Receptor-targeted carbon nanotubes as nanomaterials for diagnostics and targeted treatment of cancer

Abstract

Kanser, küresel ölçekte ölüm sebeplerinin başında gelmektedir ve vücuttaki hücrelerin hem kontrolsüz hem de hızla büyümesi kanser dokularının oluşmasına neden olmaktadır. Kanser tümörünün geç tanı ve tedavisi durumunda, tümörün vücudun diğer kısımlarına yayılabilmesi olağandır. Meme kanseri, kadınlar arasında ölüm oranı yüksek olan hastalıklardan biridir. Bu bakımdan, kanserin ilaç salım sistemleriyle tedavisi, geleneksel ilaç uygulamalarına göre büyük avantajlar sağlamaktadır. Bu çalışmanın amacı, meme kanseri tedavisi için optimize edilmiş özelliklere sahip reseptör hedefli karbon nanotüp bazlı nano-taşıyıcı geliştirmektir. Karbon nanotüplerin öne çıkan fiziksel, kimyasal, optik ve NIR floresan özellikleri nedeniyle, taşıyıcı olarak geniş çapta araştırılan malzemelerdir. Tasarlanan sistemin anahtar bölümünü oluşturmak için tek duvarlı karbon nanotüpler (TDKNT'ler) kullanılmıştır ve nano taşıyıcının geliştirilmesi için iki farklı tek duvarlı karbon nanotüp tercih edilmiştir. Nanotüplerin imal edilmesinden sonra, numunelerdeki safsızlıkları gidermek için SWNT'lere saflaştırma işlemi uygulanmıştır. Daha sonra, nano-taşıyıcılara biyouyumluluk özelliklerinin kazandırılması için, biyouyumlu bir polimer olan polietilen glikol (PEG) kullanılmıştır. Literatürde belirtildiği gib PEG'in hidrofilikliği sayesinde polimer nano taşıyıcılara gereken biyouyumluluk sağlanabilmektedir. İlk adımda, her bir TDKNT'yi kaplamak için zincir uzunlukları farklı olan 4 adet PEG (PEG2000, PEG5000, PEG12000 ve dallı PEG5000) polimeri hazırlanmıştır. Bu çalışmadaki sentez işleminde başlangıç noktası metoksi PEG'dir. Bir sonraki adımda, PEG polimerleri PEG-COOH'ye dönüştürülmüştür ve TDKNT'lerin yüzey modifikasyonu için kovalent olmayan bir yaklaşım kullanılmıştır. piren taşıyan PEG elde etmek için, PEG-COOH ile piren metanol arasında bir esterifikasyon reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Son adımda ise, TDKNT'lerin fiziksel kaplamaları, söz konusu piren taşıyan PEG'ler kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen numuneleri karakterize etmek için 1HNMR, FTIR, TGA, UV-vis ve floresan spektroskopisi analizi yapılmıştır. TGA analizinin sonucu, kısa TDKNT'lere PEG bağlanma miktarının, uzun TDKNT'lerden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Üretilen nano-taşıyıcıların biyouyumluluğuna dair bilgi edinmek için, PEG ile kaplanmış TDKNT'ler için in vitro sitotoksisite ve in vivo kan dolaşım süresi analizleri yapılmıştır. PEG ile kaplanmış kısa ve uzun TDKNT'ler için yapılan in vitro sitotoksisite sonuçlarından, kısa TDKNT'lerdeki hücre canlılığının uzun TDKNT numunelerine göre daha yüksek olduğu anlaşılmıştır. PEG polimerinin moleküler ağırlığı azaldıkça, hücre çoğalmasının önlenmesi sonucunda hücre canlılığı azalmıştır. Ayrıca, konfokal floresan mikroskopi görüntüleriyle in vitro sitotoksisite sonuçları birbirini doğrulamıştır. Bir sonraki adımda, fareler üzerinde in vivo kan dolaşım süresi incelenmiştir. İlginç bir şekilde, dallanmış PEG5000 kaplı TDKNT'lerin kan dolaşımında 13 saate yakın kalarak daha uzun bir süre dolaşıma dahil olduğu görülmüştür. Çalışmanın bir sonraki aşamasında, TDKNT'lere yüklemek için bir antikanser ajan olarak Doksorubisin (DOX) kullanılmıştır. Çalışmamızda DOX yükleme çalışmaları iki adımda gerçekleştirilmiştir. İlk adımda, kısa ve uzun TDKNT'ler, DOX yüklemesinin miktarını ve verimini araştırmak için 3 farklı pH'lı tampon çözeltilerinde hazırlanarak incelenmiştir. DOX yükleme ve salım miktarını araştırmak için UV-spektrometresi kullanılmıştır. DOX dalga boyunun karakteristik pikine dair net bir bilgi elde etmek için 350-650 nm arasında taram yapılmıştır. 