İdrarda Homogentisik Asitin Kapiler Elektroforez Yöntemi İle Tayini

Abstract

Alkaptonüri, tirozin metabolizması ile ilgili, karaciğerde sentezlenen homogentisik asit oksidaz (HGO) enziminin eksikliği sonucunda ortaya çıkan kalıtsal metabolik bir hastalıktır. Bu enzimin eksikliği, özellikle bağ dokusunda, eklemlerde ve kemiklerde “homogentisik asit” (HGA)’ in birikmesine sebep olur. Oldukça nadir görülen, otozomal çekinik olan kalıtımsal bir hastalıktır. Alkaptonüri tanısı, idrarda homogentisik asit analizi ile doğrulanabilir. Alkaptonürinin ciddi belirtileri erişkin dönemde ortaya çıkmaktadır. Hastalar genellikle normal yaşam süresine sahiptir. Hastalığın ileri derecede sakatlığa neden olması nedeniyle erken tanı konulması; hastanın eğitimi, ağrıyı kontrol eden yaklaşımların ve uygun egzersizlerin öğretilmesi açısından önem taşır. Böylece hastanın uzun dönemde yaşam kalitesini arttırmak olasıdır. Etkin bir analitik yöntem olan kapiler elektroforezin (CE) son yıllarda klinik analizlerine uygulandığı görülmektedir. CE’ nin avantajları; yüksek ayırma etkinliği, yüksek ayrımcılık, kısa analiz süreleri, az miktardaki örnek ve çözücü tüketimidir. CE yüksek ayırma gücü nedeniyle özellikle kompleks yapıdaki örnek matrikslerinin analizi için uygun bir yöntemdir. Silika kapilerler kromatografik kolonlara göre çok ucuzdur, çalışma arasında kolayca yıkanır ve dolgu kolonlarda görünen matriks kirlenmesi problemi yoktur. Kapiler elektroforezin diğer ayırma tekniklerine göre olan bir üstünlüğü, kompleks matrisler içinde küçük moleküllerin örnek hazırlama aşamasında uzun işlemlere tabi tutulmadan sadece seyreltme ve filtrasyon yapılarak analiz edilebilmesidir. Bu çalışmada, HGA’nın idrarda tayini için direkt UV dedeksiyon ile basit, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir kapiler elektroforetik yöntem geliştirilmiştir. Yöntem, deneysel tarama tasarımı ve ardından merkezi kompozit tasarım ile optimize edilmiştir. Yöntemin validasyonu optimize edilen şartlarda gerçekleşmiştir.

Alkaptonuria is a metabolic disease caused by deficiency of homogentisic acid oxidase (HGO), which is associated with tyrosine metabolism in the liver. Deficiency of this enzyme is caused by “homogentisic acid” (HGA) deposition especially in the connective tissue. This is a rare otosomal recessive disease. Diagnosis of alkaptonuria can be confirmed by urine organic acid analysis. Serious symptoms of alkaptonuria arises in adult period of patients. They generally have normal lifetimes. Education of patient, control of pain, and introducing appropriate exercises are crucial for early diagnosis since the disease triggers high degree of disability. By this way, improvement of life quality of patients in long period can be possible. More recently, Capillary electrophoresis (CE), a highly effective analytical technique, has been employed for the clinical analysis. The advantage of the capillary electrophoresis is high separation efficiency, excellent resolution, short analysis time. It consumes small amounts of solvent and sample. CE is particularly suitable in the analysis of complex natural matrices, owing to its higher resolving power. Fused silica capillaries are less expensive than chromatographic columns, easily washed between runs and free of irreversible contamination of the matrix, unlike the packed column. Therefore, biological fluids can be directly analysed without any pretreatment step or with a simple process of sample pretreatment by capillary electrophoresis. One benefit of CE compared to other separation techniques seems CE’ s greater ability to separate small compounds in complex matrices without any sample preparation. In this study, we describe a simple, fast, and reliable capillary electrophoretic method with the direct UV detection for determination of homogentisic acid in urine. The method was optimized using a screening design followed by a central composite design.