Evrimsel Mühendislik Yöntemiyle Elde Edilmiş Tuza Dirençli Bir Saccharomyces Cerevisiae Mutantının Moleküler Ve Fizyolojik Karakterizasyonu

Abstract

Maya; moleküler biyoloji, hücre morfojenezi, kromozom stabilitesi ve hatta yaşlanma için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D endüstri ve akademideki metabolik mühendislik ve sistem biyolojisi çalışmalarında geniş kullanım alanına sahiptir. 1990'larda Alman maya araştırmacılarından oluşan bir konsorsiyum S.cerevisiae'ın, farklı laboratuvar suşlarını çaprazlayarak CEN.PK suşlarının izogenik ailesini geliştirmişlerdir. Alkali katyon homeostazinin sağlanması maya da dahil olmak üzere çoğu hücre tipinde anahtar prosestir. Sodyum klorür insan biyolojisi için çok önemlidir. Na+ ve K+ insanda beslenme için gereklidir ve Li+ ise kemirgen ve keçilerde gerekli bir besin bileşenidir. Tomurcuklu bir maya olan S. cerevisiae harici K+ konsantrasyonu (10 mM–2.5 M) ve Na+ (1.5 M) durumlarında büyüyebilmektedir. Bu çalışmanın amacı fizyolojik ve transkriptomik seviyede NaCl stresinin prensiplerini araştırmaktır. S.cerevisiae daha inceki bir çalışmada (Sezgin T., 2010) etil metansulfonat (EMS) ile muamele edilerek mutajenize edildi ve sonra tuz stresine maruz bırakıldı. Mutant bireyler seçilerek tuza karşı nasıl direnç kazandığı yabanıl tip ile karşılaştırılarak araştırıldı. 5 mM LiCl, 0.5 M NaCl, 0.7 M NaCl and 0.9 M NaCl varlığında YMM'de büyütülen yabanıl tip ve T8'in spesifik büyüme eğrileri oluşturuldu. Tüm bu şartlar altında T8 yabanıl tipe göre daha iyi üredi. T8 ve yabanıl tip'e ait olan fenotipik sonuçlar T8'in sodyum ve lityuma karşı olan direncinin belirgin olduğunu ve T8'in potasyum varlığında yabanıl tip ile aynı düzeyde ürediğini göstermiştir. Bu, T8 katyonik toksisiteye karşı dirençliyken osmotik strese karşı direnç göstermemektedir. %25, %30, %35 sorbitol varlığında YMM'de büyütülen T8 ve yabanıl tip karşılaştırıldığında sorbitol varlığında yabanıl tip ve T8'in aynı düzeyde ürediği görülmüştür. T8'in potasyum varlığında da aynı etkiyi gösterdiği görülmiş olup T8'in osmotik strese karşı direnç göstermediğinin kanıtıdır. pH'ın NaCl direncine olan etkisini incelemek üzere T8 ve yabanıl tip değişen NaCl miktarlarında ve farklı pH aralığına sahip YPD'de büyütülmüş. T8'in NaCl olan direncinin pH değişikliklerinden etkilenmediği gözlenmiştir. T8 ve yabanıl tip katyonik ilaçlara olan direnci test edilmiştir. Katyonik ilaç olarak Tetrametilammonyum (TMA) ve spermin seçilmiştir. Katyonik ilaçlar ile direnç testinin sebebi, eğer dirençte bir farklılık var ise, mutantta elektrokimyasal gradient değişikliği oluşmuş olma ihtimalidir. T8 ve yabanıl tip farklı spermin ve TMA miktarlarına sahip olan YPD'de büyütülmüş. T8 ve yabanıl tip'in TMA ve spermin dirençlerinin farklı olmadığı gözlenmiştir. Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometri (AAAS) sonuçları göstermiştir ki, yüksek oranda harici Na+ ve Li+ konsantrasyonları hem T8 hem de yabanıl tipteki hücre içi Na+ miktarını yükseltirken hücre içi K+ oranı düşmektedir. Hücreler toplam tek değerlikli katyon miktarını K+, Na+ and Li+ streslerinden sonra düşük tutmaktadır. NaCl dirençli mutant T8 yabanıl tip ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde lityum birikmesi görülmemektedir. T8'in lityum direncinin sebebi artmış lityum efflux olmayabilir. Çift stres koşullarında T8 yabanıl tipe göre çok az miktarda Li+ biriktirmiştir. 