490 nm'nin karakteristik pik olarak seçilip ileri çalışmalar için kullanılabileceği gözlenmiştir. Bundan sonra, TDKNT'ler için in vitro sitotoksisite araştırılmasıyla ile birlikte DOX-yüklü nanotaşıyıcıların ilaç salım performanslarının daha dikkatli bir incelemesi için, ilaç salım profillerinin matematiksel yaklaşımla incelemesi yapılmıştır. Bir sonraki aşamada, nanotaşıyıcılara reseptör hedefli özellik kazandırmak için, Folik Asit (FA) ligand olarak kullanılmıştır. Piren-FA'nın TDKNT'lere eklenmesinden sonra, numunelerin PEGilasyonu gerçekleştirilmiş ve son olarak, nanotaşıyıcılara DOX ilacı yüklenmiştir. DOX'un farklı pH değerlerinde (5.5, 7.4 ve 9) kısa ve uzun TDKNT'lere yüklenmesi incelenerek, pH 9 da TDKNT'lere DOX yüklemesine daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Nano taşıyıcıların salım performansı, normal ve kanser hücrelerinin içi ortamını taklit etmek için sırasıyla fizyolojik pH 7.4 ve asit pH 5.4'te incelenmiştri. Sonuçlar, tüm nanotaşıyıcıların pH 5.4'te daha yüksek salım miktarına sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca, FA kaplı TDKNT nanotaşıyıcıları, her iki pH'ta da daha yüksek salım performansı göstermiştir. Son aşamada, DOX yüklü TDKNT örnekleri için in vitro sitotoksisite gerçekleştirildi. FA kaplı TDKNT'lerin, FA kaplı olmayan TDKNT'lere göre daha düşük hücre canlılığına sahip olduğu gözlenmiştir. Önceki bölümlerde, in vitro ve in vivo çalışmalarda hasarsız TDKNT'ler kullanılmıştır. Bununla birlikte, TDKNT üretimi ve saflaştırma aşaması boyunca, hasarsız TDKNT'lerin elde edilmesinin önlenemeyeceği düşünülmektedir. Bu çalışmanın devamında, hasarlı nanotüpler ve piren taşıyıcı yapılar arasındaki van der Waals etkileşimi üzerindeki etkisini araştırılmıştır. Buna göre, hasarlı TDKNT'lerde π-π etkileşiminin rolünü araştırmak için, TDKNT yan duvarlarına adsorbe etmek üzere tasarlanmış bir dizi hidroksil ve karboksil fonksiyonelleştirilmiş bileşik ile moleküler dinamik ve deneysel çalışmalar yapılmıştır. Topolojik Stone-Wales hasarlaının TDKNT'ler üzerindeki etkisinin, piren taşıyıcı bileşik yapılarının bağlanma miktarı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. İlk aşamada, 3 farklı TDKNT (hasarsız, hasarlı ve –-COOH fonksiyoneleştirilmiş hasarlı karbon nanotüplerin moleküler dinamik çalışmalar yapılmıştır. Kaplama bileşikleri olarak piren-COOH, piren- (OH)2 ve piren-OH kullanılmıştır. Bağlanma enerjisi ve Radyal Dağılım Fonksiyonu (RDF), piren-COOH'nin su molekülleri ile daha yüksek hidrojen bağı oluşturabildiğini, dolayısıyla TDKNT'leri sulu ortamda dağıtabildiklerini göstermiştir. Ayrıca, aromatik yapısında bozulma nedeniyle -COOH fonksiyonelleştirilmiş hasarlı TDKNT'leri, piren ile etkili bir π-π etkileşiminin sağlayamadığı gözlemlenmiştir. Bu nedenle, pirenin TDKNT'lerin yüzeyine bağlanması kararlı değildir. Son aşamada, piren-COOH, piren- (OH)2 ve piren-OH bileşikleri sentezlenerek ve TDKNT'lerin fiziksel kaplanması için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, piren-COOH kaplı TDKNT'ler, sentezlenmiş TDKNT nanotaşıyıcıları için daha yüksek dağılım sağlamıştır. Piren-COOH, piren- (OH)2 ve piren-OH kaplı TDKNT'lerin dispersiyonu hakkında görsel bilgi edinmek için, TDKNT'lerin t = 0, 1,3,5 saat zaman aralıklarında su içindeki dispersiyonu fotoğraflandı. Sonuçlar, TDKNT'lerin 1 saat sonra su içinde başarıyla dağıldığını açıkça göstermiştir. Pyr-OH ve pyr- (OH)2 ile kaplanmış TDKNT'lerin çökmesi zaman ilerledikçe gerçekleştiği görülmğüştür. Pyr-OH ve pyr- (OH)2 ve su molekülleri arasında düşük H-bağı oluşumu ve daha hidrofobik yapıları nedeniyle TDKNT'lerin daha düşük bir dispersiyouna sahip olduğu gözlemlenmiştir. Pyr-COOH ile kaplanmış SWNT'lerde ise, 5 saat sonra tamamen homojen bir şekilde dipsers olduğu saptanmıştır. Dispersiyon davranışındaki farkın, pyr-COOH içindeki karboksil grupları ve su arasındaki etkili H-bağı etkileşimlerin moleküler dinamik simülasyon sonuçları ile mükemmel uyum içinde olduğu görülmüştür.

