Kromenilyum-siyanin tabanlı seçici ve hassas bisülfit sensörünün geliştirilmesi

Abstract

İlk olarak 1905 yılında m-aminofenol ve ftalik anhidritle bir Lewis asidi varlığında sentezlenmiş olan rodamin bileşiği, ksanten grubunun bir türevi olup kemosensör alanında oldukça yaygın bir şekilde kullanılmıştır. Kendine özgü bir tespit mekanizmasına sahip olmasının yanında yüksek floresans verimi, yüksek absorpsiyon katsayısı ve uzun uyarılma ve emisyon dalgaboyuna sahip olması gibi özelliklerinden ötürü bu bileşiklerile yapılan analizlerin sonuçları hassas ve kesindir. Geniş bir pH aralığında kapalı spirolaktam halkasından ötürü zayıf floresan halde bulunan rodamin türevi bileşikler bir analit varlığında ya da asidik koşullarda bu halkanın açılması sayesinde bütün molekül boyunca π bağı konjugasyonu sağlandığı için kuvvetli floresan hale gelip absorpsiyon ve emisyon sinyallerinin artışı sayesinde kantitatif analizi mümkün kılar. Yakın kızılötesi kemosensörleri hem yakın kızılötesi bölgesinde biyomoleküllerin oto-floresanından kaynaklı arkaplan gürültüsünün az olmasından hem de hücre içi çalışmalarda analiz yaparken bu bölgedeki ışığın yüksek doku penetrasyonu sayesinde daha derin görüntülemeyi mümkün kılabileceğinden ve bu dalgaboyundaki ışığın hücreye zarar verme olasılığının oldukça azalmasından ötürü biyolojik ve çevresel analizlerde sıklıkla tercih edilir. Siyanin türevi, spesifik olarak rodamin-siyanin (ya da kromenilyum-siyanin) türevi kemosensörler özellikle yakın kızılötesi bölgede çalışmalarından dolayı tercih edildiği gibi rodamin türevi bileşiklerdeki özgün tespit mekanizmasına da sahiptir. Bisülfit anyonu; enzim inhibitörü, antimikrobiyal ve antioksidan özelliklerinden dolayı özellikle şekerli ve alkollü gıdalarda koruyucu olarak kullanılıp bu gıdalara uzun raf ömrü sağlayabilen bir anyondur. İnsan vücudundaki aşırısı vücutta, özellikle solunum problemleri yaratan astım, akciğer kanseri, solunum sistemine zarar veren alerjik reaksiyonlar gibi hastalıkların yanında kalp rahatsızlıklarına da sebebiyet verebilir. Bu nedenle gıdalardaki denetimi ve kısıtlamaları oldukça önemlidir. Bisülfit anyonunun tespiti için spektroflorometri, spektrofotometri, kemilüminesans, kromatografi gibi halihazırda birçok yöntem bulunmaktadır. Fakat bu yöntemlerin uygulanması, analiz için zaman harcayıcı ön hazırlık prosedürü ve bu yöntemlerde kullanılan cihazları kullanabilen uzmanlar gerektirir. Bu yöntemlerin bahsedilen olumsuz yönlerinden dolayı; hızlı, kesin ve hassas analizi mümkün kılan kemosensörler, bisülfit analizi için oldukça ilgi görmektedir. UV-Gör ve floresan cihazlarıyla analizin yanısıra, son zamanlarda hızlı ve kolay kantitatif analiz için geliştirilen bir yöntem kolorimetrik kemosensörlerde analiz için gereken tek cihazı sadece akıllı telefona kadar indirgemiştir. Renkler dijital ortamda kırmızı, mavi ve yeşil rengin farklı oranlarda birleşmesiyle tanımlanır. Dolayısıyla hazırlanan sensör bileşiği çözeltisinin-eğer rengi varsa- dijital ortamda (R, G, B) formatında sayısal bir karşılığı vardır. Analit derişiminin değişmesiyle gerçekleşen çözelti rengindeki değişim; dijital ortamdaki bu sayısal değerlerin değişmesi, dolayısıyla değişen analit miktarına karşı bu değişimin doğrusal olabileceği manasına gelir. Bu prensip kullanılarak geliştirilmiş bu yöntem kolorimetrik kemosenörlerlerle yapılan kantitatif analizi oldukça pratik hale getirmiştir. Bu bağlamda, bu tez çalışması kapsamında, aldehit fonksiyonel grubuna sahip kromenilyum-siyanin tabanlı kemosensör (CyR) UV-Gör, floresan spektrometre cihazları ve akıllı telefonla bisülfit tayinin yapılabilmesi için geliştirilmiştir. Daha önce sentezlenmiş olan bu kemosensörün