Disease gene identification using linkage and exome analysis

Abstract

Rare disorders are described as conditions with prevalence less than 1 in 2000 people. Approximately 300 million people are affected with rare disease worldwide and in Turkey this number is estimated as 5 million. More than 6000 rare diseases are identified to date and 80% of these are monogenic disorders. Disease onset is usually during childhood with chronic, progressive and debilitating nature. Patients life expectancy is lower than unaffected population. Extensive clinical examination is required for definite diagnosis. For these reasons it is crucial to reveal underlying mechanisms of rare disorders. Chronic recurrent multifocal osteomyelitis (CRMO) is a rare, chronic autoinflammatory disorder that affects children between age of 2-17. It is characterized by aseptic,symmetric and recurrent bone lesionsthat tend to cluster around metaphysis of long bones such as femur, tibia, vertebral column and pelvic floor. Although there is no definitive data on prevalence of CRMO, it is estimated to be 1-2 cases per million. Though having an unclarified etiology and pathogenesis, families with multiple affected members suggest genetic background on disease development. Identification of disease-causing genes - LPIN2 and IL1RA in Majeed syndrome and deficiency of interleukin-1 receptor antagonist (DIRA) which are defined as chronic nonbacterial osteomyelitis (CNO) further strengthen the involvement of genetic features. Takayasu arteritis (TA) also known as pulseless disease is a rare, systemic large vessel vasculitis that predominantly affects women younger than 40 years old. Its major clinical symptoms are occlusion and stenosis of aorta and its main branches accompanied with loss of radial pulse whereas involvement of pulmonary, coronary, renal arteries and aneurysmal formations are also encountered. Severity of the clinical progression depends both on the vessels afflicted and ethnicity of the patient. Highest prevalence of TA is reported in East Asia, especially Japan with up to 40 cases per million. In Turkey, it is postulated to be the second mostly encountered vasculitis with a prevalence up to 12.8/million accompanied with 1.11/million incidence. In spite of undefined etiology, several factors including infections are suggested to be involved in TA pathogenesis. Monozygotic twins diagnosed with TA and familial aggregation observed in some cases indicate the role of genetic factors in disease phenotype. Various genome-wide association studies (GWAS) in cohorts of different size and ethnicity replicated significant association of HLA-B*52 and IL12B to TA. Susceptibility loci FCGR2A/FCGR3A, MLX, HLA-B/MICA and HLA-DQB1/HLA-DRB1 also show significant association with TA. In this study we present three Turkish consanguineous families with multiple members diagnosed with TA and one consanguineous family with two brothers diagnosed with CRMO. Clinical diagnosis and follow up of TA families were done at Cerrahpaşa Medical Faculty whereas CRMO patients were diagnosed and followed in Pamukkale University Medical Faculty. Individuals' were informed and their written consent for participating in the study was obtained accordingly to the ethics committee approval (MBG.22/2014). The aim of the study is to identify disease causing genes by using gene mapping techniques as linkage and exome analyses. Linkage analysis and homozygosity mapping were used to identify non-recombinant homozygous genomic regions that were shared between affected individuals but not with healthy members. By exome analysis, possible candidate genes were investigated. Linkage analysis and homozygosity mapping of CRMO1 family revealed 54 regions that are larger than 200 kb with LOD score > 1.50 that were shared among