Genetik Mühendisliği İle Elde Edilen, Hidroksiapatite Bağlanan Peptidler İle Doku Mühendisliğine Yönelık Kontrollü Biyomineralizasyon

Abstract

Hidroksiapatit, kemik ve diş gibi memeli sert dokularının birincil mineralidir. Hidroksiapatit parçacıkları vücutta farklı boyutlarda ve şekillerde bulunabilir. Bu farklı şekil ve boyutlar dokuların özgün işlevsel özelliklerini belirler. Diş ve kemik dokularında hidroksiapatit oluşumunda ve farklı mikro ve nano mimariler oluşturmasında rol alan birçok protein bulunur. Bu proteinler hidroksiapatit oluşumunu doku gelişimi sırasında farklı yerlerde ve zamanlarda etkileyerek farklı moleküler bileşimlerde ve yapılarda hidroksiapatit oluşumunu sağlarlar. Doku gelişiminde rol alan proteinlerin sayısının çok fazla olmasından ve proteinlerin zamansal ve mekansal dağılımlarının belirlenmesindeki zorluklardan dolayı, bu çalışmada ilk önce genetik mühendisliği ile hidroksiapatite özgün olarak bağlanan peptidler seçip, daha sonra bu peptidlerin hidroksiapatit oluşumunu nasıl etkilediğini inceleme yolunu seçtik. Hidroksiapatite özgün olarak bağlanan peptidler ticari bir kütüphane olan M13 C7C kütüphanesi aracılığı ile seçildi. Peptidlerin bağlanma özellikleri flüoresan mikroskopisi ve ELISA yöntemleri ile karakterize edildi. Karakterizasyon sonucunda en kuvvetli bağlanan klon, MG-49, ve zayıf bağlanan bır klon, MG-63, seçilerek mineralizasyon çalışmaları için peptid dizileri ticari olarak sentezlendi. Mineralizasyon çalışmaları için Alkalin Fosfataz aracılıklı bir mineralizasyon sistemi kullanıldı. Mineralizasyon çalışmaları MG-49 peptidinin, hidroksiapatitin bir öncülü olan oktakalsiyum fosfat nükleasyonunu baskıladığı fakat kristallerin büyümesini tetiklediğini gösterdi. Tepkime kinetiği analizleri MG-49 peptidinin kristallerin morfolojilerinde oluşturduğu etkisini tepkime kinetiğini kontrol ederek gösterdiğini ortaya koydu. Kombinasyonel olarak seçilen hidroksiapatite bağlanan peptidler, malzemeye yüksek özgünlük, seçicilik ve bağlanma özellikleri gösterebildiklerinden yalnızca sert doku mühendisliğinde degil, biyo-bilişim, biyo-uyumlu yüzeylerin, biyo-malzemelerin oluşturulmasında ve kontrollü ilaç salınımı gibi farklı alanlarda da kullanılabilir.

Hydroxyapatite is the principal mineral of mammalian hard tissues, such as bone and teeth. Hydroxyapatite particles are found in various shapes and sizes in different tissues providing the specific functional properties of the tissues. Many proteins in bone and dental matrices are involved in the formation of the hydroxyapatite crystallites and their growth into myriad different nano and micro-architectures. These proteins affect hydroxyapatite formation at different times during the tissue generation and spatial locations in the tissue leading to the differences in the molecular composition, structure and self-assembly properties of hydroxyapatite. Because of the enormous number of large proteins involved in the tissue generation and the current problems associated with the difficulties of quantifying their spatial and temporal distribution, we launched, first, to select genetically engineered polypeptides that have specific affinity to HA, and then investigate how hydroxyapatite binding peptides affect HA formation. We have combinatorially selected hydroxyapatite binding peptides via a commercial M13 C7C library. Binding characterization of the peptides was done via fluorescence microscopy and ELISA. The strongest binding clone, MG-49 and a weak binding clone, MG-63, were selected and the peptide sequence they display was commercially synthesized to study their effects in an AP mediated in vitro mineralization system. We observed that MG-49 inhibits nucleation of octacalcium phosphate, a precursor of hydroxyapatite, while it promotes the crystal growth compared to control and weak binding peptides. Kinetic analysis showed that MG-49 peptide shows its effect on crsytal morphology by controlling the reaction kinetics. Combinatorially selected HA binding peptides may also find use in several different fields, such as bioinformatics, medical biomaterials and drug delivery applications in addition to hard tissue engineering.