FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Yüksek Lisans
Bu koleksiyon için kalıcı URI
Gözat
Yazar "Alkurt, Gizem" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Yüksek Lisans'a göz atma
Sayfa başına sonuç
Sıralama Seçenekleri
-
ÖgeOtofaji Ve Apoptoz İlişkisinin Bag-1, Bcl-2 Ve Beclın 1 Üzerinden İncelenmesi(Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-08-31) Alkurt, Gizem ; Doğanay, Gizem Dinler ; 10123776 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and GeneticsBAG (Bcl-2 ilişkili athanogen) ailesi, maya, bitki ve hayvanlarada korunmuş olan ve apoptoz, tümorigenez, sinyalleşme, hücre üremesi ve otofaji gibi hücredeki pek çok önemli mekanizmada rol oynayan, çok fonksiyonlu proteinlerden oluşur. Hsp70/Hsc70 gibi hem normal hem stres altındaki koşullarda hücre dengesinde etkili moleküler şaperonlar ile etkileşimde bulunmaları, bu protein ailesini oldukça önemli kılmaktadır. BAG-1 anti-apoptotik proteini, ısı şok proteinleri, moleküler şaperonlar, sinyal molekülleri ve diğer anti-apoptotik etkenler ile etkileşime giren, BAG ailesinin önemli bir üyesidir. BAG-1’in bilinen ana üç izoformu, BAG-1L, BAG-1M ve BAG- 1S bulundukları dokulara ve hücrelere göre özelleşmiştir. Transkripsiyon, apoptoz, hücre proliferasyonu, hormon aktivitesi ve hücre migrasyonu gibi pek çok hücresel yolakta oynadığı roller sebebiyle BAG-1, hücrenin yaşamını devam ettirmesini sağlayan önemli bir protein olarak görülmektedir. Meme kanseri başta olmak üzere bir çok kanser tipinde anlatımı düzeyine yüksek oranda rastlanılmaktadır. Bu nedenle kanser oluşum ve gelişim mekanizmalarında incelenmesi kayda değer bir proteindir. Organizma içinde homestasiyi sağlamak açısından önemli bir mekanizma olan apoptoz, dış uyaranlara bağlı olarak hücrenin programlı ölümünü sağlar ve morfolojik değişikliklere yol açar. Hücrede apoptoz mekanizması, ekstrinsik ve intrinsik yolak olmak üzere iki farklı şekilde çalışabilir. Ekstrinsik yani dış etkenlere bağlı yolakta hücre membranında bulunan Fas reseptörüne Fas ligandının bağlanmasıyla başlayan ölüm sinyali hücre içerisinde kaspaz-8’in aktivasyonu ile devam eder ve mitokondriden pro-apoptotik faktörlerin salınması gerçekleşir. İntrinsik yani içsel yolakta ise mitokondri membranının geçirgenliğine bağlı olarak mitokondriden sitokrom-c salınımı ile başlayan ve apoptozom oluşumu ile devam eden bir apoptotik mekanizma mevcuttur. Sitokrom-c salınımı hücre içerisinde mitokondri üzerinde bulunan pro-apoptotik ve anti-apoptotik proteinler arasındaki dengenin bozulması nedeniyle gerçekleşmektedir. Bu dengenin bozulmasında pek çok etken rol oynamaktadır. Öte yandan bu proteinler, Bcl-2 protein ailesi üyesi olup pro-apoptotik olarak Bax, BAK, BAD, anti-apoptotik olarak ise Bcl-2 ve Bcl-xL’dir. BAG-1, Bcl-2 ile olan etkileşiminden dolayı apoptotik yolaklardaki etkenlerden biri olarak görülmektedir. BAG-1’in major rollerinden biri pro-apoptotik faktörlerin örneğin sitokrom-c’nin mitokondriden salınımını engellemektir. Ayrıca BAG-1’in laboratuvarımızda gerçekleştirilen önceki deneyler sonucunda, Akt, c-Raf, Hsp70 ve birkaç protein ile birlikte bir kompleks oluşturarak Bad’ın fosforillenmesini sağlayarak hücre sağkalımına neden olduğu ortaya çıkarılmıştır. Öte yandan, hücrenin stres ortamına uyum sağlayarak homeostaziyi sağlamasında görev alan mekanizmalardan biri otofajidir. Otofaji kelime anlamı olarak hücrenin kendi kendini yemesi anlamına gelmekle beraber hücre farklılaşması, yaşlanma, metabolizmanın regülasyonu ve hücre ölümünde de rol almaktadır. Ayrıca yapılan son çalışmalar ile kanser ve nörodejeneratif hastalıkların oluşmasına neden olan etkenler arasında gösterilmektedir. Atg (otofaji ilişkili gen) protein ailesi ve Beclin 1 otofaji mekanizmasının başlangıcı, devam ettirilmesi ve sonlandırılmasında