FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı
Bu topluluk için Kalıcı Uri
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı altında bir lisansüstü programı olup, yüksek lisans ve doktora düzeyinde eğitim vermektedir.
Gözat
Konu "AAA" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeAilevi Akdeniz Ateşi Hastalığında Mefv Varyasyonlarının, Ekspresyonunun Ve Pirin Seviyesinin Analizi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-06-07) Sevinç, Neslihan ; Turanlı, Eda Tahir ; 10111694 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAilevi Akdeniz ateşi (AAA) otozomal resesif olarak kalıtılan otoinflamatuvar bir hastalıktır. Periodik olarak tekrarlayan ateş, eklem göğüs ve karın ağrısı hastalığın belli başlı bulgularıdır. AAA hastalığı bir çok popülasyonda gözlemlenmesine karşın, hastaların büyük çoğunluğunu Akdeniz kökenli popülasyonlardan bireyler oluşturur. Hastalık özellikle, Türkler, Ermeniler, Araplar ve kuzey Afrika Yahudileri arasında yaygındır. AAA hastalarında dönemsel olarak meydana gelen inflammatuvar ataklar çeşitli organlarda amiloid birikimine yol açabilmektedir. Bu durum hastalığın seyrinde ağırlaşmaya yol açmakta ve bireylerin hayat kalitesini ve ömrünü etkileyebilmektedir. Dolayısıyla hastalık prognozu organlardaki amiloid birikiminin engellenmesine bağlıdır. Anti-inflammatuvar bir ilaç olan kolşisin 1972 yılından bu yana AAA hastalığının tedavisinde kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalar ilacın AAA hastalarında pediodik atakları ve amiloid oluşumunu engellediğini göstermiştir. Ancak, hastaların yaklaşık olarak %30-40‟ı ilaca kısmi cevap vermekte, %5-10‟u ise direnç göstermektedir. Buna ek olarak, hastaların %2-5’inde ilaca hassasiyet rapor edilmiştir. Bu nedenle, kolşisine alternatif olabilecek çeşitli biyolojik ajanların AAA hastalığının tedavisindeki rolü araştırılmaktadır. Akdeniz ateşi geni (MEFV) kromozom 16’da 13.3 bölgesinde bulunur ve 10 ekzondan oluşur. Bugüne kadar MEFV geninde 200’den fazla sekans varyasyonu rapor edilmiştir ve bu varyasyonlardan ekzonik bölgelerde yer alanların büyük çoğunluğu hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Hastaların %70’inden fazlasında yaygın olarak gözlemlenen varyasyonlar MEFV geninin ekzon 2 (E148Q, R202Q) ve ekzon 10 (M680I, M694V, M694I ve V726A) bölgelerinde bulunur. Buna karşın, hastalığın teşhisini kolaylaştırmak amacıyla MEFV geni üzerindeki patalojik varyasyonların taranması AAA’nın yaygın olarak gözlemlendiği popülasyonlardaki yüksek taşıyıcılık oranı nedeniyle kesin tanıda yetersiz kalabilmektedir. Bunun yanı sıra, MEFV geni üzerinde her hangi bir patolojik varyasyon saptanamayan, buna karşın tipik AAA kliniği gösteren hastalar da mevcuttur. Bu durum, otozomal resesif geçiş gösteren kalıtsal Mendel hastalıklarında gözlemlenen modele uymamaktadır. Bu amaçla MEFV geninin ilişkili olabilecek epigenetik ve taranskiripsiyonel düzenleyici mekanizmalarını araştırdık. İlk bulgularımıza göre, MEFV geninin ekzon 2 bölgesinde meydana gelen metilasyon hücre çekirdeğinde, hücre kültürü modellerinde ve hasta lökositlerinde alternatif kırpılma sonucunda yeni bir varyant oluşmasına neden oluyor. Bu varyant