Kabak Çekirdeğinden Enzimatik Sulu Ekstraksiyon İle Yağ Eldesi Ve Yanıt Yüzey Yöntemiyle Optimizasyonu

Abstract

Kabak çekirdeği (Cucurbita pepo L.), sıcak iklimlerde ve nemli bölgelerde yetişen ülkemizde de geniş coğrafyada yetiştiriciliği yapılan türlerdendir. Özellikle, tohumlarındaki %40-60 yağ oranı ile önemli bitkisel yağ kaynakları arasındadır. İçerdiği yüksek yağ asitlerinin %73-80 civarını, doymamış yağ asitlerinden olan linoleik ve oleik asit oluşturmaktadır. Kabak çekirdeği yapısında bulunan zengin yağ asitleri, antioksidan maddeler ve E vitamini ile gıda, ilaç, kozmetik endüstrisinde ve medikal alanlarda son yıllarda ilgi çeken bir bitkisel tohum haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, bitkisel tohumlardan yüksek kalitede ve verimde yağ ekstraksiyonunda, geleneksel olarak kullanılan çözücü ekstraksiyonu yöntemine alternatif olabilecek bir yöntem geliştirilmesi ve ekstraksiyon işlemine etki eden parametrelerin optimizasyonudur. Ekstraksiyon yöntemi olarak enzimatik sulu ekstraksiyon seçilmiş olup, hücre duvarını degrade etmek için proteaz enzimi eklenmiştir. Deneylerde içerisinde %46,43 oranında yağ içeren Nevşehir menşeili kabuksuz kabak çekirdeği tohumları kullanılmıştır. Proteaz olarak Alcalase 2.5L ticari enzimi kullanılmıştır. Enzimatik ekstraksiyonlar, 0,6-1 mm tohum fraksiyonu ile, 1:7 tohum:tampon çözelti oranında, pH 4-8 aralığında, 0,25-1,50 mL/g enzim miktarlarında, 4-36 saatlik sürede ve 40-70ºC sıcaklıklarda gerçekleştirilmiştir. Optimizasyon öncesi deneyler yapılarak, proteaz enzimi için pH, enzim miktarı, süre ve sıcaklık açısından yüksek ekstraksiyon verimi sağlayacak çalışma aralıkları belirlenmiştir. Ön deneyler sonucunda, pH parametresinin çalışılan aralıkta, verim değerlerinde çok az etki yaptığı görülmüş ve değişken bir parametre olarak seçilmemesine karar verilmiştir. Deneysel tasarımın ilk kısmında, Plackett-Burman yöntemiyle üç değişkenli (enzim miktarı, süre, sıcaklık), iki seviyeli (-1, +1) ve iki tekrarlı deneysel tasarım matrisine göre 16 adet deney yapılmıştır. Seviyelerin seçimi, birinci kısımdaki deney sonuçlarına göre yapılmış olup, düşük ve yüksek seviyeler sırasıyla; enzim miktarı için 0,5-1,0 mL/g tohum, süre için 18-30 saat ve sıcaklık için 45-55ºC olarak belirlenmiştir. Deney sonuçlarının programa girilmesiyle lineer yaklaşım denklem modelinin katsayıları sırasıyla; 0,6537, 1,7625 ve 0,6238 olarak elde edilmiştir. Bu değerlere göre, ileri aşamadaki merkezi bileşik deneysel tasarımında merkez noktanın (0), üç parametre için de yüksek seviyeli değerlerinin seçilmesine karar verilmiştir. Deneysel tasarımın ikinci kısmında, dıştan çemberlenmiş merkezi bileşik kübik tasarım yoluyla üç değişkenli (enzim miktarı, süre, sıcaklık), beş seviyeli (-1,68, -1, 0, +1, +1,68) ve iki tekrarlı deneysel tasarım matrisine göre 34 adet deney yapılmış ve Yanıt Yüzey Yöntemi’yle kabak çekirdeğinden enzimatik sulu ekstraksiyonla yağ eldesinde etkisi olduğu düşünülen parametrelerin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu seviyeler sırasıyla; enzim miktarı için 0,58 mL/g tohum, 0,75 mL/g tohum, 1 mL/g tohum, 1,25 mL/g tohum, 1,42 mL/g tohum; süre için 19,92 saat, 24 saat, 30 saat, 36 saat, 40,08 saat ve sıcaklık için 46,6ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC ve 63,4ºC olarak belirlenmiştir. Elde edilen istatistiki sonuçlara göre; her üç faktörün de ekstraksiyon veriminde etkin oldukları görülmektedir. Sonuç katsayılarına göre ekstraksiyon veriminde sırasıyla, sıcaklık (lineer), sıcaklık (kuadratik), enzim miktarı (lineer), süre (lineer) ve süre (kuadratik) etkili parametreler olarak bulunmuştur. Parametreler arası etkileşimler gözlenmemiştir. Yanıt yüzey grafikleri incelendiğinde temel(lineer) etkilerin yanıttaki etkileri daha belirgin biçimde görülmüştür. Kontrol edilebilir faktörlerin optimal değerleri enzim miktarı 0,72 mL/g tohum, süre 35,56 h ve sıcaklık 49,7ºC olarak bulunmuştur. Optimum noktada yapılan deney sonucu %54,56 olarak bulunmuş olup modelden tahminlenen değere oldukça yakındır.