Heart disease and cancer are the first and second leading causes of deaths in the world for more than a decade. However, the statistics from the American Cancer Society show that cancer death rate has dropped progressively over the past 25 years in the United States. The decline in cancer mortality is attributed to the gradually drops in smoking and developments in early diagnostics and treatment. Uncontrolled and rapidly growth of cells in the body results in cancer tissues. Appearance of cancer tumor in one part of body may spread to other organs in case of late detection and treatment. Breast cancer is one of the diseases with mortality rate among women. In this regard, treatment of cancer with drug delivery systems offer great advantages over the conventional drug applications. The objective of this study, was to develop receptor targeted carbon nanotube based nanocarrier with optimized properties for breast cancer therapy. Due to the outstanding physical, chemical, optical and NIR fluorescence properties, carbon nanotubes have been widely investigated as nanocarrier. Single walled carbon nanotubes (SWNTs) were used to compose the key part of the designed system. Two different single walled carbon nanotubes (short and long) were utilized to develop the nanocarrier. After fabrication of nanotubes, purification process was applied to the SWNTs in order to remove impurities from the samples. Thereafter, to incorporated biocompatibility to the nanocarriers, poly ethylene glycol (PEG) as biocompatible polymer was used. Owing to its hydrophilicity, this polymer can provide the required biocompatibility to the nanocarriers. Four different PEG polymers in terms of length were prepared to coat both SWNTs. PEG2000, PEG5000, PEG12000 and branched PEG5000 were prepared in the first step. The start point in the synthesis process was methoxy PEG. In next step, these PEG polymers were converted to PEG-COOH. In the next step, noncovalent approach was employed for surface modification of SWNTs. An esterification reaction between PEG-COOH and pyrene methanol was taken place in order to obtain pyrene bearing PEG. In the final step, physical coating of the SWNTs were successfully achieved by utilizing of the mentioned pyrene bearing PEGs. 1HNMR, FTIR, TGA, UV-vis and fluorescence spectroscopy analysis were performed to characterize the synthesized samples. The result of TGA analysis indicated that the amount of PEG binding to short SWNTs was higher than long SWNTs. To gain primary insight into the biocompatibility of the fabricated nanocarriers, in vitro cytotoxicity and in vivo blood circulation time assays were conducted for PEGylated SWNTs. The results of in vitro cytotoxicity for PEGylated short and long SWNTs exhibited that short SWNTs have higher cell viability with respect to long SWNTs samples. Moreover, as the molecular weight of PEG polymer decreased cell viability reduced due to inhibition cell proliferation. Confocal fluorescence microscopy imaging confirmed the results in vitro cytotoxicity. In the next step, in vivo blood circulation time studies were carried out on mice. Interestingly, branched PEG5000 coated SWNTs showed higher blood circulation time with near to 13 hours. In the next phase of the study, Doxorubicin (DOX) as an anticancer agent was used to load to the SWNTs. In the study, DOX loading studies were conducted in two step. At first step, short and long SWNTs were dissolved in buffer solutions with different pH to understand its effect on the amount of DOX loading. UV–vis spectrometer was used to explore the amount of DOX loading and release. To gain a clear understanding to the characteristic peak of DOX wavelength scan was conducted between 350-650 nm. It is observed that 490 nm can be exploited for further studies. Accordingly, 490 nm was used for DOX loading and release studies. In order to impart receptor-targeted feature to the samples, Folic Acid (FA) was employed as ligand. Folic acid (FA) functionalized SWNTs are promising carbon based nanocarriers for targeted delivery of biomolecules to tumor sites. FA is a type of B vitamin that as medication can be used in the treatment folic acid deficiency. FA has high affinity to the folate receptor α (FR-α) and binds to folate receptors that overexpressed on the surface of many types of cancer cells. One of the low molecular weight agents that have been used extensively with PEGylated SWNTs as nanoplatfrom for therapy purpose is DOX. DOX is a chemotherapy medication drug used for the treatment of various