daha sonra sitoplazmada protein izoformuna dönüştürülüyor. MEFV geninin kırpılmamış formu 781 amino asitten (a.a.) oluşan pirin/marenostrin proteinini kodlar. MEFV-d2 (MEFV Δ2) ise MEFV genine ait alternatif kırpılma sonucunda exon 2 bölgesinin silinmesiyle oluşan bir izoform olup, 570 a.a. uzunluğunda bir protein kodlar. Buna ek olarak pirin proteinine ait başka izoformlar da tanımlanmıştır. Bu tez çalışmasında, AAA hastaları ve kontrollerde MEFV gen varyasyonlarının transkript ve protein seviyesi ile korelasyonu araştırılmıştır. Daha önceki çalışmalar MEFV geninin dendritik hücreler, sinovyal fibroblastlar, nötrofiller, eozinofiller ve monositlerde ifade edildiğini göstermiştir. Farklı MEFV varyasyonlarını MEFV geninin transcript seviyesi ile ilişkilendiren çalışmalar mevcuttur. Yapılan bir çalışmada, AAA hastalarının mRNA seviyeleri sağlıklı bireylerden düşük bulunmuştur. Buna ek olarak, sağlıklı taşıyıcılarla karşılaştırma yapıldığında sağlıklı taşıyıcıların mRNA seviyesi orta düzeyde bulunmuş, bu da mutasyon sayısının mRNA miktarı ile ilişkili olabileceğini düşündürtmüştür. Ayrıca, mutasyonun bulunduğu gen bölgesine ve tipine göre de MEFV ekspresyonunun değişebileceği gösterilmiştir. M694V mutasyonu taşıyan bireylerde mRNA seviyesinin diğer hastalara oranla en düşük seviyede olduğu ve M694V mutasyon sayısındaki artışın bu oranı daha da düşürdüğü belirtilmiştir. Buna ek olarak E148Q mutasyonu taşıyan bireylerin mRNA seviyesinin diğer hastalardan daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Grubumuz tarafından yayınlanan daha önceki çalışmalarda da MEFV taranskript seviyesinin AAA hastalarında düştüğü gösterilmiş, buna karşın alternatif kırpılma sonucunda ekzon 2’nin silinmesiyle oluşan transkript seviyesinin kontrollere oranla hastalarda daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Ancak pirin proteininin AAA hastalığında ve inflamasyondaki rolü henüz aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, yürütülen çalışmada hasta-kontrol çalışması yönteminden yararlanılarak farklı genotiplere sahip AAA hastalarında MEFV geninin ifadesinin ve pirin protein seviyesinin araştırılması amaçlanmaktadır. Bu doğrultuda, 69 AAA hastası ve 28 sağlıklı kontolün genotiplerini belirlemek amacıyla MEFV geninde varyasyon analizi yapılmıştır. 69 AAA hastasından 8’inde (%11) her hangi bir patalojik varyasyon bulunamamıştır. Buna karşın 30 (%43) hastada ekzon 2 bölgesinde varyasyon bulunmuş, 31 (%44) hastada ise ekzon 10 bölgesinde patalojik varyasyonlar tespit edilmiştir. MEFV geninin farklı transkriptlerinin ifadesi ekzon 1-3, ekzon 2-3 ve ekzon 4-5 bağlantı bölgelerini hedefleyen primerler kullanılarak Kantitatif- gerçek zamanlı PZR (Q-PCR) yöntemi ile araştırılmıştır. Farklı genotiplere sahip hastalar ve sağlıklı kontrollerin pirin seviyelerini karşılaştırmak amacıyla ise bireylerin tam hücre lökositleri izole edilerek, bu hücrelerde anti-pirin antikoru kullanılarak western blot analizi yapılmıştır. Elde edilen sonuçların yarı kantitatif analizi Image-Lab yazılımı ile hacim densitometre yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Daha önceki çalışmalardan farklı olarak, yürütülen çalışmada MEFV