Biyolojik Hücrelerin Holografik Optik Tuzaklama Ve Raman Spektroskopi Kullanılarak Bir Mikroakışkan Kanal İçerisinde Ayrıştırılması

Abstract

Tek hücrelerin araştırılması hayati önem taşır çünkü nüfustan gelen ölçüm, nüfusta her bireyi temsil etmeyen ortalama bir değer verir. Ayrıca, arzu edilen hücre tipinin sıralanması ve bazen sayılması, o hücrenin derişiminin bir ölçüsüdür. Bu tür mikro ölçekli ölçümler bazen, örneğin hücre döngüsü, hücre sinyalleşme süreçlerini izlemek için gereklidir. Bu sebeple, önce bir holografik optik cımbızlama seti (HOT) kurulumu yapılmıştır. Bu kurulum, İstanbul Teknik Üniversitesi Lazer Spektroskopi Laboratuvarı'nda mevcut optik cımbızlama setinin genişletilmesi ile kurulmuş ve ilerleyen ölçümler için İstanbul Üniversitesi Lazer Spektroskopi Laboratuvarı'nda yeniden bir set kurularak ölçümler alınmıştır. Araştırma projesi kapsamında (İTÜ BAP – proje no 37851) satın alınan Holoeye Pluto BB marka SLM, bir çift yarık girişimi interferometrik düzeneği kullanılarak kalibre edildi. SLM ekranının bir tarafı siyah tutulup, diğer tarafında grilik seviyeleri 0-255 arasındaki değerlerle değiştirilerek faz ölçümleri yapıldı. Üretilen faz farkı – grilik seviyesi eğrisi lineer olana kadar gerilim seviyeleri değiştirildi. Son olarak gama düzeltmesi yapılarak kalibrasyon tamamlandı. Kalibre edilmiş SLM, daha sonra HOT sistemine yerleştirilerek 4-f düzeneği kuruldu. HOT ve spektroskopi ile ilgili tüm görevleri gerçekleştirmek üzere bir Graphical User Interface (GUI) MATLAB'da tasarlanmış ve programlanmıştır. Hologramlar, Gratings and Lenses algoritması kullanılarak, HOT programı yardımı ile hesaplandı. HOT programı, girdi olarak örnek düzlemindeki parçacıkların olması istenen konumunu alır. Deney düzeneğimizde kullanılan kamera doğrudan yazılım ile ilişki kuramadığından, yazılım üzerinde kamera ile aynı çözünürlükte oluşturulan ekran ile kameradaki hareketler eşlenerek uzamsal kalibrasyon yapıldı. Bu sayede yazılım üzerindeki çerçeve üzerinden örnek düzlemindeki konumlar elde edilebildi. HOT deneylerinde kullanılan algoritmalar polistiren (PS) test parçacıkları ile test edildi. HOT yazılımı tarafından oluşturulan dört adet spot örnek düzleminde test parçacıklarının tuzaklanması için kullanıldı. Dört tuzaktan oluşan bu PS parçacığı dizisi, yazılım tarafından Raman spektrum ölçüm bölgesine yönlendirildi. Yazılım, spektrometre ile iletişim kurduktan sonra bir saniye süre ile tek bir spektrum alır. Bu spektrum, CCD pikselleri y-ekseninde bölünerek her bir dilimden gelen sinyal ayrı ayrı ele alınacak şekilde işlendiği için (multi-track), her parçacığın bireysel Raman spektrumlarını elde bir seferde elde etmiş olur. Bu spektrumlar, PS parçacıkları ve maya hücreleri kullanılarak hazırlanmış olan veri kümesiyle karşılaştırılır. Bu karşılaştırmada kıstas ölçüm ile veri kümesi arasındaki korelasyon katsayısıdır. Önceden belirlenen eşik değerlere göre korelasyon katsayısının değeri sınıflandırma için gereken ölçütü belirler. Bu ölçüt kullanılarak parçacıklar her bir sınıf için atanan bölgelere doğru yazılım tarafından ilerletilir. Başlangıç, ölçüm ve sınıflandırma sonrası son konumlar daha önceden belirlenmiş değerler olup, program bu değerleri kullanarak parçacıkları konumlandırır. Gidilecek konumlar daha önceden belirli olduğundan anlık hologram hesaplama yerine, önceden hesaplanmış hologramların kullanılması da tuzaklama ve ayrıştırma verimini oldukça artırmıştır. Maya hücreleri ve E.coli hücreleri kullanılarak