasında Se içeren blok kopolimer, önce di-(1-hidroksilundesil) selenid ve ardından PEG-PUSe-PEG blok kopolimerinin sentezi olacak şekilde iki aşamada üretilmiştir. Her iki aşamada da sentezlenen malzemelerin karakterizasyonları Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ve Fourier Dönüşümlü Kızılötesi (FTIR) spektroskopisi ile yapılmıştır. Üretim aşamasında ölçek büyütmenin gerçekleştirilememesi ve buna bağlı olarak polimerin az miktarlarda sentezlenebilmesi nedeniyle, sentezlenen blok kopolimer, ticari bir polimer olan poliüretan (PU) ile karıştırılmış ve matris üretimi fiziksel karıştırma-parçacık uzaklaştırma tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ağırlıkça 2:1 ve 1:1 oranında PU:PEG-PUSe-PEG blok kopolimerleri kullanılarak üretilen matrislerin gözeneklilikleri sıvı değişimi metodu kullanarak ölçülmüş ve her iki matris tipinin de %60 gözenekliliğe sahip olduğu görülmüştür. Matrislerin gözenek yapıları ise SEM görüntüleri ile incelenmiş, geniş bir gözenek alanı dağılıma sahip olan matrislerin gözenek alanlarının yarısından fazlasının 40 μm2'den küçük olduğu hesaplanmıştır. Tezin ilk aşamada üretilen CEP içeren NP'ler matrislere mikropipet yardımıyla emdirilmiş ve çekilen SEM görüntülerinde NP'lerin matris içerisinde homojen bir şekilde dağıldıkları görülmüştür. Paralel yürütülen çalışmada, hem serbest NP'lerden hem de matrise yüklenen NP'lerden CEP salımı 66 gün boyunca incelenmiş ve partiküllerin sırasıyla, enkapsüle ettikleri CEP'in ~ %23'ünü ve ~ %21,5'ini saldıkları tespit edilmiştir. Matrislerin geniş gözenek büyüklüğüne sahip olmaları nedeniyle CEP salımını ihmal edilebilir bir oranda geciktirdiği gözlemlenmiştir. Tez kapsamında kullanılan ikinci etken madde olan Se salımı, ultra saf su ve %0,1 H2O2 eklenmiş su içinde incelenmiş ve 7 gün boyunca alınan örnekler İndüktif Eşleşmiş Plazma - Kütle Spektrometresi (ICP-MS) ile ölçülmüştür. Süre sonunda ağırlıkça 2:1 ve 1:1 oranında PU: PEG-PUSe-PEG blok kopolimerlerinden üretilen matrislerde ultra saf suda sırasıyla, 0,88 ve 11,96 μg Se salınırken; %0,1 H2O2 içeren suda sırasıyla 2525,90 μg ve 2097,76 μg Se salındığı tespit edilmiştir. H2O2 (v/v) içeren ortamda Se salımın büyük oranda artmasının selenid blok kopolimerlerinin oksidasyon duyarlılığı sayesinde olduğu sonucuna varılmış ve salınan Se miktarının oksidatif strese cevaben ayarlanabilmesinin, oksidatif stres oluşumuna yol açtığı raporlanmış hipotiroidi hastalığında bir avantaj olabileceği düşünülmüştür. Çalışmanın son aşamasında CEP içeren ve içermeyen NP'ler doğrudan; %100 PU, 2:1 ve 1:1 oranında PU: PEG-PUSe-PEG blok kopolimerlerinden üretilen matrisler ise hem eluentleri alınarak dolaylı olarak hem de üstlerine hücreler ekilerek doğrudan NIH 3T3 hücreleri ile etkileştirilmiştir. Hücre canlılığını ölçmek için yapılan MTS analizlerinde, malzemelerle etkileşen hücrelerin kontrol grupları ile benzer canlılık gösterdikleri tespit edilmiş, yani proje çıktısı olan hiçbir malzemenin fibroblast hücreleri üzerinde sitotoksik etkisi olmadığı belirlenmiştir. Işık mikroskobu, floresans mikroskop ve SEM'de çekilen görüntülerde ise hücrelerin malzemelerle etkileşime girdikleri, malzeme yüzeyinde ve gözeneklerinde yayıldıkları, aynı zamanda birbirlerine tutunabildikleri ve hücre morfolojilerinde kontrol grubuna kıyasla herhangi bir fark olmadığı görülmüştür. Tez kapsamında gerçekleştirilen kimyasal ve fiziksel karakterizasyon, görüntüleme, salım ve hücre kültürü çalışmaları, biyouyumlu malzemelerden üretilen çift etkili sistemin, hem otoimmün cevabı azaltıp, hem de ilgili hormonları düzenleyerek hipotiroidizmin uzun süreli ve etkin tedavisi için lokal bir uygulama olarak kullanılabilme potansiyeli olduğunu göstermiştir.