transkript seviyesinin hasta ve kontoller arasında değişmediği bulunmuştur. Bugüne kadar yürütülen çalışmaların planlanmasındaki farklılıklar ve farklı çalışmalarda MEFV geninin farklı bölgelerinin hedeflenmesi, MEFV geninin farklı transkriptlerinin hedef alınmasına yol açmış, bu durum da çalışmalarda genin ifadesi ile ilgili sonuçların farklılık göstermesiyle sonuçlanmış olabilir. Ancak, daha önceki çalışmalarda sınırlı sayıda örnek ile çalışıldığı, buna karşın yürütülen tez çalışmasında daha önceki çalışmalara oranla daha fazla örnek ile çalışıldığı göz önünde bulundurulmalıdır. Yürütülen çalışmada gen ifadesinin yanı sıra pirin protein seviyesi de 48 hasta ve 24 sağlıklı kontrolde araştırılmış ve AAA hastası bireylerde pirin miktarında kontrollere oranla anlamlı bir artış gözlemlenmiştir (p= 0,0092). Hastalarda gözlemlenen yüksek pirin seviyesinin periodik inflamatuvar ataklara neden olan AAA hastalığının fenotipinin oluşmasında etkili olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen bulgular pirin proteinin imflamasyonu tetikleyici rol oynadığı yönündeki hipotezi destekleyici niteliktedir. Sunulan tez çalışmasında, MEFV geninin transkript seviyesi ile pirin proteinin seviyesi arasında bir korelasyon bulunamamıştır. Bu bulgular AAA hastalığının oluşumunda post-trasnkripsiyonel mekanizmaların etkili olabiliceğini düşündürmektedir. İleriki çalışmalarda, transkript ve protein seviyesinde hücre alt tipleri ayrıştırılarak analizlerin tekrarlanması, bunun yanı sıra transkript ve protein izoformalarının ayrı ayrı incelenmesi MEFV geninin hastalık ile ilişkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. AAA hastalarında atak dönemlerinde yoğun belirtiler gözlemlenir. Bu nedenle, ataklı hastaların çalışmaya dahil edilmesi hastalık patogenezi hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır.
-
ÖgeMefv Alternatif Transkriptlerinin Nötrofil Benzeri Hücrelerde Lokalizasyon Çalışması(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014-02-21) Erdemir, Şule ; Turanlı, Eda Tahir ; 10002307 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAilesel Akdeniz Ateşi (AAA) hastalığı, genellikle Akdeniz toplumlarını (Yahudiler, Araplar, Türkler, Ermeniler, vb.) etkileyen inflamatuar bir hastalıktır. Çoğunlukla peritonite eşlik eden ateş atakları ile kendini göstermektedir. AAA hastalığının geni olan MEFV; 16. kromozomun kısa kolunun 15kb?lık kısmını kapsar. MEFV, nükleer efektör moleküllerin, onkojenezi, embriyonik gelişimi, inflamasyonu ve hematopoezi düzenleyen nükleik aside bağlanan proteinlerin yer aldığı, büyük ölçüde korunmuş bir gen ailesine aittir. 10 adet ekzon içeren bu gen 3.7 kb?lik bir transkript oluşturur ve 781 adet amino asitten oluşan pyrin/marenostrin (P/M) proteinini kodlar. Tam mekanizması bilinmemekle birlikte, P/M proteininin inflamasyon yolağındaki önemi belirlenmiştir. P/M proteini; nötrofiller, eozinofiller, monositler, dendritik hücreler ve sinoviyal fibroblastlarda üretilmektedir. MEFV ekspresyonu; interferon ? (IFN-?), tümör nekrozis faktör ? (TNF-?), lipopolisakkarid (LPS) ve interlökin 1ß (IL-1ß) gibi proinflamatuar ajanlar ile artar. Bugüne kadar, MEFV geni üzerinde 246 varyasyon