types of cancer such as breast cancer, esophageal carcinomas, acute lymphocytic leukemia, bladder cancer and lymphoma since late 1960s. To improve the pharmacokinetics and bioavailability of this anticancer drug, several studies have been conducted in order to enhance the efficiency of the DOX. After incorporation of pyrene-FA to SWNTs, PEGylation of the samples were conducted and finally, DOX molecules were introduced to the nanocarriers. The loading of DOX at different pH values to the short and long SWNTs exhibited that basic pH 9 led to higher DOX loading onto SWNTs. The release performance of the nanocarriers were performed in physiological pH 7.4 and acid pH 5.4 to mimic the intracellular environment. The results showed the all samples have higher release rate at pH 5.4 with respect to pH 7.4. Moreover, FA-conjugated SWNTs nanocarriers showed higher release rate at both pH. In the final step, in vitro cytotoxicity were conducted for the DOX loaded SWNTs samples. It was observed that FA-conjugated SWNTs have lower cell viability with respect to nonFA-conjugated SWNTs. In vast majority of the studies that have been conducted regarding CNTs, these nanostructures were considered as perfect arrangement of carbon atoms in aromatic cylindrical settings. However, through the nucleation and growth process and also exposing to the electron irradiation these nanomaterials inescapably hold structural defects. Undoubtedly, the density and site of these structural defects may have substantial impact on their unique physical, chemical electrical and mechanical properties. Therefore, it is very crucial to address this fundamental issue in CNTs with structural defects. Despite the outstanding promise of non-covalently coated SWNTs for biomedical imaging and molecular therapy applications, a quantitative understanding of structural defects on the non-covalent interactions is lacking. In previous chapters, short and long SWNTs were used in in vitro and in vivo studies. However, it is believed that through the growth and purification phase of the SWNTs production, it is not avoidable to achieve defect-free SWNTs. Consequently, in this chapter, we will investigate the effect of defect bearing SWNTs on van der Waals interaction between nanotubes and pyrene bearing structures. Accordingly, to explore the role of π-stacking interaction in defect bearing SWNTs, molecular dynamics and experimental studies were conducted with a set of hydroxyl and carboxyl functionalized compounds designed to adsorb onto the SWNT sidewalls. We introduce a multisegment SWNT model consisting of pristine, Stone-Wales defects bearing, and carboxyl functionalized/ Stone-Wales defects bearing SWNTs to theoretically and experimentally explore SWNTs behaviors with structural defects. In the model, the mentioned segments were separately created in Material Studio 8.0 software and each segment of the model was allowed to interact with strongly polar organic groups in aqueous medium. Therefore, in the last part of the study, an integration investigation on the effect of topological Stone-Wales defects on SWNTs on the amount of binding pyrene bearing compound were conducted. The rearrangement of two π-bonded carbon atoms in CNTs, fullerenes and graphene creates a crystallographic defect, which is supposed to have important impact on the chemical, electrical, and mechanical properties of these materials. Topological Stone-Wales (SW) defects can be formed by changing the connectivity of C-C bonds in the SWNT sidewall by rotating them 90°. This rotating leads to the formation of two pentagons connected by two heptagons with a 5-7-7-5 topological defect. First, molecular dynamic studies were performed on SWNTs with defect-free, defect bearing nonfunctionalized and –COOH functionalized. Pyrene-COOH, pyrene-(OH)2 and pyrene-OH as coating compounds were used. The results binding energy and Radial Distribution Function (RDF) showed that pyrene-COOH can establish higher H-bond with water molecules therefore, are able to disperse SWNTs in the aqueous medium. Moreover, defect bearing –COOH functionalized SWNTs due to the disruption on their aromaticity may not provide effective π-π stacking with aromatic molecules such as pyrene. Therefore, binding of pyrene to the surface of SWNTs in not stable. In the final part, pyrene-COOH, pyrene-(OH)2 and pyrene-OH compounds were synthesized and were employed for physical coating of SWNTs. As expected pyrene-COOH coated SWNTs provided higher dispersion for the fabricated nanocarriers.