Production and encapsulation of MLM-type structured lipids and application in kefir product

Abstract

Son zamanlarda, fonksiyonel özellikleri geliştirilmiş ve sağlık açısından faydalı bazı özelliklere sahip olan yapılandırılmış yağların (YY'ler) üretimi mümkün olmaktadır. Yapılandırılmış yağlar, genel olarak, yağ asidi bileşimi ve/veya gliserol moleküllerindeki poziyonel dağılımları kimyasal ve/veya enzimatik reaksiyonlar ve/veya genetik modifikasyonlar yoluyla değiştirilen triaçilgliseroller (TAG'lar) olarak tanımlanmaktadır. Günümüzdeki bilimsel gelişmeler YY'lerin tıbbi ve beslenme alanları için uygun olmasını sağlamaktadır. Ayrıca, YY'ler daha sağlıklı gıdalara karşı giderek artan ihtiyacı karşılamak ve obezite, kanser, kardiyovasküler vb.hastalıkları önlemek için de tasarlanabilmektedir. Hastaların özel sağlık ihtiyaçlarına göre tasarlanabilmesi ve hastalık önleyici ve sağlığa faydalı fonksiyonel gıda ürünleri talep eden tüketicilerin beklentilerini karşılayabilmesi açısından bir triaçilgliserol molekülünde hem orta zincirli yağ asitleri (OZYA) hem de uzun zincirli yağ asitleri (UZYA) içeren yapılandırılmış yağların (YY) enzimatik sentez ile üretimi araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Ek olarak, bu tipteki YY'lerin tümör baskılayıcı etkileri bazı çalışmalar ile kanıtlandığı için araştırmacılar için çekici bir konu haline gelmiştir. Yağlar gibi biyoaktif gıda bileşenleri, gıda işleme ve depolama koşullarına karşı hassastırlar. Ayrıca, bu süreçte biyoyararlık ve biyoerişilebilirlik değerleri azalabilir. Bu gibi sorunların üstesinden gelmek için, bu tip bileşenlerin enkapsüle edilmesi, onların işlevselliklerinin ayrıca gıda kalitesinin koruması açısından önemlidir. Yukarıda bahsedilen konuyu dikkate alarak, bu tez çalışmasında (i) trikaprilin ve Echium yağında bulunan yağ asitleri kullanarak MLM-tipteki YY'lerin üretimi (ii) üretilen YY ve Echium yağının hücre kültürü çalışmaları ile anti-tümörijenik etkilerinin değerlendirilmesi (iii) sentezlenen YY'lerin kompleks koaservasyon yöntemiyle enkapsülasyonu ve elde edilen kapsüllerin karakterize edilmesi (iv) YY'lerin kompleks koaservasyon yönetimi ile transglutaminaz enzimi kullanılarak veya kullanılmadan enkapsüle edilmesi, kapsüllerin oksidatif stabilitesinin değerlendirilmesi, enkapsüle edilen YY'lerin salım profilini değerlendirmek için in vitro gastrointestinal sindirimin gerçekleştirilmesi ve gıda uygulamasında kullanımı amaçlanmaktadır. Bu amaçları gerçekleştirmek için dört farklı deneysel çalışma (Bölüm 3-6) gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, 3. Bölümde, MLM- tipteki YY enzimatik olarak üretilmiş ve reaksiyon koşulları optimize edilmiştir. Daha sonra, 4. Bölümde, üretilen YY ve Echium yağının MCF-7 insan meme kanseri hücre hattında olası anti-tümörijenik aktivitesi araştırılmıştır. Bir sonraki adımda, YY'ler jelatin ve arap zamkının kompleks koaservasyonu ile enkapsüle edilmiştir. Ayrıca, partikül boyutu, erime davranışı ve kapsüllerin yapısal özellikleri belirlenmiştir (Bölüm 5). Son olarak, 6. Bölüm'de, enkapsüle edilen YY'lerin oksidatif stabilitesi değerlendirilmiştir. Ayrıca, kapsüller probiyotik bir kefir ürününe eklenmiş ve bu kefir ürünü ve dondurularak kurutulmuş kapsüllerin yağ salım davranışını belirlemek için in vitro sindirim modeli uygulanmıştır. Bu çalışmanın ilk basamağı (Bölüm 3), trikaprilin ve Echium yağının yağ kaynağı olarak kullandıldığı, Lipozyme® RM IM lipaz enzimlerince katalizlenen, sn-1,3 pozisyonlarında OZYA ve sn-2 pozisyonunda UZYA içeren YY'lerin üretimi amaçlamaktadır. Çalışmada, reaksiyon sıcaklığının (50-60 ºC), reaksiyon süresinin (6-12 saat) ve substrat molar oranının (3-6 mol / mol; toplam serbest yağ asitleri / trikaprilinin) SDA katılımı üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Optimum reaksiyon koşulları, beş seviyeli Merkezil Bileşik Deney Tasarım (CCC) kullanılarak