belirlenmiştir. Bunların 119 tanesi AAA hastalığı ile ilişkili bulunmuştur. Gen üzerindeki mutasyonlar; ekzon 1, 2, 3, 5, 9 ve 10?da yer alır. Mutasyonlar için iki adet sıcak bölge belirlenmiştir: Bunlardan bir tanesi ikinci, diğeri de onuncu ekzondur. En çok görülen beş mutasyon ise şunlardır: İkinci ekzonda yer alan E148Q, onuncu ekzonda yer alan M694V, M680I, M694I ve V726A. 86 kDa?luk pyrin proteini, 5 bölgeden oluşur: N-ucundaki pyrin (PYD) bölgesi, bZIP, B-box, coiled-coil bölgesi, and C-ucundaki B30.2 (PRYSPRY) bölgesi. Her bölgenin protein-protein etkileşimlerinde farklı bir görevi vardır. Örneğin; sitokin salınımı, transkripsiyonel düzenleme, hücre iskeleti sinyali ve hücre ölümü düzenlenmesi vasıtasıyla oluşan inflamasyon bağlantılı proteinlerle etkileşmektedir. Protein çeşitliliğinin artırılmasını sağlayan mekanizmalardan biri olan alternatif kırpılma, aynı öncül mRNA?dan 5? ve 3? kırpılma bölgelerinin farklı birleşimleriyle birden fazla mRNA elde edilmesidir. İnsanlarda, çok sayıda ekzon içeren genlerin %95?inde alternatif kırpılma gerçekleşmektedir. Alternatif kırpılma 6 tipte gruplandırılabilir: (1) kaset-tipi alternatif ekzonlar; (2) ekzon dizileri içerisindeki 5? ya da 3? kırpılma bölgelerinin alternatif seçilimi; (3) karşılıklı hariç tutulan ekzonlar; (4) intron koruma; (5) alternatif promotörler; (6) alternatif poliadenilasyon. İnsanlarda, daha çok ekzon atlama tipindeki alterantif kırpılma görülmektedir. Alternatif kırpılmayla oluşmuş 15 adet MEFV transkripti bulunmaktadır: Tam boy (fl), 2? (d2), 2a, 4a, 8ext, 2?/4a, 2?/8ext, 2?/9ext, 2a/4a, 2a/8ext, del2.3.4, del2.3.4 del7, del2.3.4 del7.8, del2.3.4.5, del3.4 del7.8. Alternatif MEFV transkriptleri arasında yalnızca yedi tanesi proteine çevrilmektedir: Fl, 2?, 2?/8ext, 2?/9ext, 8ext, 2a, 2a/4a. Grubumuzun gerçekleştirdiği önceki bir çalışmada ekzon 2-kırpılmış formun (2?) ekspresyonunun, AAA hastalarında sağlıklı kontrollere göre anlamlı ölçüde yüksek olduğu gösterilmiştir (p=0.026). Son dönemde yapılan çalışmalarda, tam boy ve 2? (Ekzon 2-kırpılmış) formlarındaki pyrin/marenostrin proteinlerinin hücre içi lokasyonları belirli hücrelerde araştırılmıştır. Bu çalışmaların ilkinde; COS-1 hücrelerinde tam boy pyrin/marenostrin proteininin lokalizasyonunun sitoplazmada olduğu tespit edilmiştir. Diğer bir çalışmada; CHO hücrelerinde, tam boy pyrin/marenostrinin sitoplazmada lokalize olurken, 2? formunun nukleusta yer aldığı gösterilmiştir. Bir başka çalışmada; bu iki formun en sık görülen MEFV mutasyonları taşıyan ve taşımayanlarının HeLa hücrelerindeki lokalizasyonu karşılaştırılmıştır. Ancak bu mutasyonların lokalizasyonda bir değişikliğe sebep olmadığı ve tam boy pyrin/marenostrinin sitoplazmada, ekzon-2 kırpılmış formun (2?) ise nukleusta olduğu gözlenmiştir. Lokalizasyonla ilgili yapılan en yeni çalışmada ise sinoviyal fibroblastlara transfekte edilen myc-etiketli tam boy pyrin/marenostrinin sitoplazmada, myc etiketli-2? izoformunun ise yalnızca nukleus içerisinde değil, hatta daha sık olarak sitoplazmada lokalize olduğu gösterilmiştir. Bunun yanında doğal pyrin/marenostrin proteininin çoğunluğu tam boy formdan oluştuğu halde, doğal protein sinoviyal