the affected siblings. Exome analysis on these regions did not reveal any homozygous, non-synonymous and rare variants. Therefore, exome analysis was conducted without basis on linkage regions revealing 10 variants out of which only CARNS:c.1145C>T had a closer association with CRMO phenotype when compared to the rest. However, the region it lied was homozygous in all family members eliminating the variant from being a candidate. Two sisters diagnosed with TA are present in all three families under investigation. TA1 and TA2 families indicate autosomal recessive inheritance model. Affected sisters of TA3 family are half siblings (sibs) who share the same mother but different fathers. CRMO1 family two brothers were diagnosed with CRMO. Genomic DNA samples obtained from peripheral blood were used for genotyping via genome-wide single nucleotide polymorphism (SNP) array where ~710,00 fixed markers were genotyped using Illumina Infinium OmniExpress microarray. By performing multipoint parametric linkage analyses under recessive inheritance model and homozygosity mapping using the SNP data, non-recombinant regions that were shared among the affected individuals but not with the healthy members were detected. Exome sequencing data were used to fine map these regions to variant resolution and investigate the presence of a potential candidate variants involved in the TA or CRMO phenotype. Both linkage and exome analyses were conducted under the recessive inheritance model. Variants in the functional regions (exonic and splicing) with minor allele frequency (MAF) < 0.01 were further examined with bioinformatics tools. Expression sites and levels, pathways, interactions, evolutionary conservation of the genes harboring candidate variants were studied to unravel any potential involvement in the immune system or inflammatory response that could lead to the TA or CRMO phenotype. Linkage analysis of TA1 family revealed 59 regions larger than 200 kilobases (kb) with maximal LOD score 3 1.50. Homozygosity mapping confirmed 41 of these to be shared between affected individuals. Co-joint multipoint parametric linkage analysis of TA1 and TA2 families indicated 123 linkage regions larger than 200 kb with LOD score 3 1.50. Nine of these were shared between all affected members of both families. Exome analysis of these sites revealed 9 variants in total of which 5 were in TA1-04 which are RELN: c.103301976_103301984dup, ANXA8L1: c.449C>T, EHBP1L1: c.1321C>T, MYH14: c.565C>T and SHANK1: c.3947G>A. The remaining 4 variants in TA2-01 are AP4B1: c.767C>T, MST1L: c.811dupG, AGAP: c.G8A and ZNF829: c.1173A>T. Variant filtration and prioritization of the exomes of TA3 family members, revealed no common variant that are found in affected sibs. There was no gene that got hits that were present in both TA patients. Although our results were not indicative of a gene involved in the TA development, this is the first study integrating linkage analysis, homozygosity mapping and exome analysis where three consanguineous families with multiple affected members were included to identify possible disease-causing variants. Variants detected in TA patients should be further studied to unravel their possible roles in TA pathogenesis.