tepki-yüzey yöntemi (RSM) ile belirlenmiştir. Modellerden elde edilen optimum sıcaklık, zaman ve substrat molar oranı sırasıyla 60 °C; 6 saat, 6 mol / mol'dür. Ayrıca, büyük ölçekte üretilen YY'ler sn-2 pozisyonunda %6.2 SDA içeriğine sahiptir. Çalışmada elde edilen YY'ler sn-2 pozisyonunda yaklaşık %78-79 UZYA içermektedir. Bunlara ek olarak, diferansiyel tarama kalorimetrisi kullanılarak YY'lerin erime davranışları incelenmiştir. Erime profili analizine göre, trikaprilin ve Echium yağının erime noktaları daha keskin ve daha dar olmakla birlikte, YY'nin ise daha geniş erime davranışına sahip olduğu gözlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında (Bölüm 4), sentezlenen YY'lerin (Bölüm 3) anti-tümörijenik aktivitesi ve uzun zincirli yağ asitlerinin meme kanseri üzerindeki olası etkileri insan meme kanseri hücre hattı kullanılarak değerlendirilmiştir. EPA ve DHA'nın kanser önleyici/baskılayıcı aktivitesi birçok çalışmada gösterildiği için çalışmanın bu kısmında önemlidir. Fakat, Echium yağından üretilen YY'lerin meme kanseri üzerindeki etkilerinin araştırılması gerekmektedir. Bu nedenle, hem n-3 hem de n-6 YA'ları içeren YY'nin anti-tümörijenik aktivitesi MCF-7 hücre hattı kullanılanarak araştırılmıştır. Hücreler, 24 saat boyunca 30 ve 120 μg/ml konsantrasyona sahip YY ve Echium yağı ile muamele edilmiştir. Hücre canlılık analizine göre kullanılan yağların MCF-7 kanser hücrelerinin büyümesini azalttığı gösterilmiştir. Kanserli hücrelerdeki büyüme oranının hem YY hem de Echium yağı muamelesi için neredeyse aynı olduğu söylenebilir. 30 μg/ml Echium yağı, MCF-7 hücre büyümesini yaklaşık % 17 azaltırken, aynı konsantrasyondaki YY ise hücre proliferasyonunu yaklaşık % 10 baskılamıştır. Bölüm 5'te, sn-2 pozisyonunda %78 oranında UZYA ve sn-1,3 pozisyonlarında OZYA içeren YY'ler, duvar materyali olarak jelatin ve arap zamkının kullanıldığı kompleks koaservasyon yöntemi ile enkapsüle edilmiştr. Bu çalışmanın amacı, duvar materyali konsantrasyonu (% 1-2), çekirdek:duvar oranı (1:1 ve 2:1) ve homojenizasyon hızı (7400, 10000 ve 15000 rpm) gibi deneysel parametrelerinin enkapsülasyon işlemi üzerindeki etkilerinin araştırılmasıdır.. En yüksek enkapsülasyon verimi (% 84,11 ± 0,77) % 2 jelatin (w/v), % 2 arap zamkı (w/v), 1:1 çekirdek: duvar oranı (w/w) ve 15000 rpm homojenizasyon hızına sahip deney koşullarında elde edilmiştir . Buna ek olarak, koaservatların partikül büyüklüğü 19 ile 263 nm arasında değişmektedir. Ayrıca, elde edilen numunelerin küçük polidispersite indeksi (PDI) değerlerine sahip olduğu, yani homojen bir dağılım gösterdikleri açığa çıkmıştır. Kapsüllerin morfolojik özellikleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve ısıl davranışları ise diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) ile belirlenmiştir. Çalışmanın son kısmında (Bölüm 6), jelatin ve arap zamkı kullanılarak YY'lerin enkapsüle edilmesi ve bu enkapsüle edilen YY'lerin süspansiyon veya dondurularak kurutulmuş halde kefire eklenerek fonksiyonel bir kefir ürününün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Enkapsüle edilen YY'lerin oksidatif stabiliteleri 30 günlük soğuk depolama süresince değerlendirilmiştir. Elde edilen veriler, koaservat süspansiyonlarının dondurularak kurutulmuş kapsüllere kıyasla yağ oksidasyonuna daha duyarlı olduğunu göstermiştir. Geleneksel yöntemle üretilen kefir örnekleri kompleks koaservasyon ürünleri zenginleştirilmiş ve ardından 4 °C'de 10 gün boyunca depolanmıştır. Depolama süresince numunelerin pH değerleri azalırken, titre edilebilir asitlik miktarı artış göstermiştir. Ayrıca, dondurularak kurutulmuş kapsülleri içeren takviye edilmiş kefir numunesiyle in vitro kontrollü salım çalışması gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, istatistiksel açıdan dondurularak kurutulmuş kapsüllerden yağ salınım oranı üzerinde kefirin bir matriks etkisi olmadığı tespit edilmiştir (p > 0.05). Çalışmanın son bölümünde ise (Bölüm 7), genel tartışmalar ve sonuçlar, gelecekteki beklentiler ve zorluklar belirtilmiştir.