1 M KCl varlığında yabanıl tip ve T8 karşılaştırıldığında, T8 en yüksek potasyum ve sodyum miktarına sahiptir. T8 LiCl ve NaCl varlığında en yüksek LiCl miktarına sahiptir. AAAS sonuçlarına göre, her stres koşulu altında T8 yabanıl tipe göre yüksek K+/Na+ oranına sahiptir. T8 ve yabanıl tipin K+/Na+ oranları arasındaki fark 5 mM LiCl stresi altında çok belirgindir. LiCl stresinde bu oranın daha fazla olmasının sebebi lityum efflux genlerinin az eksprese olmasından kaynaklı olabilir. Bu durumda T8, NaCl stresindeki gibi LiCl stresinde etkin efflux sistemine sahip olmayabilir. Glikojen ve trehaloz S. cerevisiae'da iki önemli glikoz depolasudur ve bunların üretimi bir çok çevresel stres koşullarına bağlı olarak değişmektedir. Disakkarit trehaloz, tuz adaptasyonunda birikmektedir. Glikojen ve trehaloz miktarının ölçümü sonucunda T8'deki trehaloz ve glikojen miktarı stressiz koşulda göze çarpan bir şekilde yüksektir. Lityum glikojen ve trehaloz miktarını sodyuma göre daha fazla tetiklemektedir. Bu sonuç, lityumun yüksek toksisitesi ile açıklanabilir. Lityum ve sodyumlu stres ve stressiz koşullarda T8'deki trehaloz miktarı glikojene göre daha yüksektir. NaCl ve LiCl varlığında ve yokluğunda T8 ve yabanıl tipin metabolik ürün üretimi Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile incelenmiş. 0.5 M NaCl varlığında T8'in glukoz kullanımının ve etanol üretiminin yabanıl tipe göre daha az olduğu ve en yüksel gliserol üretimine sahip olduğu gözlenmiştir. LiCl varlığında yabanıl tipin glikoz kullanımının belirgin bir şekilde az olduğu ve en yüksek gliserol üretimine sahip olduğu gözlenmiştir. NaCl dirençli evrilmiş S. cerevisiae suşu T8'de, yabanıl tipe göre gliserol ve etanol üretimi daha azalmıştır. Evrilmiş mutantın metabolizması gliserola doğru ve etanol üretiminden uzağa doğru yönlenmiştir. Organizmalar strese karşı korunmak için birçok fizyolojik mekanizmalar kullanılmaktadır. Bu mekanizmalardan birisi çapraz direnç mekanizmasıdır. Bu mekanizmanın amacı bir çevresel faktöre kazanılan direnç sayesinde ikincil strese karşı direnç kazanılmasıdır. fakat, her strese başka bir strese karşı çapraz direnç sağlamamaktadır. YMM ve YPD katı besiyeri ortamında, T8'in LiCl, ZnCl2, H2O2, CoCl2, KCl, etanol, CuCl2, MnCl2, CrCl3, AlCl3 için çapraz direnci incelenmiştir. T8, lityum için yüksek çapraz dirence sahiptir. T8; Co+2, Mn+2 Ni+2, Zn+2'ye az miktarda direnç gösterirken alüminyuma ise hassastır. S. cerevisiae genomu hücre lokalizasyonu, sübstrat spesifikliği ve fizyolojik fonksiyonları açısından birbirlerinden farklılaşan alkali metal katyon/H+ antiporterlarını (Nha1p, Nhx1p, Kha1p) kodlayan 3 gene sahiptir. NHX1, NHA1, ve KHA1 genleri, mutant suşu T8 ile karşılaştırılmak için sekanslanmıştır. Sekanslama sonuçları, EMS ve NaCl stresinin NHX1, NHA1 ve KHA1 gen sekanslarını etkilemediğini göstermiştir. S. cerevisiae'nın yüksek NaCl