Oil seeds used and cultivated widely at oil production in our country are sunflower, corn, olive, canola, peanuts, nuts, soy and cotton. Due to the rapid increase in the demand for vegetable oil and the failure to meet this demand at the national level, it is needed to find out alternative sources of the production of vegetable oil from oilseeds and alternative methods to achieve the most effective way of it. Pumpkin seeds with approximately 40-60% fat content are one of the alternative sources of oilseeds to meet the needs of our country. The genus Cucurbita belonging to Cucurbits (Cucurbitaceae) family of plant has some species as Cucurbita pepo, Cucurbita maxima and Cucurbita moschata. In our country, the seeds of Cucurbita pepo L. species are often used in common to obtain the edible vegetable oil as well as snack. This plant grows widely in tropical, subtropical and temperate regions over the world and are cultivated in many areas of the world. Pumpkin production in the world is almost 25 million tons per year and China, India and Russia are the countries of making most production. Turkey ranks 12th among the world countries with the amount of 388.785 tonnes of production. In our country, the leading areas of cultivating pumpkin seeds are Kayseri, Nevsehir, Aksaray, Konya and Edirne, respectively. Pumpkin seeds, in addition to the consumption as snack, are excellent sources for human health due to rich in fat, protein, mineral and amino acid content. It is known that pumpkin seed contains 35-40% of oil, 37% carbohydrates, 35-40% protein ratio, as well as macro and micro elements Ca, K, P, Mg, Fe, Zn and vitamins in it. The pumpkin seed oil has an important place among other vegetable oils because it contains the linoleic and linolenic acids, two very important unsaturated fatty acid that must be taken in food, and have the positive effects on human health with beneficial ingredient. In particular, it is an important source of two of the essential fatty acids for the body, ω-3 and ω-6.The response surface methodology is a statistical technique including optimization. The parameters affecting the process are called as independent variables while the responses are designated as dependent variables. Optimum regions are derived by superimposition of the contour plots or using desirability function or non-linear programming approaches. Response Surface Methodology (RSM) has been also widely used in many food processing application. The aim of this study is the investigation of a method as an alternative to conventional solvent extraction.method with high oil yield and quality and the optimization of the parameters that affect the extraction process. For this purpose, enzymatic aqueous extraction method is selected, and the protease enzymes are added to degrade the cell wall of the plant seeds. Nevşehir origin unhulled pumpkin seeds containing 46,43% lipids are used in the experiments. Commercial enzymes of Alcalase 2.5L were supplied Novozymes Co. used as protease. Alcalase 2.5L is a serine protease enzyme obtained from Bacillus licheniformis microorganisms. It has a high proteolitic activity of 2,5 AU/g (Anson Units/gram). The optimum conditions for enzyme activity are at the temperature between 55-70°C and pH 4-8 interval depending upon the substrate type. Enzymatic extraction experiments were carried with 0.6 to 1 mm grain fraction of seeds and 1:7 seed: buffer ratio. The experiments with the use of Alcalase 2.5L protease ezyme are conducted at interval of 40-70°C temparature, pH 4-8, 0,25-1,0 mL/g seed enzyme amount, 4-36 hours duration. Thus, the interval of the optimum conditions in respect to pH, enzyme amount, time and temparature for the enzyme of protease were determined. By performed pre-experiments before the experimental design, it is intended to determine the interval of high oil yield in terms of pH, enzyme amount, time and temperature for protease enzymes. In preliminary experiments, it is seen that the pH parameter was found to have very little effect on yield and it has been decided not to select as a variable parameter in this study. Aqueous enzymatic extraction conditions to maximize oil yield from pumpkin seeds were optimized using two statistical experimental designs; Plackett-Burman and Circumscribed Central Composite Cubic Design. In the first part of the experimental design, it is made 16 experiments based on Plackett-Burman experimental design matrix with three variables (enzyme amount, duration, temperature), two levels (-1, +1) and two replicates. Selection of the low and high levels is performed according to experimental results in the first part of the study. These values are 0,5-1,0 mL/g seed enzyme amount, 18-30 hours, 45-55ºC temperature, respectively. After entering the results of the experiments proposed by the Plackett-Burman design, the model equation was obtained according to the linear approximation. The equation coefficients and also the effects of the independent variables are obtained as 0.6537, 1.7625 and 0.6238, respectively Thus, three critical factor -amount of enzyme, incubation temperature, incubation time- for oil extraction were pre-evaluated by the Plackett-Burman design using low and high levels of the three variables. High amount of enzyme, high incubation temperature and incubation time significantly influenced parameters. According to these coefficient values, it was decided that the high-level values for the three parameters in Plackett-Burman must be selected as the center point (0) in the advanced stages of the central composite experimental design. A central composite design (CCD) and response surface plots are used to optimize the proved significant factors and to obtain maximum oil yield. In the second part of the experimental design, it is made 34 experiments based on circumscribed centered composite cubic experimental design matrix with three variables (enzyme amount, time, temperature), five levels (-1.68, -1, 0, +1, +1.68) and two replicates. These levels of three parameters, respectively; 0,58 mL/g seed, 0,75 mL/g seed, 1 mL/g seed, 1,25 mL/g seed, 1,42 mL/g seed enzyme amount; 19,92 h, 24 h, 30 h, 36 h, 40,08 h time; 46,6ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC and 63,4ºC temperature. After entering these experiments’ results to the computer software, by using Response Surface Methodology, it was found that all of three parameters are effective for the aqueous enzymatic extraction process of oil from pumpkin seeds. According to the results the linear effect of temperature, the quadratic effect of temperature, the linear effect of enzyme amount, the linear effect of time and the quadratic effect of time were found effective parameters, respectively. Interactions between parameters were not observed. In response surface plots, the basic (linear) effects of the response effect was seen more clearly. The optimal amount of enzyme is 0.72 ml/g seed, time is 35.56 h and temperature is 49,7ºC. Finally, one more experiment is done at the optimum point and the result was found very close to the value estimated from the model as 54,56%.