Nadir hastalıklar toplumlarda 2000 kişiden birinde görünen hastlıklardır. Dünyada yaklaşık 300 milyon insanın etkilendiği tahmin edilirken Türkiye'de bu sayı 5 milyon olarak öngörülmektedir. 6000'den fazla nadir hastalık tarif edilmişken, bunların %80'I monogenik hastalıklardır. Genellikle çocukluk çağında ortaya çıkan bu hastalıkların doğası kronik, progresif ve sakat bırakıcı olmasıdır. Hastaların beklenen yaşam süresi genel popülasyona göre daha düşüktür. Kesin tanı için çok detaylı ve derinlemesine klinik incelemeler gerekmektedir. Bu sebeplerden ötürü nadir hastalıkların moleküler tabanını ortaya çıkarmak tanı ve tedavisi için çok önemlidir. Kronik rekürren multifokal osteomiyelit (KRMO) genellikle 2 ile 17 yaş arasındaki çocukları etkileyen enfeksiyöz olmayan nadir ve kronik bir otoinflamatuvar hastalıktır. Aspetik, simetrik şekilde görülen ve tekrarlayan, femur, tibia, omurga gibi kemiklerde lezyonlarının görülmesi ile karakterize edilmektedir. KRMO prevelansı hakkında kesin bir veri olmamakla birlikte, dünya genelinde prevelans 1-2/1000000 olarak tahmin edilmektedir. Aydınlatılmış bir etiyoloji ve patogenezi olmamasına rağmen, birden fazla hastanın bulunduğu aileler hastalığın ortaya çıkmasında genetik faktörlerin etkili olabileceğini düşündürtmektedir. Kronik bakteriyel olmayan osteomiyelit (CNO) olarak sınıflandırılan Majeed sendromu ve interlökin-1 reseptör antagonisti eksikliği (DIRA) hastalıklarının ortaya çıkmasına LPIN2 ve IL1RA genlerindeki mutasyonların sebep olduğunun gösterilmiştir. Literatürde KRMO hastalığına sahip monozigot ikizler raporlanmıştır. Ayrıca, babası başka bir CNO hastalığına sahip KRMO hastası bir çocuk da raporlanmıştır. KRMO patogenizinde genetik bir etmen olduğunu düşündürten bir diğer faktör ise hayvan modelleridir. pstpip2 geninde kendiliğinden gelişen mutasyonların farelerde KRMO fenotipine yol açtığı ve bunun sonraki jenerasyonlara otozomal resesif bir şekilde aktarıldığı gözlemlenmiştir. Bahsedilen kanıtlar birlikte ele alındığında, KRMO patogenizinde genetik faktörlerin etkisi olduğu hipotezi güçlenmektedir. Takayasu arteriti (TA) genellikle aort ve aorttan dallanan damarların tutulumu ile karakterize edilen ve nabızsızlık hastalığı olarak da bilinen sistemik bir büyük damar vaskülitidir. Klinik bulguları arteriyel oklüzyon ve stenöz, ekstremitelerde nabız yokluğu ve inflamasyona bağlı anevrizma oluşumudur. Pulmoner, renal veya kardiyak arterlerde de tutulum gözlenebilmektedir. Nadir bir hastalık olan TA çoğunlukla 40 yaş altı kadınlarda rastlanmaktadır fakat prognoz hem tutulan damar tipi hem de etnisite ile ilişkilidir. Hastalığın en çok göründüğü ülkeler Doğu Asya'dadır. En yüksek prevalans 40/milyon ile Japonya'da. Türkiye'de Behçet hastalığından sonra en sık görülen vaskülit olduğu belirtilen TA'nın, Türkiye için prevalansı 12.8/milyon insidansı ise 1.11/milyon olarak gözlenmiştir. Etiyolojisi kesin olmamakla birlikte TA patogenizinde enfeksiyon dahil çeşitli faktörlerden şüphelenilmektedir. TA tanısı konmuş tek yumurta ikizleri ve bazı olgularda ailesel agregasyon görülmesi, genetik faktörlerin hastalığın ortaya çıkmasında rol oynayabileceğini önermektedir. Çeşitli etnisite ve büyüklüklerdeki kohortlarda yapılan tüm genom bağlantı analizleri (GWAS), HLA-B52 ve IL12B geni TA ile anlamlı şekilde ilişkilendirilmiştir. Türkiye ve Amerika kohortlarında yapılan GWAS sayesinde HLA-B52 ilişkisinin gösterilmesinin yanı sıra FCGR2A/FCGR3A, HLA-B/MICA ve HLA-DQB1/HLA-DRB1 lokuslarının TA yatkınlığı oluşturabileceği gösterilmiştir. Japonya kohortunda ise MLX genindeki bir varyant risk faktörü olarak gösterilmiş ve hastalığın prognozu ile anlamlı derecede ilintili bulunmuştur. Bu çalışmada birden fazla TA ve KRMO tanılı hastanın olduğu akrabalık evliliği olan 4 Türk ailesi çalışılmıştır. Hastaların TA tanısı Cerrahpaşa Tıp Fakültesi'nde, KRMO tanısı ise Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde konulmuştur. Çalışmaya katılacak bireyler bilgilendirilmiş ve yazılı onayları İstanbul Teknik Üniversitesi Etik Kurulu izni doğrultusunda alınmıştır. Bu çalışmanın amacı Takayasu arteriti ve KRMO patogenizinde rol oynayan olası gen veya genlerin bağlantı ve ekzom analizi yöntemleri kullanılarak ortaya çıkarılmasıdır. Genom boyu bağlantı analizi ve homozigotluk haritalandırması kullanılarak hastalar arasında paylaşılan ama sağlıklı bireylerde görülmeyen ortak