rol alan önemli proteinlerdir. Beclin 1, Bcl-2’nin interaksiyon partneri olarak keşfedilmiş olup tümörigenez başta olmak üzere pek çok mekanizmada görev almaktadır. Bcl-2 protein ailesine özelleşmiş olan BH3 domanine bulunduran Beclin 1, Bcl-2 dışında bir diğer aile üyesi olan Bcl-xL ile de etkileşime sahiptir. Beclin 1’in Bcl-2 veya Bcl-xL ile olan etkileşimin farklı etkenlerden dolayı bozulması sonucunda hücre apoptoz ve otofaji mekanizmaları arasında bir seçim yaparak canlılığını devam ettirmekte veya ölüm yolunu seçerek canlılığına son vermektedir. Bu çalışmada, Bcl-2 ile ilişkisi olduğu bilinen BAG-1’in Beclin 1 ve Bcl-2 arasındaki etkileşim ve bu etkileşim sonucu hücrenin apoptoz-otofaji mekanizmaları arasındaki seçimindeki rolünün anlaşılması hedeflenmiştir. Bu amaç ile BAG-1 anlatımı arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde öncelikli olarak BAG-1 izoformlarının varlığı immunblotlama ile gösterilmiştir. Ardından BAG-1 anlatımına bağlı olarak Beclin 1 anlatım düzeyinde herhangi bir değişiklik olup olmadığı incelenmiştir. Kayda değer bir değişiklik gözlenmemiş ve bu nedenle Beclin’in fosforilasyon düzeyindeki olası farklılığın tespiti için immunblotlama deneyi gerçekleştirilmiştir. Beclin fosforilasyonunun seviyesi BAG-1 anlatımı azaltılmış hücrelerde kontrol hücrelerine kıyasla artmış olarak gözlemlenmiştir. Ayrıca, Beclin 1 ve Bcl-2 arasındaki etkileşimde BAG-1’in bulunma olasılığı göz önünde bulundurularak öncelikli olarak immunçökeltme deneyleri yapılmıştır. Bu deneylerde Beclin 1 ile doyurulmuş IgG boncuk kullanılarak BAG-1 varlığı tespit edilmiştir. Gözlemlenen bu etkileşimin lokasyon açısından incelenebilmesi amacı ile immunsitokimya deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu etkileşimin Bcl-2’nin köprü görevi yaparak direkt veya indirekt olduğunu gösterebilmek için PRISM programı kullanılarak olası interaksiyonlar incelenmiştir. Bu interaksiyonlar günümüzde bulunan PDB bilgileri ışığında tam olarak gösterilememiş olup proteinlerin tüm yapısal modellemeleri yapıldığı takdirde gösterilecektir. BAG-1’in Bcl-2 ile etkileşimi nedeniyle otofaji mekanizması üzerindeki herhangi bir etkisi olup olmadığını gösterebilmek amacı ile BAG-1 anlatım düzeyi arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde otofajik regülasyonda görev alan proteinlerin anlatım düzeyi kontrol edilmiştir. Aynı zamanda, otofaji inhibitörü 3-MA kullanılarak BAG-1’in de ilişkili olduğu proteinlerden biri olan Akt’ın anlatım düzeyi ve Bad’ın fosforilasyonuna olan etkisi MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde incelenmiştir. Laboratuvarımızda daha önceden gerçekleştirilen deneylerde, BAG-1’in de içerisinde bulunduğu Bad fosforilasyonuna neden olan kompleksteki kinazlardan hangisinin tam olarak Bad fosforilasyonunu gerçekleştirdiği bulunamamıştır. Ancak bu çalışmada kullanılan 3- MA ve GW-5074 inhibitörleri çalışmaları ile Bad fosforilasyonunun kinaz özelliği bulunan Akt proteininin gerçekleştirdiği gösterilmiştir. Bu çalışma ile, ortak interaksiyon partnerleri bulunan (Bcl-2) ve etkileşimleri bilinmeyen anti apoptotik özelliğe sahip BAG-1 ve Beclin 1 arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu olası etkileşim, hücre sinyal yolaklarında büyük bir role sahip olan apoptoz ve otofaji mekanizmalarını etkilemekte olup hücrenin sağkalımı veya ölümü seçeceği yolda önemli bir role sahip olabilir. BAG-1 gerek Bcl-2 interaksiyonu ile sahip olduğu anti-apoptotik özelliği ile gerek Beclin 1 gerçekleştirdiği olası etkileşim sonucunda hücre sağkalımında kritik bir protein olabileceğini bu çalışma ile göstermiş olduk. BAG-1 proteini daha detaylı çalışılması gereken ve özellikle meme kanserinde yüksek bir biyomarkör değeri taşıyan bir protein olup detaylı bir şekilde çalışılması gerekmektedir.