Lately, it is possible to produce structured lipids (SLs) with improved functional properties and some health benefits. Structured lipids are generally defined as triacylglycerols (TAGs) that the fatty acid composition and/or their positional distribution in glycerol molecules have been changed via chemical and/or enzymatic reactions and/or by genetic modifications. Today's scientific improvements enable SLs to be suitable for medical and nutritional applications. Also, they can be designed to meet the growing need for healthier foods and to prevent obesity, cancer and cardiovascular disease. Enzymatic production of structured lipids (SLs) including both medium chain fatty acids (MCFAs) and long chain fatty acids (LCFAs) in one triacyglycerol molecule (MLM-type SLs) has gained attention of researchers since they can be designed for special health requirements of patients and meet the specification of consumers who desire functional food products with health-enhancing and disease-preventing properties. In addition, MLM-type SLs is also an attractive issue of the researchers since they have been shown tumor suppressing effects according to the findings of some studies. Bioactive food components such as lipids are sensitive to food processing or storage conditions, also during digestion process, their bioavailibity and bioaccessibility may be decreased. To overcome such problems, encapsulation of these compounds is important in order to protect their functionality and also food quality. Considering the above issue, the aim of this thesis is (i) to produce MLM-type SLs from tricaprylin and Echium oil fatty acids (FAs) (ii) to evaluate anti-tumorigenic effects of produced SLs and Echium oil via cell culture studies (iii) to encapsulate synthesized SLs by complex coacervation and to charactarize the capsules (iv) to encapsulate synthesized SLs by complex coacervation with/without transglutaminase, assess oxidative stability of the capsules, conduct an in vitro gastrointestinal digestion in order to evaluate release profiles of the encapsulated SLs and use them in a food application. In order to accomplish these aims, four different experimental studies (Chapters 3-6) were conducted during the thesis study. First of all, MLM-type SL were enzymatically produced and the reaction conditions were optimized in Chapter 3. Then, in Chapter 4, possible anti-tumorigenic activity of the SL and Echium oil on MCF-7 human breast cancer cell line was investigated. In the next step, SLs were encapsulated by complex coacervation of gelatin and gum arabic. Also, particle size, melting behaviour and structural characteristics of the capsules were determined (Chapter 5). Lastly, oxidative stability of the encapsulated SLs were assessed. Besides, the capsules were added into a probiotic kefir product and an in vitro digestion model was conducted to identify oil release behaviour of the fortified kefir and freeze-dired capsules in Chapter 6. In this concept, first step of this study (Chapter 3) aimed at production of MLM-type SLs consisting of MCFA (caprylic acid, C8:0) from tricaprylin at sn-1,3 positions, and long chain FAs originated from Echium oil at sn-2 position, via enzymatic acidolysis reactions with the use of commercially immobilized Lipozyme®RM IM lipase enzymes. In the study, effects of reaction temperature (50-60 ºC), reaction time (6-12 h) and substrate molar ratio (3-6 mol/mol; total free fatty acids/tricaprylin) on incorporation of SDA were investigated. Optimum reaction conditions were determined by response surface methodology (RSM) by using central composite circumscribed design (CCC) with five levels. Optimum temperature, time and substrate molar ratio obtained from the models were 60 ºC; 6 h, 6 