Sıvı/superkritik Co2 Ortamına Uygun Yeni Hidrolaz Enzimlerinin İzolasyonu İçin Ön-zenginleştirme Uygulanmış Metagenomik Kütüphane Kurulması

Abstract

Bu çalışmada, sıvı/süperkritik CO2 ortamında aktivite gösterebilecek yeni lipaz enzimlerinin çevresel örneklerden izolasyonu için metagenomik yaklaşım kullanılmıştır. Düşük pH değerine sahip bir ortam olan sıvı/süperkritik CO2 sistemi endüstriyel temizleme işlemlerinde kulanılırken, bu sistemin dezenfeksiyon ve sterilizasyon işlemlerinde de etkinliğinin arttırılması için düşük pH’da aktivitesini koruyabilen hidrolaz enzimleri ile zenginleştirilmesi gerekmektedir. Böyle bir ortamda aktivite gösterebilecek enzimlerin asidofilik mikroorganizmalardan izole edilebileceği düşünülmektedir. Asidofilik mikroorganizmaların yaygın şekilde bulunduğu asit maden sahalarından alınan sediment örnekleri asidofilik mikroorganizmalar için tasarlanmış bir besiyerinde zenginleştirilmiştir. Bu kültürde gelişen mikrobiyal topluluğun, Acidithiobacillus and Sulfobacillus cinslerinin yanı sıra kültüre edilmemiş bakterilerden oluştuğu 16S rDNA yöntemi ile belirlenmiştir. Bu zenginleştirme kültüründen toplam genomik DNA izole edilmiş ve fosmid vektörleri aracılığıyla her biri > 21 kbç genetik bilgi taşıyan 12000 klondan oluşan bir metagenomik kütüphane oluşturulmuştur. Oluşturulan bu gen kütüphanesindeki her bir koloni lipaz enzimi için taranmış ve 3 adet potansiyel lipaz geni tespit edilmiştir.

In this study, metagenomic approach was used for the isolation of novel lipase enzymes from environmental samples for the application in liquid/supercritical CO2. Liquid/supercritical CO2 has been used in industrial cleaning applications but its efficiency in disinfection and sterilization processes needs to be increased by addition of hydrolase enzymes which are active at low pH and in non-aqueous medium. It is thought that enzymes active at low pH conditions can be isolated from acidophilic microorganisms. For this purpose sediment samples were obtained from acid mine drainage environments where acidophiles extensively constitute the microbial flora. Sediment samples were enriched in a medium specific for acidophilic microorganisms. Microbial community present in this enrichment culture was determined by 16S rDNA method and it was found to be composed of Acidithiobacillus and Sulfobacillus genuses together with uncultured bacteria. Total genomic DNA from this pre-enrichment culture was isolated and a metagenomic library that is composed of about 12000 clones, each carrying a genome fragment > 21 kbp was constructed by fosmid vectors. Each individual colony in this library was screened for lipase enzyme and 3 of the colonies showed clear halo formation around themselves indicating potential lipase activity.