biyolojik hücrelerin test Raman ölçümleri düşük pozlama sürelerinde sinyal seviyelerini araştırmak için yapılmıştır. Örnek E.coli ve pozlama süresi bir saniye olduğunda parçacıkların sınıflandırılması için ölçüm sistemimizin yeterli sinyali vermediği görüldü. E.coli hücreleri ile sinyal elde edilebilmesi için eşik pozlama süresi değeri 30 saniye yeterli oldu. Bununla birlikte, maya hücreleri kısa pozlama sürelerinde daha iyi yanıt verdi. Maya hücreleri ile bir saniyelik ölçümlerde önemli bantları ortaya çıkmıştır. Korelasyon katsayının eşik değerinin ayarlanması ile mayalar için bir saniyelik ölçümler için ayrıştırma deneyinin mümkün olduğu görülmüştür. Bu göz önüne alındığında, sınıflandırma testi deneyleri maya hücreleri ve PS parçacıklar kullanılarak yapılmıştır. PS parçacıkları ile maya hücrelerinden oluşan karışık bir çözeltide, sekizli spot dizisi dördü Raman spektrumları ölçüm bölgesinde, dördü de yazılım ekranın sol kenarında daha sonra ölçülmek üzere bekleyen tuzaklardır. İşlemin başlamasıyla birlikte ölçüm bölgesindeki tuzaklardan sinyal alınır. Ölçüm ve sonrasında yapılan sınıflandırmaya göre, parçacıklar ölçüm hücresinde daha önce tanımlanan konumlara yönlendirilir. Bu yönlendirme sırasında iki türlü parçacık iki farklı köşeye gider. İlk grup hareketini tamamladıktan sonra, ikinci grubun hareketine başlamasıyla birlikte ekranın sol tarafında bekleyen dörtlü grup ölçüm bölgesine doğru hareket eder. Bu döngü kullanıcı durdurana kadar devam eder. Bu deneylerde, sınıflandırma başarı ile yapıldı. Raman spektroskopisi ile embriyo kalitesinin belirlenmesine yönelik bir çalışma İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Dr. Ercan Baştu ile işbirliği içinde yapılmıştır. Bu çalışmada, embriyo canlılığını değerlendirmek için objektif bir yöntem bulunması amaçlanmıştır. Değerlendirme embriyoların yetiştiği atık kültür sıvılarından yapılmıştır. Hipotez, atık sıvısında en çok besin tüketen embriyonun en iyi gelişim göstereceği idi. Bu amaçla gönüllü kişilerden alınan örnekler ortalama 30 µL'lik hacimlerle İTÜ Lazer Spektroskopi laboratuvarına sıvı azot tankı içerisinde getirildi. Örnek hacmi küçük olduğundan, Raman hacmini büyütmek ve ölçümlerden en iyi sinyali alabilmek için disk şeklinde bir ölçüm hücresi üretildi. 16'sı hamilelik aşamasına geçemeyen, 15'i hamilelik aşamasına geçebilen 31 embriyo atık sıvısı örneğinden, 30 saniye pozlama zamanı ile arka arkaya 20 ölçüm, bu ölçüm hücresi içinde alınmıştır. Her atık sıvı ölçümünden önce saf su ölçümü ve sonrasında tolüen ölçümü alınmıştır. Tolüen ölçümü kalibrasyon aşamasında kullanılırken, saf su ölçümü, arka plan düzeltilmesi için kullanılmıştır. Ölçümler normalize edilmiş ve taban çizgileri üçüncü derece bir polinom taban profiline uydurularak çıkarılmıştır. Önişlem yapılmış spektrumlara bant bileşen analizi uygulanmış ve bu yöntem ile elde edilen bant alanlarına ve tüm bant oranlarına bir Mann-Whitney U testi uygulanmıştır. En önemlisi 903/942 cm-1 bant alanı oranı olarak bulunmuştur. Bu oranlara K-ortalama kümeleme analizi uygulanarak sınıflandırması yapılmıştır. Bu sınıflandırma sonucu, bu ölçümlerin duyarlılığı ve özgünlüğünün sırasıyla,% 93 ve% 77 olduğunu göstermiştir. Bu çalışma içerisinde ayrıca fenilalanin, valin, glutamin, alanin, arjinin, tirozin, triptofan, glisin, prolin, serin, histidin, prolin, glutamat, ve sistein amino asitlerinin sulu çözeltilerinin Raman spektrumları ölçülmüştür. Bu ölçümler incelendiğinde, glutamin, glisin ve prolin'in 903 cm-1 civarında ve valin'in 942 cm-1 civarında kendine ait en şiddetli bantlarının bulunduğu tespit edildi. Bunlar arasında, glutamin ve glisin literatüre göre embriyo gelişimine en çok katkı yapan amino asitlerdir. Bu sonuç en önemli bant oranının 903/942 cm-1 olduğu sonucumuzla uyum içerisindedir.