genomik bölgeler saptanmıştır. Takibinde ise genom-boyu ekzom sekanslama analizi ile aday gen/genler belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışılan üç ailede 2 kız kardeş TA tanısı almıştır. TA1 ve TA2 aile ağacı hastalığın otozomal çekinik kalıtım gösterdiğini önermektedir. TA3 ailesinde is hasta kız kardeşler ortak anneye sahiplerken babaları farklıdır. KRMO ailesinde ise 2 erkek kardeş tanı almışıtr. Bireylerden alınan kan numunelerinden izole edilen genomik DNA kullanılarak ~710000 marker barındıran Ilumina Infinium OmniExpress mikrodizini ile tek nükletoid polimorifzmleri (SNP) genotiplendirmesi yapılmıştır. Çekinik modelde çok noktalı parametrik bağlantı analizi ve homozigotluk haritalandırması yapılarak, hasta bireylerde ortak homozigot bölgeler tespit edilmiştir. Ekzom datası ise bu bölgelerde aday gen/genler taraması için kullanılmıştır. Yaklaşık 140,000 varyant içinden homozigot, nadir ve fonksiyonel (ekzonik ve splicing) olanlar seçilmiş ve belirlenen bölgelerdeki varyantlar incelenmiştir. Ekzom analizi, bağlantı analizi ve homozigotluk haritalandırması sonucundan bağımsız olarak da yapılmıştır. Belirlenen bölgelere bağlı kalmaksızın bahsedilen kriterler kullanılarak bütün varyantlar arasından aday gen tespiti yapılmıştır. Her iki yöntemden çıkarılan ilk adaylar in silico tahmin araçları ile incelenmiş ve gen ifadesi yeri ve seviyesi, yer aldığı yolaklar, etkileşim ortakları, evrimsel korunurluğu gibi faktörler çeşitli veri tabanlarında araştırılmıştır. TA1 ailesinin bağlantı analizi sonucu 200 kilobazdan (kb) büyük maksimum LOD skor değeri 3 1.50 olan 59 bölge belirlenmişti. Homozigotluk haritalandırması bu bölgelerden 41 tanesinin TA hastalarında ortak olduğunu göstermiştir. TA1 ve TA2 ailesinde birlikte gerçekleştirilen bağlantı analizi ise 200 kb'dan büyük LOD skoru 3 1.50 olan 123 bölgeye işaret etmiştir. Homozigotluk hairtalandırması ile bu bölgelerden 9 tanesinin TA1 ve TA2 ailesindeki hastalarda ortak paylaşıldığını göstermiştir. Bağlantı analizi ve homozigotluk haritalandırması takibinde yapılan ekzom analizi yapılmıştır. TA1 ailesindeki hastada RELN: c.103301976_103301984dup, ANXA8L1: c.449C>T, EHBP1L1: c.1321C>T, MYH14: c.565C>T ve SHANK1: c.3947G>A olmak üzere 5, TA2 ailesindeki hastada ise AP4B1: c.767C>T, MST1L: c.811dupG, AGAP: c.G8A ve ZNF829: c.1173A>T olmak üzere 4 varyant belirlenmiştir. TA3 ailesinde 2 hasta kız kardeşin ekzom datası ortak varyant veya ortak bir gende varyant varlığı için araştırılmış fakat paylaşılan bir varyant bulunamamıştır. 2 hasta kız kardeş arasındaki ortak varyantlar, sağlıklı anne ile de paylaşıldığından aday olarak seçilmemiş ve sonraki aşamalarda analize dahil edilmemiştir. CRMO1 ailesinde gerçekleştirilen bağlantı analizi ve homozigotluk haritalandırması 200 kb'dan büyük, LOD skoru > 1.50 olan ve sadece hasta kardeşlerde paylaşılan 54 bölge belirtmiştir. Ekzom datasında bu bölgelerdeki varyantların incelenmesi sonucunda homozigot, nadir varyant bulunamamıştır. Bu yüzden ekzom analizi bu bölgelere bağlı kalmadan yapılmış ve homozigot, nadir ve eş anlamlı olan varyantların ortaya çıkarılması amacıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen 10 varyanttan, sadece CARNS:c.1145C>T KRMO ile ilişkilendirilebilecek bir fonksiyona sahiptir; fakat varyantın bulunduğu bölge SNP datasında incelendiğinde ailedeki herkeste ortak olan bir bölgede olduğu görülmüştür. Elde edilen sonuçlar, TA veya CRMO hastalarında görülen ortak bir gene işaret etmese de TA ve CRMO patogenizi ile ilgili literatürde gerçekleştirilen ilk genom boyu bağlantı analizi, homozigotluk haritalandırması ve ekzom analizi kullanan ilk çalışma olması açısından önemlidir. TA ve CRMO hastalarında tespit edilen varyantların hastalık patolojisindeki muhtemel rollerinin daha detaylı araştırılması gerekmektedir.