fibroblastlarda, nötrofillerde ve dendritik hücrelerde ağırlıklı olarak nukleusta, monositlerde ise sitoplazmada saptanmıştır. Bu bulgular bize MEFV-2? formunun hastalık patolojisinde rolü olduğunu varsaymamızı sağladı. Bu amaçla tam boy ve 2? izoformunu içeren GFP-etiketli 2 adet plazmid ilk olarak HL-60 (İnsan promiyolositik lösemi hücreleri) hücre hattına transfekte edildi ve proteinlerin lokalizasyonu konfokal mikroskop aracılığıyla saptandı. Daha sonra HL-60 hücreleri DMSO ile inkübe edilip nötrofil-benzeri hücrelere farklılaştırıldı. 0.5-2x105 hücre/mL olacak şekilde dört farklı hücre başlangıç sayısı kullanıldı. 6 gün boyunca %1.25, %1.5 ve %1.75 oranlarında DMSO uygulaması yapıldı. İnkübasyonun ilk üç gününde FBS içermeyen medya kullanıldı. İnkübasyon sonrası, poly-L-lysine kaplı her lamele 3x105 hücre ekildi. 24 saat sonra DAPI ile boyanarak konfokal mikroskop yardımıyla farklılaşma oranı incelendi. En iyi sonuç 0.5x105 hücre/mL ile başlanan inkübasyondan elde edildi. ~ %40 oranında bir farklılaşma görüldü. Hücre farklılaşması akım sitometri yöntemi ile de doğrulandı. Farklılaşma belirteçi olarak CD44 antijeni seçildi. Hücre-hücre etkileşiminde, hücre adezyonu ve hücre göçü olaylarında yer alan bir hücre yüzeyi glikoproteini olan CD44; hemopoetik hücreler de dahil olmak üzere birçok hücre tipinde üretilmektedir. DMSO ile inkübe edilerek nötrofile doğru farklılaştırılan HL-60 hücrelerindeki CD44 ekspresyonunun düşüşü, normal granülosit oluşumu sırasındaki CD44 azalması ile uyumludur. Bu nedenle HL-60 ve DMSO uygulanmış HL-60 (nötrofil-benzeri hücreler) hücreleri CD44 ekspresyonu açısından karşılaştırıldı. Bunun sonucunda DMSO ile inkübe edilmiş hücrelerde CD44 kaybına rastlandı. Daha sonra farklılaştırılan bu hücreler de aynı plazmidler ile transfekte edildi ve proteinler konfokal mikroskopi tekniğiyle gözlemlendi. Bu çalışmada kullanılan HL-60 hücre hattı; all-trans retinoik asit (ATRA), Dimetil Sülfoksit (DMSO), 1?,25-dihidroksivitamin-D3, forbol ester türevleri (TPA) gibi ajanların uygulanması ile nötrofil, monosit ve makrofajlara dönüşebilme özelliklerine sahip süspansiyon bir kültürdür. Malign hücrelerin özelliklerini gösterir ve onkogenleri eksprese eder. Farklılaşmamış HL-60 hücreleri; geniş bir çekirdeğe ve çoklu azurofilik granüllere sahip bazofilik bir sitoplazmaya sahiptir. DMSO uygulamasıyla farklılaşabildiği nötrofiller ise; at nalı veya segmentli/loblu bir çekirdeğe sahiptir. Sitoplazması içerisinde ise küçük ve açık pembe granüller dağılmış durumdadır. Farklılaşma esnasında, HL-60 hücrelerinin çoğalmaları durur, yeni genler eksprese etmeye başlar, morfolojik değişime uğrarlar ve sonunda da apoptoza giderler. Bununla birlikte, pyrin proteinin her iki formunun hücre içerisindeki lokalizasyonları western-blot tekniği ile doğrulanmak istendi. Bunun için her iki plazmid de aynı hücreye verilerek (hem HL-60, hem de nötrofile farklılaştırılan hücreler) ikili transfeksiyon yapıldı. Traansfeksiyondan 24 saat sonra, DMSO uygulanmış ve uygulanmamış hücrelerden total, sitoplazmik ve nükleer protein izolasyonları gerçekleştirildi. Ancak western-blot sonucunda sitoplazmik ve nükleer proteinlerin birbirinden