Investigation of single cells is crucial, since the measurement from population gives an average value that does not necessarily represent every individual in the population. Besides, sorting and sometimes counting the desired kind of cell is a measure of how the concentration of that cell. These types of micro-scale measurements are sometimes necessary, for example, to monitor the cell cycle, cell-signaling processes. Serving to these purposes, first a holographic optical tweezers (HOT) setup was constructed. This setup was built by improving the current optical tweezers setup in the Laser Spectroscopy Laboratory in Istanbul Technical University. A brand new Holoeye Spatial Light Modulator (SLM) was installed in the system after it was calibrated using an interferometric setup. The holograms were calculated using a Gratings and Lenses algorithm written in MATLAB and implemented by the homemade GUI that manages all the tasks needed for trapping and spectroscopy. The test particles to characterize the HOT setup were polystyrene (PS) particles. An array of four trapped PS particles was manipulated to the Raman spectrum measurement region by the software. The software communicates with the spectrometer and obtains multi-track spectra from the array that gives individual Raman spectra of each particle. These spectra identified by the software using the correlation coefficient of this measurement with the dataset that has already been prepared using PS particles and yeast cells. The test Raman measurements of biological cells using yeast cells and E.coli cells were made to investigate the signal level in low exposure times. The measurement showed that, our system would not respond enough signal to classify particles when the sample is E.coli and the exposure time is one second. However, the yeast cells responded better in short exposure time. Considering these, the sorting test experiments were made using yeast cells and PS particles. In a mixed solution of PS particles and yeast cells, an array of four particles whose members are randomly chosen was moved to the measurement region. According to the measurement and the following classification, the particles are targeted to the previously defined positions in the measurement cell. In these experiments, classifications were made with success. A study to determine the embryo quality by Raman spectroscopy was made in collaboration with Istanbul University Medical School. In this study, it was aimed to find an objective method to assess embryo viability. The preliminary results showed that the sensitivity and specificity of these measurements are %93 and %77, respectively. A Mann-Whitney U test was applied on the band areas and all band area ratios obtained by band component analysis. The most significant one was found to be the band area ratio of 903/942 cm-1. Comparing the measurements of amino acids samples, it was determined that glutamine, glycine, proline, and valine has the most intense bands in the region that includes these significant bands. Among these, glutamine and glycine are the amino acids that contribute to embryo development most, according to the literature.