Investigating protein variations of Bag-1 in wild type and Bag-1 knockout MCF-7 breast cancer cells

Abstract

The multifunctional Bag-1 protein which is known for its anti-apoptotic role has many critical direct or indirect interaction partners in the cell. According to these interactions, the Bag-1 protein plays an important role in the decision mechanism between survival or death of cancer cells. In previous studies determining the chromosomal location of the Bag-1 gene, it has been stated that this gene is associated with neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's, and cancer. It has been shown that the change in the expression level of Bag-1 protein in the cell is associated with many different cancer types. In addition, it has been demonstrated that Bag-1 may provide clinical benefit as a prognostic marker in the determination of breast cancer, which is the first among women with its incidence. Elevated levels of Bag-1 are generally associated with breast cancer growth, development, and aggressiveness. In particular, interactions with the Hsc70/Hsp70 chaperone family are effective in the long-term survival of breast cancer cells under stress conditions. Our previous studies showed that silencing the Bag-1 protein increases drug-induced apoptosis in breast cancer. Although there are several studies on the association of changes in the expression level of the Bag-1 protein with cancer, the biological aspect of the complete deletion of the Bag-1 gene in breast cancer cells is not detailed explained. Therefore, this thesis study consists of two parts covering the molecular function of the deletion of the Bag-1 gene in MCF-7 breast cancer cells. The first part of the thesis consists of the generation of Bag-1 knockout cells with the CRISPR/Cas9 system, the validation and characterization, and the investigation of the effect of Bag-1 deficiency on the viability and cellular response of MCF-7 cells. The second part of the thesis includes the profiling of differentially expressed microRNAs and the determination of the molecular targets of these significantly differentially expressed miRNAs in wild-type and Bag-1 knockout MCF-7 breast cancer cells.

Anti-apoptotik rolü ile bilinen Bag-1 proteinin hücre içerisine direk ya da indirek olarak etkileşimde bulunduğu bir çok kritik etkileşim partneri bulunmaktadır. Bu etkileşimleri sayesinde Bag-1 proteini özellikle kanser hücrelerinin canlılık ya da ölüm arasındaki karar mekanizmasında önemli bir rol üstlenmektedir. Bag-1 geninin kromozomal lokasyonunun belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalarda bu genin başta kanser olmak üzere Alzheimer, Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkisi olduğu belirtilmiştir. Bag-1 proteinin hücre içerisindeki ifade seviyesi değişiminin bir çok farklı kanser tipi ile ilişkisi belirlenmiş ve kadınlar arasında görülme sıklığı ile birinci sırada yer alan meme kanserinin belirlenmesinde prognostik bir belirteç olarak klinik fayda sağlayabileceği ortaya konmuştur. Bunun yanında, artan Bag-1 seviyesi genellikle meme kanseri büyümesi, gelişmesi ve agresifliği ile ilişkilendirilmiştir. Özellikle Hsc70/Hsp70 şaperon ailesi ile yapmış olduğu etkileşimler meme kanseri hücrelerinin stres koşulları altında uzun süreli hayatta kalmalarında etkili olduğu görülmüştür. Bunun yanında, Bag-1 proteinin susturulmasının meme kanserinde ilaçla tetiklenen apoptozu arttırdığı yaptığımız çalışmalar ile belirlenmiştir. Bag-1 proteinin ifade seviyesindeki değişikliğin kanser ile ilişkisine ait bir dizi çalışma olmasına rağmen, meme kanseri hücrelerinde Bag-1 geninin tamamen silinmesinin biyolojik yönü hakkında çok sınırlı bilgi bulunmaktadır. Bu nedenle bu tez çalışması, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde Bag-1 geninin silinmesinin moleküler fonksiyonunun araştırılmasını kapsayan iki bölümden oluşmaktadır. Tezin ilk bölümü Bag-1 geninin CRISPR/Cas9 sistemi ile silinmesi, karakterizasyonu, MCF-7 hücrelerinin canlılığına olan etkisinin araştırılması ve hücre canlılığını tetikleyici sinyal yolaklarındaki proteomik değişimlerin incelenmesini içermektedir. Tezin ikinci bölümü ise Bag-1 geninin silinmesine özgü olarak MCF-7 meme kanseri hücrelerindeki miRNA (mikroRNA) profilinin çıkarılması ve miRNA'lardan önemli derecede değişiklik gösterenlerin moleküler hedeflerinin belirlenerek hücre içerisindeki fonksiyonlarının araştırılmasını içermektedir.