ayrılamadığı görüldü. Bunun kontorolü sitoplazmik bir protein olan b-actin ve nüklear bir protein olan histone-h3 antikorları ile gerçekleştirildi. Bu çalışma sonucu elde ettiğimiz bulgular; tam boy proteinin HL-60 hücrelerinde sitoplazmada lokalize olurken, ekzon 2-kırpılmış formun nukleus içerisinde olduğunu göstermiştir. Öteki taraftan, nötrofil benzeri hücrelerde durum HL-60 hücrelerindekinden farklı bir tablo çizmiştir ve her iki form da sitoplazma içerisinde lokalize olmuştur. MEFV-d2 formunun nötrofil benzeri hücrelerde nukleus içerisinde lokalize olamaması ve bununla birlikte bu formun AAA hastalarında ekspresyonunun yüksek olduğu düşünüldüğünde elde edilen bulgular bu izoformun AA hastalığındaki patolojik rolü hakkındaki hipotezimizi güçlendirmektedir. Bu çalışmanın başka hücre tiplerinde de tekrarlanması gerekmektedir. Örneğin MEFV ekspresyonuna sahip ve inflamasyonda görev alan monositik hücre hatları (THP-1, U937, vb.), bu iki formu taşıyan plazmidlerle transfekte edilerek nötrofil-benzeri hücrelerdeki lokalizasyon durumuyla karşılaştırılmalıdır. Bununla birlikte protein deteksiyonu, sitoplazma ve nukleusu birbirinden düzgün bir biçimde ayırabilecek farklı yöntemler uygulanarak tekrarlanmalıdır. Bu çalışmayı desteklemek amacıyla in vitro infeksiyon modeli oluşturulup tam boy ve ekzon 2-kırpılmış formların loklaizasyonları araştırılabilir.
-
ÖgeSağlıklı Yaşlıların İmmün-genetik Özellikleri: Yaygın Mefv Mutasyonlarının Ve Gen İfadesinin Analizi(Fen Bilimleri Enstitüsü, ) Karaman, Sinem ; Turanlı, Eda Tahir ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsAilesel Akdeniz ateşi (AAA), yaygın olarak Akdeniz toplumlarını etkileyen otozomal çekinik bir hastalıktır. MEFV (ailesel akdeniz ateşi geni) geninde bulunan beş mutasyon, yani E148Q, M680I, M694V, M694I, ve V726A, hastalıkla alakalı alellerin yaklaşık %70’ini oluşturur. MEFV geninin ürünü pirin proteini anti-enflamatuar regülasyon yolizinde rol almaktadır. Bu çalışmanın amacı, bir sağlıklı yaşlı grubu ile normal popülasyonu temsil eden tarihsel kontroller arasında, MEFV’nin en yaygın beş mutasyonunun sıklıkları arasında istatistiksel olarak bir farklılığın varolup varolmadığının ortaya çıkartılmasıdır. MEFV’nin iltihapla alakası gibi, iltihap yanıtında rol alan genlerin arasındaki ilişkinin analizinde kullanılabilecek metodlardan biri, daha once herhangi bir kronik iltihaplı hastalık yaşamamış sağlıklı yaşlılarda bu genlerin sıklığının araştırılmasıdır. Burada sınanan varsayım iltihaplı hastalığa yakalanmayanlarda iltihapla ilgili genlerin serbest toplumda beklenen sıklıktan daha az sıklıkta olmasıdır. Bu amaçla, bu beş mutasyon genotiplendi ve sonuçlar önce tarihsel kontrollerle kıyaslandı, daha sonra da iltihabı işaret eden faktörlerden Romatoid Faktör ve C-Reaktif Protein seviyelerinin pozitivitesine karşılık mutasyon dağılımlarının altgrup analizleri yapıldı. Ayrıca, Gerçek-Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksyonu ile mutasyonlar ve gen ifadesi seviyesi arasındaki olası ilişkiler analiz edildi. MEFV mRNA seviyeleri mutasyon taşıyıcıları, mutasyonsuz alel taşıyıcıları ve bilinen mutasyonları taşıyan AAA hastaları arasında yapıldı.