kristal yapısı X-Işını Kristalografisi ile aydınlatılmıştır. Bisülfit anyonunun aldehit fonksiyonel grubuna nükleofilik katılması sonucu spirolaktam halkasının açılabileceği öngörüsünde bulunduğumuz sensörün, içinde %50 DMF yardımcı çözücüsü bulunan pH 5 tampon ortamındaki çözeltisine bisülfit eklendiğinde başlangıçta sarı olan CyR çözeltisinin rengi bisülfit nükleofilik katılma sonucu spirolaktam halkası açılmasıyla öngörüldüğü gibi yeşile dönmüştür. Moleküldeki bu değişiklik UV-Gör spektrumunda 724 nm ve 480 nm bandındaki absorbansların artarken 385 nm 'deki absorbansın artması şeklinde gözlemlenmiştir. Bu eş zamanlı değişim UV-Gör analizinde oransal yöntemi kullanmayı mümkün kılmaktadır. Floresans spektrumunda ise 745 nm 'de zayıf emisyon veren molekülün bisülfit varlığında bu dalga boyundaki emisyonunun şiddetini arttırdığı gözlenmiştir. Bu sonuçla beraber optimizasyon çalışmaları sonucunda spektrofotometrik çalışma koşulları %50 DMF yardımcı çözücüsüyle pH 5 sulu tampon ortamında CyR'nin 30 μM 'lık çözeltisi olmuştur. Optimizasyonun ardından katılma reaksiyonun ne sürede bittiğini anlayabilmek için sensörün cevap süresi çalışması yapılmış ve reaksiyonun dengeye gelme süresi yaklaşık 300 saniye olarak belirlenmiştir. Bu sonuca göre bütün çalışmalar bu süre dikkate alınarak yapılmıştır. Analiz için uygun pH ortamını belirlemek için pH çalışması yapılmış olup CyR'nin pH 1-10 aralığındaki verdiği absorpsiyon ve emisyon sinyallerinin bisülfit katılmasıyla nasıl değiştiği gözlenmiştir. Bu çalışmaya göre CyR'nin pH 5 ve 7 sulu tampon ortamlarında bisülfite uygun cevap verdiği gözlenmiştir. Fakat bisülfit anyonu sulu ortamda sülfit anyonuyla denge halinde olduğundan ve bazik ortamın bu dengenin yönünü sülfite doğru kaydıracağından çalışma koşulu olarak pH 5 sulu tamponu seçilmiştir. Uygun çalışma ortamı kesinleştirildikten sonra seçicilik ve girişim çalışması yapılmış olup bu çalışmanın sonucuna göre CyR'nin herhangi bir anyon varlığında absorpsiyon ve emisyon sinyallerinde bir değişime uğramadan sadece bisülfite cevap verdiği görülmüş ve bisülfite seçici olduğu gözlenmiştir. Bisülfit derişimine göre absorpsiyon ve emisyon sinyallerinin kalibrasyon eğrisinin çıkarılması için titrasyon çalışması yapılmış ve lineer aralığın UV-Gör ölçümlerine göre 10-160 μM ve floresan ölçümlerine göre 145-270 μM olduğu saptanmıştır. Bu kalibrasyon eğrisine göre yapılan tespit limiti sırasıyla 1.15 μM ve 0.09 μM olarak hesaplanmıştır. Bisülfit bağlanma modunun daha iyi anlaşılması için FT-IR, 1H-NMR ve MALDI-TOF ölçümleri yapılmış olup bisülfitin öngörüldüğü gibi aldehit fonksiyonel grubuna katıldığı doğrulanmıştır. Buna ek olarak; CyR'nin kırmızı şarap, roze şarap ve toz şekerde yüksek geri kazanım oranlarıyla bisülfit tespiti yapabildiği gözlenmiştir. Akıllı telefonla bir numunede bisülfit tayini yapılabildiği ise yine akıllı telefon yardımıyla toz şekerde yapılan bisülfit analizinin yüksek geri kazanım yüzdeleri göstermiştir. Son olarak, bir diğer uyguma alanı olan kağıt testi çalışması yapılmıştır. CyR, hazırlanan derişik DMF'teki çözeltisinden kağıt şeritlerine emdirilip bu şeritlerin üzerine farklı derişimlerde bisülfit sulu çözeltisi damlatıldığında bisülfit derişimine göre başlangıçta sarı olan kağıt şeritlerinin farklı yoğunlukta yeşil renkleri elde edilmiştir. Böylece bir numunede kağıttaki yeşil rengin yoğunluğuna göre bisülfit derişimi yaklaşık olarak belirlenebilmektedir. Bütün bu çalışmalar ışığında UV-Gör, floresan ve akıllı telefon olmak üzere üç kanallı analiz gerçekleştiren, UV-Gör ölçümlerine göre oransal yöntem kullanılabilen, seçici ve hassas bir kolorimetrik bisülfit sensörü geliştirilip literatüre kazandırılmıştır.