mol/mol, respectively. Furthermore, SLs with 6.2% SDA content at sn-2 position were produced by scaling up process. SL was obtained with nearly 78-79% of long-chain fatty acids at sn-2 position. In addition, SLs were also investigated for the melting characteristics by using differential scanning calorimetry (DSC). According to melting profile analysis, the melting peaks of tricaprylin and Echium oil were sharper and narrower while the SL had more broadened peaks. In the second part of the study (Chapter 4), anti-tumorigenic activity of synthesized SLs (Chapter 3) was evaluated by human breast cancer cell lines (MCF-7) to unravel the possible effects of long chain fatty acids on breast cancer. This part of the study is important since cancer preventive/suppressive activity of EPA and DHA have been shown in numerous studies. But, effects of SLs produced from Echium oil FAs on breast cancer cells need to be investigated. For this reason, we aimed at determining the anti-tumorigenic activity of SL containing both n-3 and n-6 FAs via cell viability analysis of MCF-7 breast cancer cells. The cells were treated with SL and Echium oil at 30 and 120 µg/ml concentrations for 24 h. Cell viability test results showed that oil treatment reduce the growth of MCF-7 cancer cells. It can be said that extent of cell growth is nearly the same for both of SL and Echium oil. 30 µg/ml of Echium oil inhibits MCF-7 cell growth about 17%, on the other hand, SL at the same concentration suppressed cell proliferation about 10% at the same concentration. In Chapter 5, structured lipids containing 78% of long-chain fatty acids (FAs) at sn-2 position and medium chain FAs at sn-1,3 positions were encapsulated by complex coacervation method using gelatin and gum arabic. This study was aimed to assess the effects of different wall material concentration (1-2%), core:wall ratio (1:1 and 2:1) and homogenization rate (7400, 10000 and 15000 rpm) on encapsulation of the SL. According to the results, 84.11 ± 0.77% was found as the highest encapsulation efficiency that was obtained in gelatin 2% (w/v), gum arabic 2% (w/v), 1:1 core:wall ratio (w/w) and at 15000 rpm homogenization rate. In addition, particle size for the coacervates ranged from 19 to 263 nm. Moreover, the samples showed homogeneous size distribution pattern. Furthermore, electron microscope (SEM) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to unravel morphological characteristics and thermal behavior of the capsules, respectively. In the next part of the study (Chapter 6), the objective of the study was to encapsulate structured lipids (SLs) by complex coacervation of gelatin and gum arabic with or without using transglutaminase enzymes and to develop a functional kefir product via the addition of encapsulated SLs in the form of suspension and freeze-dried coacervates. In order to evaluate the oxidative stability of the encapsulation products, the samples were stored for 30 days. According to oxidative stability tests, coacervate solutions were found more liable to lipid oxidation compared to freeze-dried capsules. In addition, enzyme treated samples had higher oxidation levels when compared to non-enzyme treated ones. Moreover, kefir was produced via traditional methods and then fortified with complex coacervation products. During the storage of the fortified kefir product for 10 days at 4 °C, the pH value was decreased, and titratable acidity slightly increased during the storage period. Also, fortified kefir sample and the freeze-dried capsules were subjected to an in vitro controlled release study. The findings of the release study showed that kefir had no significant matrix effect on oil release from the freeze-dried capsules (p > 0.05). In the final part of the study, the general discussions and concluding remarks are given in Chapter 7 along with future prospects and challenges.