stresine olan transkripsiyonal cevabı, DNA mikroarray kullanılarak analiz edilmiştir. Mikroarray sonuçlarında, enerji, hücre kurtarma, savunma ve virülans; metabolizma; hücresel transport, transport yolları; hücresel haberleşme/sinyal iletimi mekanizması dahil olmak üzere fonksiyonel kategorileri de içeren NaCl toleransı ile bağlantılı birkaç yüz gen tespit edilmiştir. Mikroarray sonucuna göre, 548 genin ekspresyonu artmış, 22 genin ise ekspresyonu azalmıştır. Hücresel transport ve transport yollarına ait genlerden ise 98 genin ekspresyonu artmışken 32 genin ekspresyonu azalmıştır. Flokülasyon ve biyofilm için gerekli olan GPI-bağlantılı hücre yüzeyi glikoproteini (flokkulin) kodlayan FLO11 geni T8'de en fazla eksprese olan gendir. T8'in microarray sonuçlarında, HOG yolizi indüklenmemiştir. T8 yavaş glukoz alımına sahip olup, yüksek seviyelerde süksinat ve asetat biriktirmemiştir. FLO11 glukoz represyon yolizi ile de kontrol edilmektedir. Bu yolizinde, glukoz heksoz transporterları tarafından besiyerinden hücreye alınır ve hücre içinde glukoz heksokinazlar tarafından glukoz-6-fosfatta fosfatlanır. Bu fosfatlama Snf1 protein kinaz'ı ve Nrg1 inhibitör proteinini de inaktive eder. Bu inaktivasyon FLO11'in regulasyonunu baskılar. Glukoz miktarı az olduğunda Snf1 aktive olarak FLO11 eksprese olur. S.cerevisiae'nin pH değişiklilerine cevabını kontrol eden transkripsiyon faktörü Rim101p hem ENA6 hem de FLO11 ekspresyonunu kontrol etmektedir. T8'de HXT genleri, HXTK1, NRG1, FLO11 ve ENA6 ekspresyonları artmıştır. Bu iki yolizi tarafında T8'in NaCl stresine direnci kontrol edilmesi muhtemeldir. Mikroarray sonucunda T8 indüklenmiş ENA6 ekspresyonuna sahipken, NHA1 indüklenmemiştir. Real-Time PCR sonuçlarında ise ENA6 ve NHA1 genleri indüklenmiştir. Bu sonuçların mikroarray ve real-time PCR arasındaki hassasiyet farklılıklarından kaynaklanması muhtemeldir, zira real-time PCR sonraki daha hassastır. Mikroarray sonuçları T8'in pek çok geninin ortamda NaCl stresi yokken bile ekspresyonunun artmış olduğunu göstermektedir. Ekspresyonu artmış ve azalmış bu genler, T8'i yüksek sodyum ve lityum stresine adapte etmektedir. Nha1 proteini daha fazla üretilmek için klonlanmış ve komplementasyon analizi ile kontrol edilmiştir. Nha1p'nin overekspresyonu göstermiştir ki protein en iyi pH 3.5'te komplement etmektedir. Nha1'e spesifik tek bölge mutasyonları [G372S, D266H, D267A, D266H/D267A, D266N/D267N, N176, D177N], bu mutasyonların pH üzerine olan etkisini anlamak için uygulanmıştır. Bu çalışmada, gliserol üretimi artmış ve etanol üretimi azalmış S.cerevisiae suşlarının, tuz stresine direnç kazandırmaya yönelik evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edilebileceği gösterilmiştir. Bu çalışma, EMS ve artan NaCl stres düzeyleri kullanılarak S.cerevisiae seleksiyonu için evrimsel mühendisliğin uygulandığı ilk çalışmadır. Ayrıca bu tez çalışmasının sonuçları, FLO11'in S.cerevisiae'nin yüksek tuz direncinde önemli bir rolü olabileceğine işaret etmektedir.

MOLECULAR AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF A SALT-RESISTANT Saccharomyces cerevisiae MUTANT OBTAINED BY EVOLUTIONARY ENGINEERING